專利名稱：抗丙型肝炎病毒抗體及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及能特異性結(jié)合丙型肝炎病毒(HCV)糖蛋白E2的構(gòu)象依賴性表位的人抗體，及其各種用途。
在本說明書中引用了數(shù)篇文獻。各篇文獻在此引入以供參考(包括制造廠商說明書、指南等)；然而，并不認為所引用的任何文獻確實是本發(fā)明的現(xiàn)有技術(shù)。
背景技術(shù)：
丙型肝炎病毒(HCV)是非甲非乙型肝炎的主要病原體。已估計獻血者人群中的HCV感染流行率在0.4到2％范圍內(nèi)(Choo等，1989)。在70％以上的病人中，急性HCV感染引起慢性肝炎的產(chǎn)生，它能向肝硬化和肝細胞癌演化(Saito等，1990)。HCV是一種具有包膜的、正鏈RNA病毒，歸類于黃病毒科(Francki等，1991,Miller等，1990)。它含有約9,500nts的基因組，編碼3010到3033個氨基酸的一種多蛋白。宿主和病毒蛋白酶對該多蛋白的加工導致產(chǎn)生結(jié)構(gòu)蛋白和非結(jié)構(gòu)(NS)蛋白(Rice等，1996)。結(jié)構(gòu)蛋白包括核衣殼和兩個推定的病毒粒子包膜糖蛋白E1和E2(Miyamura等，1993)。非結(jié)構(gòu)蛋白包括NS2到NS5抗原。
在一些人中，急性感染成功的緩解，表明HCV可被宿主免疫系統(tǒng)控制。宿主克服HCV感染的機制仍然未知。以前的報道強烈提示，人和黑猩猩能產(chǎn)生病毒中和性抗體(Choo等，1994,Farci等，1994,1996,Shimizu等，1994)。在用重組E1和E2蛋白免疫接種后，已成功實現(xiàn)了體內(nèi)的保護黑猩猩防止被同源HCV分離物初次感染(Choo等，1994)。在該研究中，只有那些顯示抗E2抗體高滴度的黑猩猩受到了保護。雖然未鑒定出未識別中和抗原結(jié)構(gòu)域，但推測免疫原的構(gòu)象對中和性抗體的誘導是關(guān)鍵的。
由于到目前為止，尚無培養(yǎng)病毒和開發(fā)中和試驗的有效體外復(fù)制系統(tǒng)，因此正在積極尋找評估抗-E1/E2抗體的生物學功能的其它試驗。已在初步的研究中描述了對病毒附著于推測的易感細胞上的預(yù)防方法(Shimizu等，1994,Zibert等，1995)。更近的，已開發(fā)了一種“體外”中和結(jié)合(NOB)的試驗，其利用了高度純化的E2蛋白與易感性靶細胞的特異性結(jié)合(Rosa等，1996)。該試驗使得能定量評價能中和E2與這些細胞的結(jié)合的NOB抗體。用該系統(tǒng)，Rosa等已顯示，只有用E1和E2蛋白免疫，產(chǎn)生抗-NOB高滴度的黑猩猩才受到保護，對抗攻擊性感染(Rosa等，1996)，提示NOB活性可能是“體內(nèi)”病毒感染被中和的一種指標。在HIV感染中，一種類似的模式最近已顯示，抗體與包膜糖蛋白寡聚物結(jié)合的親和力是病毒中和的良好預(yù)告(Fouts等，1997)。另一種評估抗-E1和/或抗-E2抗體的生物學活性的方法包括，測試這些抗體識別據(jù)信存在于病毒顆粒表面的天然結(jié)構(gòu)的能力。體外研究已顯示，E1和E2相互反應(yīng)，形成非共價連接的復(fù)合物(Deleersnyder等，1997,Ralston等，1993)。已提出這些復(fù)合物代表HCV病毒顆粒的功能性亞基(Deleersnyder等，1997,Dubuisson等，1994,Dubuisson和Rice,1996,Ralston等，1993)。對病毒感染中B細胞所有組成成分的探測，對于理解與這些感染有關(guān)的病理是關(guān)鍵的。人單克隆抗體提供了另一種方法。對于HCV，僅報道了對有限數(shù)目的病毒抗原的這類抗體的分離和特性分析。這些包括核衣殼、NS3和NS4蛋白質(zhì)(Akatsuka等，1993,Cerino等，1991,1993,Chan等，1996,Mondelli等，1994)和最近的是糖蛋白E2(Chan等，1996)。對于后一種情況，作者使用了噬菌體展示技術(shù)，與合成肽的使用結(jié)合，來篩選抗-E2免疫反應(yīng)性，并能獲得特異性IgG單鏈Fvs，其識別E2序列。雖然鑒定到了一種特異性線性表位序列，但未描述過該抗-E2抗體的生物學活性，并且該抗體在控制感染進程中的推定作用仍然未限定。最近，WO97/40176描述了從一組合文庫中獲得的免疫球蛋白分子，其能特異性與HCV E2抗原結(jié)合。雖然顯示這些免疫球蛋白的Fab片段在中和結(jié)合試驗中具有結(jié)合活性，但發(fā)現(xiàn)重組表達的Fab克隆和對應(yīng)的完整IgG分子在中和HCV E2多肽的結(jié)合中是無效的。
發(fā)明簡述本發(fā)明涉及新穎抗體，其包括人抗體可變區(qū)的至少一個互補決定區(qū)(CDR)，能特異性識別HCV糖蛋白E2的構(gòu)象依賴性表位。另外，本發(fā)明涉及被所述抗體識別的抗原。此外，本發(fā)明涉及編碼上述抗體或抗原的多核苷酸、含有所述多核苷酸的載體，以及含有上述多核苷酸或載體的細胞。本發(fā)明的另一個方面是一種制備能識別HCV糖蛋白E2構(gòu)象依賴性表位，并能中和E2蛋白與易感性細胞結(jié)合的抗體的方法。本發(fā)明還涉及含有上述抗體、抗原、多核苷酸、載體或細胞的藥物和診斷組合物，以及上述化合物在各種治療和診斷應(yīng)用中的用途。
發(fā)明詳述因此，本發(fā)明的技術(shù)問題是提供治療和預(yù)防人HCV感染的工具和方法。
該技術(shù)問題的解決是通過提供權(quán)利要求中確定特征的實施例而實現(xiàn)，即提供以下抗體，其1)能識別構(gòu)象依賴性決定簇，2)能識別衍生自不同HCV基因型的抗原，和3)能沉淀據(jù)信存在于病毒顆粒表面上的非共價結(jié)合的E1E2復(fù)合物；和4)能中和E2蛋白與易感性細胞的結(jié)合，這提示該抗體體內(nèi)中和的能力。這些抗體對發(fā)展戰(zhàn)勝高度易變因子(如HCV)感染的治療性或預(yù)防性策略特別有用。
因此，本發(fā)明涉及一種抗體，其包含至少一個(優(yōu)選兩個，更優(yōu)選三個、四個或五個，和最優(yōu)選六個)人抗體VH和/或VL區(qū)的互補決定區(qū)(CDR)，所述VH和/或VL區(qū)包含圖5(VL)(SEQ ID NO:1)和圖6(VH)(SEQ ID NO:3)描述的DNA序列編碼的氨基酸序列，其特異性識別丙型肝炎病毒糖蛋白E2的構(gòu)象依賴性表位，并能沉淀共價或非共價結(jié)合的E2/E1復(fù)合物。另外，和/或本發(fā)明的抗體還包含人免疫球蛋白鏈VL區(qū)的至少1,2或3個CDR，包含SEQ ID:6的氨基酸序列，并由SEQ ID NO:5(代表編碼SEQ ID NO:1(圖5)的VL等位變體)描述的DNA序列編碼。
本領(lǐng)域技術(shù)人員知道，抗體的各可變區(qū)(重鏈VH和輕鏈VL)包含三個高變區(qū)，有時稱為互補決定區(qū)或“CDR”，側(cè)接4個相對保守的構(gòu)架區(qū)，或“FR”。可測定本發(fā)明抗體可變區(qū)中包含的CDR，如根據(jù)Kabat，免疫學感興趣的蛋白質(zhì)序列(U.S.Department of Health and Human Services,3rdedition,1983,4thedition,1987,5thedition 1990)。本領(lǐng)域技術(shù)人員可輕易理解，可使用具有上述可變區(qū)的抗體可變區(qū)，來構(gòu)建其它具有所需特異性和生物功能的多肽或抗體。因此，本發(fā)明還包括含有至少一個上述可變區(qū)的CDR，并有利的，具有與本文所附實施例中描述的抗體結(jié)合性能基本相同或相似的多肽和抗體。本領(lǐng)域技術(shù)人員將易于理解，使用上述可變區(qū)或CDR，可根據(jù)本領(lǐng)域已知方法，如EP-A1 0 451 216和EP-A1 0549 581中所述的方法構(gòu)建上述抗體。
術(shù)語“丙型肝炎病毒糖蛋白E2的構(gòu)象依賴性表位”指被本發(fā)明的抗體識別的表位的非線性性質(zhì)。這意味著該表位的抗原決定簇是由HCV糖蛋白E2的三維結(jié)構(gòu)提供的，而不是由其氨基酸序列提供的。
術(shù)語“能沉淀共價或非共價結(jié)合的E2/E1復(fù)合物”指本發(fā)明的抗體沉淀E1和E2非共價結(jié)合復(fù)合物的能力，據(jù)信該復(fù)合物存在于病毒顆粒上。
術(shù)語“能中和E2蛋白和易感性細胞的結(jié)合”描述了候選抗體中和高度純化的E2與對HCV感染易感性細胞結(jié)合(結(jié)合的中和或NOB)的能力；也見實施例4。有利的，本發(fā)明的抗體在濃度為約每毫升1微克，優(yōu)選濃度為每毫升0.1微克，和最優(yōu)選的濃度為每毫升約0.03微克時具有NOB活性。
根據(jù)本發(fā)明，選擇一種不需要抗原純化，特異性檢測能識別直接在細胞中表達的E2的抗-E2抗體的篩選試驗，來鑒定和純化針對構(gòu)象決定性決定簇的抗體。該試驗還能根據(jù)基因型1a衍生抗原的表達，從而確定交叉反應(yīng)性抗-E2抗體和表位的特征。用該方法，已從兩個HCV慢性感染病人獲得了兩種產(chǎn)生抗-E2抗體的克隆。第一個克隆(克隆503)獲自被基因型4分離物感染的病人(病人1)，而第二個克隆(克隆108)衍生自被基因型1b分離物感染的病人(病人2)。另外顯示對基因型1b抗原有良好反應(yīng)性的HMab表明，在全世界發(fā)現(xiàn)的至少兩種主要流行性病毒亞型(亞型1a和1b)中，這些抗體靶向的決定簇是保守的。根據(jù)上文，可合理的預(yù)計，本發(fā)明的抗體也能與其它基因型，如2,3a,4,5和/或6的抗原反應(yīng)。與這些基因型有關(guān)的本發(fā)明抗體的結(jié)合活性可易于根據(jù)實施例中敘述的方法來測試。
本發(fā)明獲得的結(jié)果表明，本發(fā)明HMab識別的決定簇位于E2的構(gòu)象依賴性區(qū)域，因為各種使用表達的截短的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域的篩選方法(包括肽掃描、蛋白質(zhì)印跡和免疫熒光分析)不能用來鑒定線性決定簇；見實施例2。另一方面，在還原條件或非還原條件下進行的免疫沉淀研究表明，HMab識別一種構(gòu)象依賴性決定簇。在非還原條件下，這些抗體沉淀共價和非共價結(jié)合的E1E2復(fù)合物；見實施例3.2。相信后者是摻入病毒顆粒中的功能性亞基(Deleersnyder等，1997)。具體從表位形成的動力學分析獲得的現(xiàn)存數(shù)據(jù)強烈表明，這兩個HMab識別E2蛋白質(zhì)看來早折疊的區(qū)域。這些區(qū)域隨該在蛋白質(zhì)的進一步成熟將維持可及，直到它采取了其最終構(gòu)象特征(存在于病毒顆粒表面的易感性E2形式)。動力學分析和NOB數(shù)據(jù)(即抗體503，顯示NOB活性)還提示這兩個抗體識別不同決定簇；見實施例4。另外，抗體對E2蛋白質(zhì)的親和力也不同。
本發(fā)明獲得的最鼓舞人心的結(jié)果是，證明了HMab之一顯示強HOB活性。這些觀察，結(jié)合Rosa等(Rosa等，1996)的觀察，表明NOM抗體識別的決定簇可能是E2的構(gòu)象依賴性區(qū)域，看來是在不同基因型之間保守的功能域。這些區(qū)域似乎與已顯示含有中和表位的高變區(qū)1(HVR)不同。在最近研究中，Zibert等(Zibert等，1997)已能使針對HVR中發(fā)現(xiàn)的非構(gòu)象性結(jié)構(gòu)的抗體早期出現(xiàn)與急性自身限制性感染關(guān)聯(lián)起來。該研究結(jié)果提示，針對E2線性決定簇的抗體在HCV感染控制中的關(guān)鍵性存在和作用，該觀察與最初在黑猩猩模式中Farci等(Farci等，1996)進行的研究結(jié)果一致。在后來一研究中，作者誘導出了針對HVR中肽的超免疫血清，血清含有能體外中和明確特性的接種物感染力的抗體。Shimizu等也進行了相似的實驗(Shimizu等，1996)。因此，所有這些研究強烈提出，HCV的中和大部分是類特異性的，涉及可變的非保守表位的參與。不過，最近的觀察已開始提出存在其它中和決定簇，具有交叉反應(yīng)性，并不針對HVR。在Choo等的疫苗研究中，誘導的中和抗體不針對E2的HVR，而明顯針對該抗原攜帶的其它決定簇(Choo等，1994)。Abrignani最近已觀察到，在慢性感染的自發(fā)緩解和抗-NOB抗體高滴度之間的關(guān)系(Abrignani,1997)。在本文下文實施例所述的病人中，對E2結(jié)合的高的或可測量的中和能力并不限于被基因型1a分離物感染的病人血清，從而提示交叉反應(yīng)性表位(如本申請中所述的那些)的存在。由于在純化的Mab的NOB滴度和病人(我們的研究中的病人都具有相似的大于1∶1000的NOB血清滴度)血清中發(fā)現(xiàn)的滴度之間，尋找直接關(guān)系困難，但因此令人驚訝的是，抗體503在極低濃度下(0.03微克/毫升)可檢測的，提供強大活性的NOB活性；見實施例4。
預(yù)期本發(fā)明產(chǎn)生的HMAb生物合成，HCV糖蛋白的生物合成，折疊和裝配，以及對病毒顆粒結(jié)構(gòu)和推定的細胞表面受體進行特性分析的有用工具。由于以Ab 503作示范的本發(fā)明的抗體代表迄今描述的第一種具有NOB活性的HMAb，該抗體對被動免疫研究特別有用。對于慢病毒而言，抗體灌注研究已證明，施用中和性抗體在不同動物模型中控制和預(yù)防感染的有益作用(Conley等，1996,Emini等，1992,Putkonen等，1991)。
在本發(fā)明的優(yōu)選例中，所述抗體是單克隆抗體、多克隆抗體、單鏈抗體、人源化抗體、或其片段，它們能特異性結(jié)合所述的HCV E2糖蛋白，還包括雙特異性抗體、合成抗體、抗體片段，如Fab、Fv或scFv片段等，或這些抗體任何一種的化學修飾衍生物?？赏ㄟ^Khler和Milstein，自然256(1975),495，和Galfré,酶學方法73(1981),3，首先描述的技術(shù)(其包含將小鼠骨髓瘤細胞和衍生自接種過的哺乳動物的脾細胞融合)，以及本領(lǐng)域所發(fā)展的改良)來制備單克隆抗體。另外，可用Harlow和Lane“抗體，實驗手冊”，CSH Press,Cold Spring Harbor,1988描述的方法，獲得針對上述表位的抗體及其片段。當用噬菌體展示技術(shù)獲得所述抗體的衍生物時，可用如BIAcore系統(tǒng)中使用的表面細胞質(zhì)基因組共振，來提高能與構(gòu)象依賴性HCV糖蛋白E2表位的某表位結(jié)合的噬菌體抗體的效力(Schier，人抗體雜交瘤7(1996),97-105；Malmborg，免疫學方法雜志，183(1995),7-13)。在例如WO89/09622中描述了嵌合抗體的產(chǎn)生。在EP-A1 0 239400和WO90/07861中描述了產(chǎn)生人源化抗體的方法。本發(fā)明所用的另一個抗體來源是所謂的異種抗體。在WO91/10741,WO94/02602,WO96/34096和WO96/33735中描述了產(chǎn)生異種抗體，如在小鼠中產(chǎn)生人抗體的一般原理。如上所述，本發(fā)明的抗體可以以完整抗體之外的各種形式存在；包括例如Fv、Fab和F(ab)2，以及單鏈；見例如WO88/09344。對于雙特異性抗體，其中一種特異性針對HCV E2糖蛋白表位，而另一種優(yōu)選針對T細胞抗原(如CD3)，為了捕捉病毒或受HCV感染并能被高效摧毀的靶細胞，識別病毒表位的結(jié)合位點具有高親和力是有利的。另一方面，識別T細胞的結(jié)合位點的親和力必須是天然T細胞受體/配體相互作用，或T細胞共刺激分子與其受體相互作用中發(fā)現(xiàn)的親和力的數(shù)量級。
可單用或聯(lián)用本領(lǐng)域已知的常規(guī)技術(shù)，使用例如氨基酸缺失、插入、取代、加成、和/或重組，和/或任何本領(lǐng)域已知的其它修飾方法，來進一步修飾本發(fā)明的抗體或其對應(yīng)的免疫球蛋白鏈。在作為免疫球蛋白的氨基酸序列基礎(chǔ)的DNA序列中引入這種修飾的方法對本領(lǐng)域技術(shù)人員是熟知的；見例如，Sambrook，分子克隆實驗手冊，Cold Spring Harbor Laboratory(1989)N.Y.。
在一具體優(yōu)選例中，本發(fā)明的抗體分別包含圖5和6中描述的VH和/或VL區(qū)的氨基酸序列。
在另一個優(yōu)選例中，本發(fā)明涉及一種抗原或其表位，其被本發(fā)明的抗體識別。所述抗原或表位可以是糖基化的、未糖基化的或部分去糖基化的。如本文所討論的，和實施例中解釋的，本發(fā)明的特征是由上述抗體識別的新穎抗原。為了鑒定和分離本發(fā)明的抗原和表位，可通過將各種cDNA注入卵母細胞，經(jīng)充分時間來表達cDNA基因產(chǎn)物，并用本發(fā)明的抗體測試所要的cDNA表達產(chǎn)物的存在，來篩選cDNA文庫。
另外，可用本發(fā)明的抗體，對大腸桿菌中的cDNA表達文庫間接篩選具有至少一個本發(fā)明的表位的肽(Chang和Gottlieb，神經(jīng)科學雜志，8:2123,1988)。在揭示了這些抗原的結(jié)構(gòu)后，可合理設(shè)計結(jié)合合伴和/或區(qū)域。例如，可用合適的計算機程序，來進行結(jié)構(gòu)基序的折疊模擬和計算機重設(shè)計(Olszewski，蛋白質(zhì)25(1996),286-299；Hoffman，計算機應(yīng)用生物科學11(1995),675-679)。另外，可用計算機來對詳細的蛋白質(zhì)模型進行構(gòu)象和能量分析(Monge，分子生物學雜志，247(1995),995-1002；Renouf，高等實驗醫(yī)學生物學(1995),37-45)。
在本發(fā)明的另一個實施例中，涉及編碼本發(fā)明上述任何抗體免疫球蛋白鏈的至少一個可變區(qū)的多核苷酸。免疫球蛋白的一種形式構(gòu)成抗體的基本結(jié)構(gòu)單元。該形式是四聚體，由兩對相同的免疫球蛋白鏈構(gòu)成，每對具有一條輕鏈和一條重鏈。在各對中，輕鏈和重鏈可變區(qū)或功能域都負責結(jié)合抗原，而恒定區(qū)負責抗體的效應(yīng)器功能。除了抗體，免疫球蛋白還存在各種其它形式(包括比全長短，但保留所要的活性的形式)，包括Fv,Fab，和F(ab’)2，以及單鏈抗體(如Huston,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,85(1988),5879-5883和Bird，科學242(1988),423-426)；也見上。免疫球蛋白輕鏈或重鏈可變區(qū)由三個高變區(qū)(也稱為CDR)間的“構(gòu)架”區(qū)構(gòu)成；見上。
還可通過單獨或聯(lián)合表達編碼本發(fā)明的抗體免疫球蛋白的重鏈或輕鏈的重組DNA節(jié)段產(chǎn)生本發(fā)明的抗體。
本發(fā)明編碼上述抗體的多核苷酸可以是例如DNA、cDNA、RNA或合成產(chǎn)生的DNA或RNA或重組產(chǎn)生的嵌合核酸分子，包含任何單獨或聯(lián)合的那些多核苷酸。所述多核苷酸優(yōu)選是載體的一部分。這些載體還可包含其它基因，如標記基因，其使所述載體能在合適的宿主細胞中，和合適的條件下被選擇。優(yōu)選的，本發(fā)明的多核苷酸可和能使基因在原核或真核細胞中表達的表達控制序列操作性連接。所述多核苷酸的表達包括多核苷酸轉(zhuǎn)錄成可翻譯的mRNA。本領(lǐng)域技術(shù)人員對確保在真核細胞，優(yōu)選哺乳動物細胞中表達的調(diào)控元件是熟知的。它們通常包括確保轉(zhuǎn)錄起始的調(diào)控序列，和可任選的確保轉(zhuǎn)錄終止和轉(zhuǎn)錄穩(wěn)定的聚腺苷酸化信號。其它調(diào)控元件可包括轉(zhuǎn)錄和翻譯增強子，和/或天然結(jié)合的或異源啟動子區(qū)域。就此而言，本領(lǐng)域技術(shù)人員易于理解，編碼至少一條輕鏈和/或重鏈可變區(qū)的多核苷酸可編碼兩條免疫球蛋白鏈或僅一條鏈的可變區(qū)。類似的，所述多核苷酸可受同一啟動子的控制，或可分別受控制進行表達。允許在原核宿主細胞中表達的可能調(diào)控元件包括例如大腸桿菌的PL、lac、trp或tac啟動子，而允許在真核宿主細胞中表達的調(diào)控元件例子是酵母的AOX1或GAL1啟動子，或CMV-、SV40-、RSV-啟動子(Rous肉瘤病毒)，CMV-增強子，SV40-增強子或哺乳動物和其它動物細胞中的珠蛋白內(nèi)含子。除了負責轉(zhuǎn)錄起始的元件以外，這些調(diào)控元件還可包含在多核苷酸下游的轉(zhuǎn)錄終止信號，如SV40-聚腺苷酸位點或tk-聚腺苷酸位點。另外，根據(jù)所用的表達系統(tǒng)，可將能將多核苷酸指向細胞區(qū)室，或?qū)⑵浞置谌虢橘|(zhì)的前導序列加到本發(fā)明多核苷酸的編碼序列上，這是本領(lǐng)域熟知的。前導序列在適當?shù)臅r象與翻譯、起始和終止序列裝配在一起，而且優(yōu)選能指導翻譯的蛋白質(zhì)或其部分分泌入(周質(zhì))空間或胞外介質(zhì)的前導序列?？扇芜x的，異源序列能編碼一種融合蛋白，該蛋白包括能賦予所需特征，如穩(wěn)定性或簡化表達的重組產(chǎn)物純化過程的C-和N-末端識別肽。就此而言，合適的表達載體是本領(lǐng)域已知的，例如Okayama-Berg cDNA表達載體pcDV1(Pharmacia),pCDM8,pRc/CMV,pcDNA1,pcDNA3(In-vitrogene)，或pSPORT1(GIBCO BRL)。
優(yōu)選表達控制序列將是在載體中能轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染真核宿主細胞的真核啟動子系統(tǒng)，但也可使用原核宿主的控制序列。一旦載體被摻入合適宿主，將宿主維持在適合高水平表達核苷酸序列的條件下，而且如需要，可收集和純化免疫球蛋白輕鏈、重鏈、輕/重鏈二聚物或完整抗體，結(jié)合性片段或其它免疫球蛋白形式；見Beychok，免疫球蛋白合成的細胞，Academic Press,N.Y.(1979)；還可見例如附加實施例。
如上所述，可單獨或作為載體的一部分使用本發(fā)明的多核苷酸，來在細胞中表達本發(fā)明的多肽，用于與HCV感染有關(guān)疾病的基因治療或診斷。將本發(fā)明的多核苷酸或載體引入細胞，進而產(chǎn)生抗體。根據(jù)采用體外或體內(nèi)技術(shù)，將治療性基因引入細胞的基因治療是最重要的基因轉(zhuǎn)移的應(yīng)用之一。在文獻中描述了體外或體內(nèi)基因治療的合適方法和載體，它們對本領(lǐng)域技術(shù)人員人員是已知的；見例如Giordano，天然藥物2(1996),534-539；Schaper,Circ.Res.79(1996),911-919；Anderson，科學256(1992),808-813；Isner,Lancet 348(1996),370-374；Muhlhauser,Circ.Res.77(1995),1077-1086；Wang，天然藥物2(1996),714-716；WO94/29469；WO97/00957或Schaper，生物技術(shù)的當前觀點7(1996),635-640，和其中引用的文獻?？稍O(shè)計本發(fā)明的多核苷酸和載體，用于直接引入或通過脂質(zhì)體或細菌載體(如腺病毒、反轉(zhuǎn)錄病毒)引入細胞。優(yōu)選所述細胞是種系細胞，胚胎細胞，或卵細胞或其衍生物，最優(yōu)選的所述細胞是種系細胞。
另外，本發(fā)明涉及載體，特別是在基因工程中常規(guī)使用的質(zhì)粒、粘粒、病毒和噬菌體，其包含編碼本發(fā)明抗體免疫球蛋白鏈的可變區(qū)的多核苷酸；可任選的聯(lián)合編碼本發(fā)明抗體的其它免疫球蛋白鏈可變區(qū)的，本發(fā)明的多核苷酸。優(yōu)選所述載體是表達載體和/或基因轉(zhuǎn)移或靶向載體。可使用衍生自反轉(zhuǎn)錄病毒、痘苗病毒、腺伴隨病毒、皰疹病毒、或牛乳頭瘤病毒的表達載體，來將本發(fā)明的多核苷酸或載體傳遞入靶細胞群?？墒褂帽绢I(lǐng)域技術(shù)人員熟知的方法，來構(gòu)建重組病毒載體；見例如，Sambrook，分子克隆實驗手冊，Cold Spring HarborLaboratory(1989)N.Y.和Ausubel，分子生物學現(xiàn)有方案，Green PublishingAssociates and Wiley Interscience,N.Y.(1989)描述的技術(shù)。另外，可將本發(fā)明的多核苷酸和載體重新構(gòu)建入脂質(zhì)體來傳遞給靶細胞?？蓪⒑斜景l(fā)明的多核苷酸的載體(如免疫球蛋白重鏈和/或輕鏈可變區(qū)編碼序列和表達控制序列)用熟知的方法(其根據(jù)細胞宿主的類型而不同)轉(zhuǎn)移入宿主細胞。例如，對于原核細胞常用氯化鈣轉(zhuǎn)染，而對于其它細胞宿主可用磷酸鈣處理或電穿孔；見Sambrook，上文。
本發(fā)明還涉及用本發(fā)明的多核苷酸或載體轉(zhuǎn)化的宿主細胞。所述宿主細胞可以是原核或真核細胞。存在于宿主細胞中的多核苷酸或載體存在于宿主細胞中，可以整合入宿主細胞的基因組或可維持在染色體外。
宿主細胞可以是任何原核或真核細胞，如細菌，昆蟲，真菌，植物，動物或人細胞。優(yōu)選真菌細胞是例如酵母屬，特別是釀酒酵母種的細胞。術(shù)語“原核”指能用DNA或RNA轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染，來表達本發(fā)明抗體或?qū)?yīng)的免疫球蛋白鏈的細菌。真核宿主可包括革蘭氏陰性和革蘭氏陽性細菌，例如大腸桿菌、鼠傷寒桿菌、粘質(zhì)沙雷氏菌(Serratia marcescens)和枯草芽胞桿菌。術(shù)語“真核”指包括酵母、高等植物、昆蟲和優(yōu)選哺乳動物的細胞。根據(jù)在重組產(chǎn)生程序中使用的宿主，本發(fā)明的多核苷酸編碼的抗體或免疫球蛋白鏈可以是糖基化或非糖基化的。本發(fā)明的抗體或?qū)?yīng)的免疫球蛋白鏈還可包括起始甲硫氨酸殘基?？捎帽景l(fā)明的多核苷酸，使用任何本領(lǐng)域技術(shù)人員通常已知的技術(shù)來轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染宿主。另外，制備融合的可操作性連接的基因和在哺乳動物細胞和細菌等中表達它們的方法是本領(lǐng)域熟知的(Sambrook，分子克隆實驗手冊，Cold Spring HarborLaboratory(1989)N.Y.)?？衫帽疚乃龅幕驑?gòu)建物和方法，來在真核或原核宿主中表達本發(fā)明的抗體和對應(yīng)的免疫球蛋白鏈。一般與宿主聯(lián)系，使用含有啟動子序列，促使插入的多核苷酸有效轉(zhuǎn)錄的表達載體。表達載體通常含有復(fù)制起始點，啟動子和終止子，以及能提供轉(zhuǎn)化細胞的表型選擇的特異性基因。另外，可用含有本發(fā)明細胞的轉(zhuǎn)基因動物，優(yōu)選哺乳動物來大量產(chǎn)生本發(fā)明的(多)肽。
因此，在另一個實施例中，本發(fā)明涉及產(chǎn)生能識別丙型肝炎病毒糖蛋白E2的構(gòu)象依賴性表位的抗體，或其功能性片段或免疫球蛋白鏈的方法，該方法包括(a)培養(yǎng)本發(fā)明的細胞；和(b)從培養(yǎng)物中分離所述抗體或其功能性片段或免疫球蛋白鏈。
轉(zhuǎn)化的宿主可在發(fā)酵罐中生長，并根據(jù)本領(lǐng)域已知的技術(shù)培養(yǎng)，以實現(xiàn)最佳細胞生長。一旦表達，可根據(jù)本領(lǐng)域的標準程序，包括硫酸銨沉淀，親和柱，柱層析，凝膠電泳等純化本發(fā)明的完整抗體、其二聚物、獨立的輕鏈和重鏈，或其它免疫球蛋白形式；見Scopes“蛋白質(zhì)純化”，Springer-Verlag,N.Y.(1982)。然后，可從生長培養(yǎng)基、細胞裂解液、或細胞膜組分中分離出本發(fā)明的抗體或其對應(yīng)的免疫球蛋白鏈?？赏ㄟ^任何常規(guī)方法，如與針對本發(fā)明抗體恒定區(qū)的單克隆和多克隆抗體的使用有關(guān)的，制備性層析分離和免疫學分離來分離和純化微生物表達的抗體或免疫球蛋白鏈。對本領(lǐng)域技術(shù)人員清楚的是，本發(fā)明的抗體可進一步與其它分子偶聯(lián)，用于藥物靶向和顯影應(yīng)用?？稍诳贵w或抗原表達后，用化學方法將其交聯(lián)到結(jié)合位點，或可將偶聯(lián)產(chǎn)物經(jīng)基因工程在DNA水平改造入本發(fā)明的抗體或抗原。然后在合適的宿主細胞中表達該DNA，如需要，收集表達的蛋白質(zhì)并復(fù)性。
對于藥物學使用，優(yōu)選至少約90到95％均一性的基本純化的免疫球蛋白，最優(yōu)選是98到99％或以上的均一性。一旦部分純化(或按所需純化至均一)可用該抗體治療(包括體外)或用于開發(fā)和進行試驗程序。
本發(fā)明還涉及產(chǎn)生能表達本發(fā)明的抗體或其對應(yīng)的免疫球蛋白鏈的細胞的方法，包括用本發(fā)明的多核苷酸或載體基因工程改造細胞?？墒褂帽景l(fā)明方法獲得的細胞，來測試本發(fā)明抗體與其抗原的相互作用。
另外，本發(fā)明涉及由本發(fā)明的多核苷酸編碼，或可由上述方法獲得的，或從上述方法產(chǎn)生的細胞獲得的本發(fā)明抗體或其片段。本發(fā)明的抗體通常在對單克隆抗體治療敏感的疾病的基本治療中是有用的。特別是，可使用免疫球蛋白通過補體介導的裂解等，被動免疫或除去HCV或其它不需要的細胞或抗原，均不會發(fā)生與許多前抗體有關(guān)的大的免疫反應(yīng)(如過敏性休克)。對于本發(fā)明的抗體，適于治療的典型疾病狀態(tài)包括慢性HCV感染。
本發(fā)明的抗體、抗原和表位可治療性用于患HCV感染的病人?？赏ㄟ^施用本發(fā)明的抗體、抗原和表位來完成這種治療。這種施藥可利用未標記的和標記的抗體或抗原。例如，當使用未標記的抗原或表位有利時，其形式例如，抗原可以是小到以至于不能刺激免疫應(yīng)答，但足夠大，能結(jié)合或封閉HCV通過E2糖蛋白?？吭诎屑毎系钠?。
另外，可施用標記了治療劑的本發(fā)明的抗體、抗原和表位。這些藥劑可直接或間接的與本發(fā)明抗體或抗原偶聯(lián)。間接偶聯(lián)的一個例子可使用間隔分子。另外，本發(fā)明的抗體還可包含一個區(qū)域，所述區(qū)域用共價或非共價鍵聯(lián)接。聯(lián)接可根據(jù)本領(lǐng)域已知的和上述的方法作基因融合，或如WO94/04686所述作化學交聯(lián)。融合蛋白中存在的，包含本發(fā)明抗體的其它功能域可優(yōu)選通過可彎曲接頭連接，有利的是多肽接頭連接，其中所述多肽接頭包含多個親水性肽鍵氨基酸，具有足夠跨越所述功能域的C-末端和本發(fā)明抗體的N-末端距離(反之亦然)的長度。上述融合蛋白還可包含可切割接頭或蛋白酶的切割位點。這些間隔分子可以是不溶性的或是可溶性的(Diener等，科學231:148,1986)，而且可被選來使藥物在靶位點從抗原上釋放。能與本發(fā)明的抗體、抗原和表位偶聯(lián)，用于免疫治療的治療劑例子是藥物、放射性同位素、凝集素和毒素?？膳c本發(fā)明抗體、抗原和表位交聯(lián)的藥物包括以下化合物經(jīng)典的藥物，如絲裂霉素C、道諾紅霉素和長春花堿等化合物。在使用放射性同位素偶聯(lián)的本發(fā)明的抗體、抗原或表位作免疫治療中，某些同位素可能比其它的更優(yōu)選，這取決于白細胞分布和穩(wěn)定性以及發(fā)射等因素。由自身免疫應(yīng)答決定，某些發(fā)射物可能比其它的更優(yōu)選。一般在免疫治療中，發(fā)射α和β粒子的放射性同位素是優(yōu)選的。優(yōu)選短射程、高能α發(fā)射物，如212Bi。可與本發(fā)明的抗體、抗原或表位結(jié)合，用于治療目的的放射性同位素的例子是125I、131I、90Y、67Cu、212Bi、212At、211Pb、47Sc、109pd和188Re。其它可與本發(fā)明的抗體、抗原或表位偶聯(lián)的治療劑，以及體外和體內(nèi)治療方案是已知的，或易于由本領(lǐng)域技術(shù)人員確定。在任何合適的情況下，本領(lǐng)域技術(shù)人員可使用本發(fā)明編碼任何上述抗體、抗原或表位或的多核苷酸，或?qū)?yīng)的載體，來代替蛋白質(zhì)材料本身。
另外，本發(fā)明涉及藥物組合物，包含上述本發(fā)明的抗體、抗原或表位、多核苷酸、載體或細胞。本發(fā)明的藥物組合物還可包含藥物學上可接受的運載體。合適的藥物學上可接受的運載體的例子是本領(lǐng)域熟知的，包括磷酸緩沖鹽溶液、水、油/水乳劑等乳劑、各種濕潤劑、無菌溶液等?？捎檬熘某Ｒ?guī)方法配制含有這些運載體的組合物。可以合適的劑量將這些藥物組合物施給人。可經(jīng)不同途徑施用合適的組合物，如靜脈內(nèi)、腹腔內(nèi)、皮下、肌肉內(nèi)、外用或透皮施用。由參與的生理和臨床因素確定劑量療法。如醫(yī)學領(lǐng)域熟知的，任一病人的劑量取決于許多因素，包括病人的大小、體表面積、年齡、要施用的具體化合物、性別、施藥的時間和途徑、健康狀況、和其它同時施用的藥物。典型的劑量可以是，如0.001到1000微克范圍內(nèi)(或該范圍內(nèi)用于表達或抑制表達的核酸)；然而，低于或高于該示范性范圍的劑量也是可預(yù)料的，尤其要考慮上述因素時。一般，有規(guī)律的施用該藥物組合物的療法應(yīng)在每天1微克到10毫克單位范圍內(nèi)。如果該療法是連續(xù)輸液，它還應(yīng)在每千克體重每分鐘1微克到10毫克范圍內(nèi)?？捎弥芷谛栽u估來監(jiān)控進程。劑量不同，但靜脈內(nèi)施用DNA的優(yōu)選劑量是從大約106到1012個DNA分子拷貝。本發(fā)明的組合物可局部或全身施用。施用一般是胃腸外的，如靜脈內(nèi)；DNA還可直接施用到靶位點，如通過生物彈射法(biolistic)傳遞到內(nèi)部或外部的靶位點，或通過導管傳遞到動脈內(nèi)的位點。胃腸外施藥的制備物包括無菌水溶液或非水溶液、懸液和乳劑。非水溶劑的例子是丙三醇、聚乙二醇、橄欖油等植物油、和油酸乙酯等可注射有機酯。水相載體包括水、乙醇/水溶液、乳劑或懸液，包括鹽和緩沖介質(zhì)。胃腸外載體包括氯化鈉溶液、Ringer’s葡萄糖、葡萄糖和氯化鈉、乳化Ringer’s，或不揮發(fā)油。靜脈內(nèi)載體包括液體和營養(yǎng)補液，電解補液(如基于Ringer’s葡萄糖的那些)等。防腐劑和其它添加劑也可存在，如抗菌劑、抗氧化劑、螯合劑、和惰性氣體等。另外，本發(fā)明的藥物組合物可以包括其它試劑，如白介素或干擾素，視藥物組合物的用途而定。例如，如上所述本發(fā)明的藥物組合物可與其它抗病毒劑聯(lián)用。這些藥劑包括(不于)干擾素，其它抗HCV單克隆或多克隆抗體、核苷類似物，DNA聚合酶抑制劑，和如實施例6中所述的藥劑。就這種聯(lián)合治療而言，可同時施用抗體和抗病毒劑或順序在用抗病毒劑治療之前或之后施用抗體。還可用這種藥物組合物來免疫肝臟移植病人，以消除這些病人復(fù)發(fā)HCV感染的可能性。另外，還可將藥物組合物配制成疫苗，例如，如果本發(fā)明的藥物組合物包含如上所述，能誘導針對HCV的有效免疫應(yīng)答的抗原。有利的，本發(fā)明的藥物組合物將用于肝臟移植。另外，預(yù)期本發(fā)明的抗體能用于防止Tupaia-肝細胞被HCV感染性人血清感染。
本發(fā)明預(yù)料，各種本發(fā)明的多核苷酸和載體可用標準載體和/或基因傳遞系統(tǒng)，單獨或組合施用，并可任選的和藥物學上可接受的運載體或賦形劑一起施用。施用后，所述多核苷酸或載體可穩(wěn)定整合入個體的基因組中。另一方面，可使用病毒載體(它們對某些細胞或組織是特異性的，并在所述細胞中維持)。合適的藥物學運載體和賦形劑是本領(lǐng)域熟知的?？捎酶鶕?jù)本發(fā)明制備的藥物組合物來預(yù)防或治療，或延遲HCV感染。另外，將本發(fā)明包含本發(fā)明的多核苷酸或載體的藥物組合物用于基因治療是可能的。合適的基因傳遞系統(tǒng)可包括脂質(zhì)體、受體介導的傳遞系統(tǒng)、裸露DNA、和病毒載體，如皰疹病毒、反轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒和腺伴隨病毒等；見上。將核酸傳遞到體內(nèi)的一個特異性位點，用于基因治療，也可用生物彈射biolistic傳遞系統(tǒng)完成，如Williams所述(Proc.Natl.Acad.Sci.USA88(1991),2726-2729)。
在本發(fā)明的另一個實施例中，涉及一種在人中預(yù)防丙型肝炎病毒(重)感染的方法，包含施用本發(fā)明的抗體、多核苷酸或載體的步驟。還包含一種在人中減輕慢性丙型肝炎的方法，包含步驟用本發(fā)明上述化合物與藥物學上可接受的運載體聯(lián)用，治療所述病人。
在本發(fā)明的另一個實施例中，涉及一種診斷組合物，它包含任何一種上述的本發(fā)明的抗體、抗原、多核苷酸、載體或細胞，并可任選的合適檢測工具。本發(fā)明的抗原和抗體適合用于免疫試驗，其中可以水相或結(jié)合于固相載體上利用它們?？衫帽景l(fā)明抗原的免疫試驗的例子是直接或間接形式的競爭性和非競爭性免疫試驗。這些免疫試驗的例子是放射性免疫測定(RIA)，夾心法(免疫測量試驗)和蛋白質(zhì)印跡試驗。本發(fā)明的抗原和抗體可與許多不同的運載體結(jié)合，并用來分離與這些多肽特異性結(jié)合的細胞。熟知的運載體的例子包括玻璃、聚苯乙烯、聚氯乙烯、聚丙烯、聚乙烯、聚碳酸酯、右旋糖苷、尼龍、直鏈淀粉、天然和修飾的纖維素、聚丙烯酰胺、瓊脂糖和磁鐵。對于本發(fā)明的目的，運載體的性質(zhì)可以是可溶的或不溶的。
本領(lǐng)域普通技術(shù)人員知道，有許多不同的標記物和標記方法。可在本發(fā)明中使用的標記物類型的例子包括酶、放射性同位素、膠體金屬、熒光化合物、化學發(fā)光化合物和生物發(fā)光化合物；也見上文討論的實施例。
在另一個實施例中，本發(fā)明的抗體還可用于診斷個體中HCV感染的方法，通過從被測試的個體中獲得體液樣品，其可以是血樣、淋巴樣品或任何其它體液樣品，并將該體液樣品與本發(fā)明的抗體在能形成抗體-抗原復(fù)合物的條件下接觸。然后通過本領(lǐng)域已知的方法，測定這些復(fù)合物的水平，比對照樣品中形成的水平顯著高，表明被測試個體有HCV感染。以同樣的方式，也可用被本發(fā)明的抗體特異性結(jié)合的抗原來診斷個體中的HCV感染，通過使被測個體的體液樣品與上述抗原接觸，并測定樣品中抗原-抗體復(fù)合物的形成。因此，本發(fā)明涉及一種測定丙型肝炎病毒糖蛋白E2的體外免疫試驗，其特征是優(yōu)選在非還原條件下，測量其與本發(fā)明抗體的共沉淀。另外，本發(fā)明包括一種診斷病人中慢性丙型肝炎的方法，其特征在于用本發(fā)明的抗體測試所述病人的樣品中丙型肝炎病毒糖蛋白E2在靶細胞上的結(jié)合能否被中和。因此，本發(fā)明還涉及一種用本發(fā)明的抗體抑制丙型肝炎病毒糖蛋白E2在靶細胞上的結(jié)合的中和試驗。
本發(fā)明還包含檢測樣品(如細胞樣品)中HCV抗原存在的方法，包括從人體獲得細胞樣品，使所述樣品與上述抗體之一接觸，優(yōu)選在允許抗體與抗原結(jié)合的非還原條件下，并用放射性免疫試驗或酶聯(lián)免疫試驗等免疫試驗技術(shù)來檢測被結(jié)合抗體的存在。另外，本發(fā)明涉及一種檢測人體中抗丙型肝炎病毒的自身抗體的方法，包括使病人的樣品與本發(fā)明的抗原接觸，并檢測與所述抗原結(jié)合的抗體的存在。
在另一個優(yōu)選例中，本發(fā)明涉及上述抗體、抗原、多核苷酸、載體或細胞用于制備藥物組合物，治療或預(yù)防人體中HCV感染，或防止HCV感染復(fù)發(fā)的用途。優(yōu)選所述藥物組合物是設(shè)計成在肝臟移植之前、之中或之后施用的。
本發(fā)明的藥物組合物、方法和用途可理想的用于人。雖然本文所述的方法和用途也包括動物治療。
本發(fā)明的描述和實施例公開并包括了這些實施例和其它的實施例。關(guān)于任何一種根據(jù)本發(fā)明使用的抗體、方法、用途和化合物的文獻可從公共圖書館和數(shù)據(jù)庫獲得，用于示范性的電子裝置。例如可用在互聯(lián)網(wǎng)上可得到的公共數(shù)據(jù)庫″Medline″，例如在http://www.ncbi.nlm.nih.gov/PubMed/medline.html。其它數(shù)據(jù)庫和網(wǎng)址，如http://www.ncbi.nlm.nih.gov/,http://www.infobiogen.fr/,http://www.fmi.ch/biology/research_tools.html,http://www.tigr.org/，是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。而且還可用例如http://www.lycos.com獲得。在Berks,TIBTECH12(1994),352-364中給出了對于生物技術(shù)專利信息的綜述，以及對回顧性檢索和目前了解有用的專利信息有關(guān)來源的評述。
上述公開內(nèi)容總體上描述了本發(fā)明。參考下列具體例子可獲得更完整的理解。這些例子是為了說明而提供的，不是要限制本發(fā)明的范圍。
附圖顯示

圖1間接免疫熒光分析。用如前所述的SVE2重組病毒感染CV-1細胞(Fournillier-Jacob等，1996)，用病人血清(1∶20稀釋度)或產(chǎn)生HMAb的細胞系的上清液進行免疫熒光分析。用與熒光素偶聯(lián)的山羊抗人IgG免疫血清進行染色。(A)病人1的血清；(B)病人2的血清；(C)HMAb 503；(D)HMAb 108；(E)與HCV無關(guān)的慢性肝炎的病人血清。額外的陰性對照(F)含有用SVE1重組病毒(表達E1)感染的CV-1細胞，并用HMAb503或108染色(結(jié)果只顯示HMAb503)。
圖2在表位作圖研究中使用的質(zhì)粒。(A)代表編碼病毒核衣殼(C)、糖蛋白E1和E2，以及非結(jié)構(gòu)蛋白p7、NS2和NS3的HCV基因組功能域(Rice等，1996)。標出了蛋白酶切割位點的氨基酸位置。(B)不同表達質(zhì)粒編碼的序列的圖上位置和氨基酸邊界。
圖3:E2的免疫沉淀和E1共沉淀，以及在還原和非還原條件下表位形成分析。脈沖標記了用vTF7-3和vHCV1-1488(vHCV)共感染或用TF7-3單獨(M)感染的細胞，跟蹤指定的時間(小時)。用HMAb108,503和小鼠MAb H2(Dellersnyder等，1997)免疫沉淀E2糖蛋白。在還原或非還原條件下，通過SDS-PAGE(10％丙烯酰胺)分析免疫沉淀物。在圖左側(cè)標出了HCV特異性蛋白的預(yù)期位置。
圖4:E2結(jié)合被HCV-E2 HMAb中和的百分數(shù)。測試了各種濃度的抗-E2HMAb503和108中和純化的CHO表達的E2蛋白與MOLT-4細胞結(jié)合的能力。如所述計算了中和作用(Rosa等，1996)，標出50％中和滴度。
圖5:HMAb503輕鏈可變區(qū)(VL)的核酸序列和氨基酸序列。
圖6:HMAb503重鏈可變區(qū)(VH)的核酸序列和氨基酸序列。
實施例說明了本發(fā)明。
實施例1:病人的篩選和產(chǎn)生人單克隆抗體的B細胞(LCL)的產(chǎn)生兩個病人加入了本研究。用RIBA Ⅲ試驗(Abbott Laboratories)測定了HCV感染。在PBMC(外周血單核細胞)無限增殖時，如用組織學檢查和陽性PCR試驗測定所顯示，兩個病人都患有慢性肝炎。用bDNA試驗2.0版(quantiplex HCV RNA試驗，Chiron Diagnostics)測定血清病毒負荷。用三種不同方法測定了HCV基因型。第一種是根據(jù)檢測基因型特異性的，針對非結(jié)構(gòu)抗原4(NS4)的抗體，并用MUREX 1-6血清定型試驗，按廠商說明書(MUREXDiagnotics SA,Bhattacherjee等，1995)測定。第二種是根據(jù)從基因組的5’非編碼區(qū)(NCR)，用基因型/亞型特異性探針擴增病毒序列，并用INNO-LIPA試驗(Innogenetics S.A.)進行。在這兩個病人之一中，病人1盡管用PCR可在血清中檢測到HCV RNA，血清ALT(丙氨酸轉(zhuǎn)移酶)水平是正常的，而且保持正常(輕度肝炎)。相反，在病人2中ALT水平保持持續(xù)上升，該病人中的感染特征是肝硬化。
如前所述進行了產(chǎn)生HMAb細胞系的生成(Boyer等，1991,Desgranges等，1988,Seigneurin等，1983)。簡單說，在Ficoll分離后，使PBMC與EBV培養(yǎng)上清液(1毫升B95.8株的上清液，具有10-3 TD50/ml對5×106PBMC的滴度)在室溫下接觸。培育后，將它們稀釋在培養(yǎng)液中，濃度范圍為每孔50到100×103細胞。2到4周后，用SVE2 CV-1 IFA篩選上清液的抗-E2反應(yīng)性。已報道抗-E2抗體的檢測是嚴格依賴于抗原產(chǎn)生方法的(Chien等，1993,Hsu等，1993,Lesniewski等，1995)。已顯示HCV E2的真核表達，而不是原核表達使該蛋白能正確加工并糖基化(Selby等，1993)。在我們的研究中，我們用作抗-E2抗體的篩選試驗的是，一種真核表達的E2抗原，以天然形式，即通過免疫熒光試驗(IFA)可見的形式分析。先前Fournillier-Jacob等曾用過這種檢測試驗，并顯示對抗體檢測特別有效(Fournillier-Jacob等，1996)。簡單說，用來自原型H株(基因型1a)的重組質(zhì)粒pCW18 E2(表達HCV E2氨基酸序列371到746)，和輔助性SV40突變病毒一起轉(zhuǎn)染CV-1細胞，來產(chǎn)生重組病毒表達的E2的儲備原液(SVE2,Fournillier-Jacob等，1996,Wychowski等，1986)。用SVE2病毒來進一步感染CV-1細胞，并用感染病人的血清和EBV-無限增殖的B細胞的上清液，如前所述進行免疫熒光分析(Fournillier-Jacob等，1996)。在分析前，將細胞固定在甲醇∶乙酮(3∶7)中。
以每孔2到20個細胞，用50×103個射線照射的(2,500rad)同種異體PBMC進一步亞克隆兩次LCL。獲得自兩個病人衍生的兩個保持陽性的克隆。表1總結(jié)了兩個病人和兩種淋巴類B-細胞系產(chǎn)生的HMAb，稱為503和108的特性。這兩個克隆的培養(yǎng)上清液的分析揭示這兩個克隆都僅分泌IgG1。用IFA在用重組SVE2病毒感染的CV-1細胞上測試了各個克隆的上清液，用對人IgM、IgG或IgA(Byosis)、IgG1、IgG2、IgG3和IgG4亞類(Sigma Immuno Chemical Co.)和λ和κ輕鏈(Dakopatts)特異性的第二抗體來揭示染色情況。
表1病人抗體和衍生的人抗-E2單克隆抗體的特征
a用從病人EBV-PBMC轉(zhuǎn)化之日和從后來兩年隨訪中兩個不同時間點得到的樣品進行分析。不同時間點和不同試驗之間的結(jié)果是一致的。
b用Quantiplex bDNA試驗(Quantiplex HCV RNA試驗，Chiron Diagnostics,Emeryville)在血清中定量。
c通過IFA在CV-1感染的細胞上，用重組SVE2病毒測試了各個克隆的上清液，用對人IgM、IgG、IgA、IgG1-4亞類的特異性第二抗體揭示了染色。
用蛋白A(Pharmacia)柱親和純化產(chǎn)生HMAb的上清液。用ELISA如前述進行培養(yǎng)上清液中抗體濃度的測定(Boyer等，1991)。每毫升常規(guī)培養(yǎng)液中LCL產(chǎn)生2到5微克Ab。用兩種不同試驗，在PBMC無限增殖和在無限增殖前兩年中的兩個不同時間測定感染病人1和2的病毒基因型。兩個試驗都給出一致的結(jié)果，表明病人1被基因型4的分離物所感染，而病人2被基因型1b的分離物所感染。由于商業(yè)上可購得的HCV基因定型試驗可能缺少特異性，并為了排除雙重感染的可能性，我們進一步對PCR衍生的序列作圖分析HCV基因組的5’非編碼區(qū)，來確定上述結(jié)果。將衍生自克隆的準種的核苷酸序列與公布的數(shù)據(jù)庫比較(Bukh等，1992)，結(jié)果證實了用商品基因定型試驗獲得的結(jié)果，即兩個病人被單一病毒型感染。圖1表明在IFA中用病人血清(A和B)或純化的單克隆抗體(C和D)觀察到的，SVE2感染的CV-1細胞的染色。該反應(yīng)性定位在細胞膜上，具有占優(yōu)勢的核周圍分布。
實施例2:HMAb的免疫學特征用不同方法確定產(chǎn)生的抗體的免疫反應(yīng)性。使用原始病人血清，LCL的上清液，和純化抗體，在變性條件下，用含有亞型1a和1b衍生的E2蛋白質(zhì)的制備物進行蛋白質(zhì)印跡分析(Nakano等，1997)。對于蛋白質(zhì)印跡分析，如前所述使用了來自基因型1a和1b序列的桿狀病毒表達的E2蛋白質(zhì)(Nakano等，1997)。使用了病人血清(1∶50)、兩個克隆的上清液，和純化的HMAb(在高達10微克/毫升濃度下測試)。用全套合成肽(包括整個E2開放閱讀框)如前所述，用病人血清和純化的抗體進行表位作圖(Courtesy A.M.Prince,Wang等，1996)。合成肽大多是在連續(xù)肽之間有6個氨基酸重疊的12聚物，對應(yīng)于HCV-H株(基因型1a)E2蛋白的序列?？偣灿?7條E2肽(aa 384-727)，所有都由AnaSpec合成。
雖然兩個感染HCV病人的血清都和E2 1a和1b衍生蛋白質(zhì)反應(yīng)，但沒有一個培養(yǎng)上清液或純化的HMAb給出陽性信號，即使在濃度高達10微克/毫升時測試也沒有。在肽掃描ELISA中，用一組覆蓋E2 1a序列的合成肽測試培養(yǎng)上清液或純化抗體時，也觀察不到反應(yīng)性。
由于上述觀察提示，識別的決定簇可以是非線性的，因此在IF試驗中分析了不同樣品的免疫反應(yīng)性。用表達不同E2功能域的全套質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細胞(見圖2)，來嘗試鑒定限制性決定簇序列。用IFA在LTK細胞(已經(jīng)用表達截短的E2蛋白功能域(見圖2)的全套載體轉(zhuǎn)染過)上評估獲得的這兩種HMab的反應(yīng)性。在pcDNA3質(zhì)粒(Promega)的CMV啟動子控制下直接克隆E2序列，產(chǎn)生質(zhì)粒pCIE2和pCIE2t，或作為與乙型肝炎病毒表面抗原的融合蛋白表達產(chǎn)生質(zhì)粒pS2S.E2A-E，用標準技術(shù)和如前所述的技術(shù)表達(Sambrook等，1989,Nakano等，1997)。用Qiagen純化柱(Qiagen)根據(jù)廠商說明書產(chǎn)生所有的DNA制備物。用1.0微克DNA在Lipofectamin(Gibco BRL)存在下轉(zhuǎn)染LTK細胞。通過IFA在感染后48小時，如前所述測試了細胞上清液和純化的HMAb的免疫反應(yīng)性(Major等，1995)。陽性對照包括采用直接注射質(zhì)粒pCiE2t免疫的小鼠產(chǎn)生的反應(yīng)性超免疫血清(Nakano等，1997)。陰性對照包括使用未感染的LTK細胞和用表達E1的重組SV40病毒感染的CV-1細胞(Fournillier-Jacob等，1996)。
表2病人血清和純化的單克隆抗體(HMAb)針對截短的E2功能域的免疫反應(yīng)性
a用標出的質(zhì)粒瞬時轉(zhuǎn)染LTK細胞，并如Major等所述(1995)，在48小時后進行IFA。pS2.SE2A-E質(zhì)粒是根據(jù)Nakano等(Nakano等，1997)。用pcDNA3質(zhì)粒(Promega)作為陰性對照。
b以1/20稀釋度測試病人血清；以高達10微克/毫升的濃度在至少兩個獨立進行的實驗中使用了LCL上清液或純化的HMAb。
c在所有情況下，采用直接注射質(zhì)粒pCIE2t免疫的小鼠獲得的反應(yīng)性超免疫血清，評估了轉(zhuǎn)染的效率和質(zhì)粒的正確表達(Nakano等，1997)。
表2總結(jié)了IF研究的結(jié)果。病人1的血清識別了各種E2表達質(zhì)粒表達的序列中(作圖)的多個決定簇。相反，該病人衍生的HMAb503僅識別將近全長的E2表達形式(由質(zhì)粒pCIE2t編碼)，但不識別該抗原較小的任何表達形式。對于病人2，血清和衍生的108抗體都僅和最大的E2表達形式反應(yīng)。因此，用該方法，不可能鑒定出兩種純化抗體之一所識別的限制性決定簇序列。所有上面的實驗與亞型1a衍生抗原有關(guān)。此外評估了純化的單克隆抗體識別亞型1b衍生的E2的能力，作為評估其交叉反應(yīng)性能的一種方法。通過免疫沉淀，用被重組新培斯病毒，Sinrep/HCV-BK1-1207(表達該抗原)感染的細胞測試了HMAb的反應(yīng)性。兩種抗體都能識別該抗原，如觀察到強特異性信號所顯示的那樣。
聯(lián)合上面的結(jié)果，這些數(shù)據(jù)提示HMAb能識別至少兩種不同E2亞型(1a和1b)衍生抗原的特異性決定簇。另外，它們強烈提示該二抗體可能識別構(gòu)象依賴性決定簇。
實施例3免疫沉淀研究在蛋白質(zhì)印跡中和在用一組表達不同截短的E2部分載體轉(zhuǎn)染的LTK細胞上進行IFA中HMAb缺乏反應(yīng)性，提示該抗體識別構(gòu)象依賴性表位。因此，進一步在脈沖跟蹤實驗中評估了HMAb對E2的識別。另外，由于先前報道已提出，E1和E2相互反應(yīng)形成復(fù)合物被假設(shè)成是摻入病毒顆粒中的功能性亞基(Deleersnyder等，1997)，還評估了HMAb識別這些復(fù)合物的能力。這些E1E2復(fù)合物是非共價結(jié)合的，或因分子間二硫鍵而穩(wěn)定，形成E1E2聚集物。還已報道，共價結(jié)合的E1E2復(fù)合物據(jù)信不是病毒顆粒的功能性亞基部分(Dubuisson等，1994,Grakaoui等，1993,Ralston等，1993)。對于本發(fā)明的目的，使用了不同的重組病毒。這些包括1)重組痘病毒vTF7.3，表達T7 DNA-依賴性RNA聚合酶(Fuerst等，1986),2)全套重組痘病毒，表達HCV-H氨基酸序列，vHCV 170-809,vHCV 371-809,vHCV 1-1488和vHCV 370-661(Grakoui等，1993,Michalak等，1997,Fourniller-Jacob等，1996,Major等，1995)和3)重組新培斯病毒(Sinrep/HCV-BK1-1207)，表達基因型1b株的結(jié)構(gòu)蛋白，BK株(Dubuisson等，1994)。如所述在CV-1單層(對于痘病毒)或在BHK-21細胞(對于新培斯病毒)中產(chǎn)生病毒儲備原液。(Dubuisson等，1994,Bredenbdeeck等，1993)。感染細胞并用35S-轉(zhuǎn)標記(ICN)進行代謝標記細胞，方法如前所述(Dubuisson等，1994,Dubuisson和Rice,1996)。用10mM Tris-HCl(pH 7.5),150mM NaCl和2mM EDTA配的0.5％NP-40裂解細胞。在實驗用的裂解緩沖液中加入20mM碘化乙酰胺，在其中分析了二硫鍵的形成。如所述進行免疫沉淀(Dubuisson等，1994,Dubuisson和Rice,1996)。對于定量實驗，用密度測量法分析放射性自顯影照片。
3.1HMAb識別E的早折疊功能域進行免疫沉淀來分析由這些HMAb識別的蛋白的特征(圖3)。用針對構(gòu)象非依賴性(MAb A11)或構(gòu)象依賴性(MAb H2)表位的小鼠抗-E2 MAb作比較(Dubuisson等，1994,Deleersnyder等，1997)。在還原條件下，HMAb108和503在脈沖中不沉淀E2蛋白，但在跟蹤30分鐘后，一條對應(yīng)于E2的條帶開始被檢測到，60分鐘后強度增大(圖3，還原HMAb108和503)。這與用小鼠MAb A11(針對構(gòu)象依賴性表位)獲得的結(jié)果相反(圖3，還原，MAb A11)。如先前用這后一種抗體觀察到的那樣，在脈沖過程中檢測到異源E2相關(guān)產(chǎn)物，可能是在E2-NS2前體的NS2區(qū)合成中翻譯暫停的結(jié)果(Dubuisson等，1996)。對于Mab A11，在跟蹤30分鐘后，E2-NS2前體沉淀的強度非常高，并隨時間下降，而對于被HMAb108和503沉淀的E2-NS2蛋白來說，它是低而恒定的，表明E2在從E2-NS2前體上切下后，主要被該抗體所沉淀。與用構(gòu)象依賴性MAb H2進行的免疫沉淀比較，表明在E2檢測中的極大延遲(圖3，還原，Mab H2)。這些觀察表明，確實HMAb識別E2的構(gòu)象依賴性區(qū)域，該區(qū)域在E2蛋白的成熟加工過程中早期出現(xiàn)。兩種HMAb表位形成的估計半衰期是大約15分鐘(數(shù)據(jù)未顯示)。
3.2 HMAb可沉淀非共價E1E2復(fù)合物在非還原條件下進行了其它脈沖跟蹤實驗，并與那些在還原條件下進行的比較(圖3)。在還原條件下，兩種HMAb協(xié)同沉淀了E1，表明它們識別E1和E2復(fù)合物，當在阻止二硫鍵穩(wěn)定E1E2復(fù)合物的非還原條件下進行免疫沉淀時，在凝膠頂部還檢測到緩慢移動的條帶。后面的這些觀察提示，沉淀的E1E2復(fù)合物是由非共價結(jié)合的異二聚物和異源連接的聚集物構(gòu)成的。如先前所觀察，對于已顯示能識別E2天然形式的Mab H2，僅在那時候在凝膠上檢測到對應(yīng)于E1和E2的條帶(圖3，非還原，H2,Dellersnyder等，1997)。在非還原條件下，E1單體形式和HMAb 108的共沉淀更少，與HMAb 503比較，僅在延長接觸時間后才檢查到一條特異性條帶。因此，這兩種HMAb都識別E2蛋白的功能域(該功能域呈現(xiàn)早折疊，而且在蛋白形成其最終構(gòu)象中保持可接觸)，如非共價結(jié)合的E1E2復(fù)合物的共沉淀所提示的。
總的說，上述數(shù)據(jù)表明，HMAb108和503識別一個或多個構(gòu)象依賴性決定簇，并能沉淀據(jù)信存在于病毒顆粒上的E1和E2非共價結(jié)合的復(fù)合物。
實施例4:E2與細胞結(jié)合的中和Rosa等(Rosa等，1996)最近開發(fā)的試驗使得能以定量方式評估候選抗體中和高度純化的E2與HCV感染易感性細胞的結(jié)合(中和結(jié)合或NOB)的能力。在該試驗中評估了兩種HMAb。在Rosa等(Rosa等，1996)最近開發(fā)的試驗中評估了HMAb中和E2(中和結(jié)合或NOB)與MOLT 4細胞結(jié)合的能力。該試驗在96U-底微量滴定板中進行。簡單說，將20微升重組CHO E2384-715蛋白(0.5微克/毫升)與各種稀釋度抗E2 HMAb和對照HMAb混合(Rosa等，1996,Boyer等，1991)。4℃培育1小時后，將混合物加到MOLT-4細胞(每孔105個細胞)中。洗滌后，隨后用1/100稀釋度的人血清(含有識別結(jié)合靶細胞的E2的抗-E2免疫球蛋白)培育細胞。洗滌細胞，并用異硫氰酸鹽偶聯(lián)的抗IgG血清培育細胞。用FACScan流式細胞計數(shù)器分析熒光。如下計算特異性中和((陽性對照MFI-實驗MFI)/(陽性對照MFI-陰性對照MFI))×100，其中(MFI)=細胞群的平均熒光強度，其直接與熒光標記的、與細胞結(jié)合的HCV蛋白的表面密度相關(guān)。比較了用或不用HCV蛋白，和用HCV HMAb或HCV-陰性HMAb,或免疫前血清培育的細胞的MFI值(Rosa等，1996)。對于各實驗，不用HCV蛋白，用流式細胞計數(shù)器分析(未結(jié)合HCV蛋白的)細胞設(shè)置陽性閾值，這些細胞已用抗HCV蛋白的抗血清，和異硫氰酸熒光素標記過。對于競爭結(jié)合分析，抗體被如下生物素化用2毫克/毫升的N-,N-二甲基甲酰胺生物素4℃培育以0.4M磷酸緩沖液配的1毫克/毫升抗體2小時，并以PBS充分透析過夜。用兩種抗體進行NOB活性試驗，所用的競爭物標記的抗體為2.5微克/毫升。
圖4顯示了不同濃度的抗體獲得的中和百分數(shù)。結(jié)果表明HMAb 503顯示NOB活性，而且50％結(jié)合的中和是在0.03微克/毫升的濃度下實現(xiàn)的。對于HMAb108，在任何測試濃度下都未檢測到NOB活性。因此，具有NOB活性的HMAb 503是第一種迄今為止描述的這樣的抗體。感興趣的是，產(chǎn)生的克隆(503)衍生自被基因型4感染的病人，而試驗所用的是基因型1(a)衍生抗原，從而證實了該抗體的交叉反應(yīng)能力。數(shù)據(jù)還提示，具有NOB活性的抗體看來是靶向不同病毒基因型之間保守的決定簇的。
進行了競爭實驗，來測定兩種抗體是否與相似的或拓撲圖不同的表位結(jié)合。HMAb不阻止(即不競爭)503Ab中和活性的檢測。這些結(jié)果強烈提示，HMAb108和503識別E2蛋白質(zhì)上的不同表位。
實施例5預(yù)防肝臟移植中的HCV感染下文描述了丙型肝炎病毒(HCV)感染的病例下的肝臟移植，其中施用了本發(fā)明的一種抗體，來避免植入器官的再感染。
病人的準備剃去全身體毛，灌腸，取血(定量測定HCV-RNA)，在藥物的幫助下凈化腸道。
捐獻者的準備(證實大腦死亡，心臟還在跳動)取血(檢查抗乙肝、丙肝；HIV、巨細胞病毒的抗體)，取下器官，在儲藏液中保藏，以轉(zhuǎn)運到Wisconsin大學(儲藏液為富含鉀的電解溶液，保存在4℃)，并轉(zhuǎn)運給病人。在手術(shù)室中對病人施用常用麻醉藥和免疫抑制(約1克脫氫皮質(zhì)醇+FK506或環(huán)孢菌素A+可任選的硫唑嘌呤+可任選的抗胸腺細胞球蛋白)；打開胃(剖腹術(shù))；將一條旁路固定在股靜脈(脊)和腋靜脈(腋)之間，來穩(wěn)定血循環(huán)；從周圍組織中分離肝臟，準備輸入和輸出血管(肝動脈、肝門靜脈、膽總管、肝靜脈)，并剝離肝臟(Pringel-Manver)。鉗住血管，取出肝臟。
在該階段施用抗體將作為凍干液或作為濃縮溶液的100-200毫克抗體+500毫克人血清白蛋白，溶于100毫升等滲鹽溶液中或5％葡萄糖溶液中，用2小時輸入。在輸液過程中，將捐獻者的器官放入病人的腹部區(qū)域。將血管交叉合流(縫合)，再次取血樣(測定HCV-RNA滴度)。輸液結(jié)束后，重新灌注血管，并檢查閉合度。如果它們是閉合的，將肝臟置于腹部區(qū)。灌注開始一小時后，進行肝臟活體標本檢查，閉合腹腔。免疫組織化學分析活檢標本，是否抗原已到達靶部位。
將病人送到重病監(jiān)護室，保持麻醉，并給予人工呼吸。密切監(jiān)視肝功能、繼發(fā)性出血、靜脈閉塞、感染狀態(tài)、血抗體濃度和HCV-RNA-滴度(HCV-RNA-滴度的正常過程幾天后低于其在約1周后增高的示范水平)。
長期過程在時間的第一階段，每天施用100毫克脫氫皮質(zhì)醇，在3個月的過程中劑量減至5毫克；在病人一生中都施用不同劑量的脫氫皮質(zhì)醇和FK506或環(huán)孢菌素，僅在前4周施用硫唑嘌呤和/或抗胸腺細胞球蛋白。每6到8周更新一次治療性抗體(輸入100-200毫克)；每4周測定HCV-RNA滴度和抗體濃度。如果對該抗體有更好的了解，就不需要再測量。病人一生都監(jiān)測肝功能、感染和可能的排斥反應(yīng)(活體檢查)。接觸前預(yù)防(受感染人的配偶；如不要懷孕，通常用陰莖套保護)每6到8周肌肉內(nèi)(如可充分接受)或通過輸液施用100-200毫克抗體丸劑。監(jiān)測血液抗體濃度。
對于接觸前預(yù)防(被針等刺傷的護士)，取血(HCV-RNA滴度)，在有結(jié)果前，通過輸液施用100-200毫克抗體。
實施例6人抗-HCV抗體的功能性免疫球蛋白可變區(qū)序列的克隆和測定，以及在CHO-細胞中的表達從產(chǎn)生抗體的EBV轉(zhuǎn)化的人B細胞系中，按照Chomczynski方法(分析生物化學162(1987)156-159)制備總RNA。
然后，根據(jù)標準方案(Sambrook，分子克隆實驗手冊，Cold Spring HarborLaboratory Press 1989，第二版)合成cDNA。
用表3中列出的寡核苷酸引物組，和從所述人B細胞系合成的cDNA作為模板，擴增了編碼人抗HCV抗體的λ輕鏈和γ1-重鏈Fd-節(jié)段(VH+CH1)的DNA區(qū)域。該引物組產(chǎn)生了重鏈Fd-節(jié)段的5’-Xho1和3’-Spe1識別位點，和λ輕鏈的5’-Sac1和3’-Xba1識別位點。對于PCR擴增編碼重鏈Fd節(jié)段的DNA片段，將5個不同5’-VH-引物(VH1,3,5,7,VH2,VH4,VH4B和VH6)分別與3’-VH引物CGd1聯(lián)合；對于PCR擴增λ輕鏈片段，將8個不同5’-VL引物(VL1-8)各與3’-VL引物CL2聯(lián)合。
用下列PCR程序來擴增94℃變性20秒；52℃引物退火50秒，72℃引物延伸60秒。進行40輪循環(huán)，最后72℃最終延伸10分鐘。
在瓊脂凝膠上跑PCR產(chǎn)物，分離合適大小的DNA條帶。然后用限制性酶Xho1和Spe1(對于重鏈片段)或用Sac1和Xba1(對于輕鏈片段)消化各分離的DNA條帶，并克隆入質(zhì)粒載體Bluescript(Stratagene)，該載體是已用Xho1和Spe1消化或用Sac1和Xba1切割制備的。
然后對克隆的重鏈和輕鏈片段的質(zhì)粒制備物進行序列分析。選擇兩條分別編碼功能性免疫球蛋白重鏈或輕鏈可變區(qū)(VH和VL)的序列這樣可鑒定正好一條功能性VH和一條功能性VL區(qū)域。在圖5(SEQ ID NOS:1和2)和6(SEQ ID NOS:3和4)中描述了功能性VL-和VH-序列。通過與人V基因序列數(shù)據(jù)庫(http://www.mrc-ope.cam.ac.uk/imt-doc/)提供的對應(yīng)種系序列比較，完成了成熟N-末端的氨基酸序列。
根據(jù)標準方法(Sambrook，分子克隆實驗手冊，Cold Spring HarborLaboratory Press 1989，第二版)進行克隆和測序。
為了克隆含有人抗-HCV抗體的重鏈和輕鏈的原始N-末端的VL-和VH-片段，進行了下列實驗用MMLV反轉(zhuǎn)錄酶SuperscriptII(Gibco BRL,Eggenstein)根據(jù)標準方案(Sambrook，分子克隆實驗手冊，Cold Spring Harbor Laboratory Press 1989,第二版)反轉(zhuǎn)錄總RNA。用兩種寡核苷酸CGd1(對于重鏈)和CL2(對于輕鏈)進行cDNA特異性引發(fā)。
然后用末端轉(zhuǎn)移酶(Pharmacia,Freiburg)根據(jù)標準方案對cDNA的第一鏈加poly-A尾。用含有poly-C延伸的有義引物PCR擴增加尾的cDNA，根據(jù)Gilliland,L.K等公布的錨定引物序列(組織抗原47,1-20,1996)和指定的5’-AncTail(CGTCGATGAGCTCTAGAATT CCCCCCCCCCCCCD)。該錨定引物和對編碼λ輕鏈恒定區(qū)(CL2)或IgG1-CH1重鏈區(qū)(CGd1)C末端的核苷酸序列分別有特異性的反義引物聯(lián)合。
如下進行PCR初次變性94℃4分鐘；擴增30輪93℃30秒；55℃30秒；72℃30秒；終末延伸72℃3分鐘。這些引物各含有限制性酶切位點(5’-AncTail:EcoR1；CL2:Xba1；CGd1:Spe1)，使對應(yīng)的PCR片段分別克隆入用EcoR1/Xba1或EcoR1/Spe1消化的質(zhì)粒載體中；為此，使用了bluescriptKS+質(zhì)粒載體(Genebank登錄號X52327)，因為它使得能使用常用的測序引物，易于對得到的插入物進行序列分析。證明幾個重鏈和輕鏈片段的克隆分別具有相同序列，并能被鑒定成編碼功能性VL區(qū)或VH區(qū)。證明VH序列與上述方法克隆的相同。將VL氨基酸序列(SEQ ID NO:6)和上述方法獲得的VL序列比較，證明其在成熟N-末端的位置2上有一個氨基酸替換。
根據(jù)標準程序，用PCR將包含天然前導肽的完整λ輕鏈克隆入哺乳動物表達載體pEF-ADA中(見PCT/EP98/02180)。根據(jù)標準程序用PCR，還將VH克隆入PCT/EP98/02180中所述的哺乳動物表達載體pEF-DHFR中的人γ1-重鏈的基因組中。
通過穩(wěn)定轉(zhuǎn)染CHO-細胞然后基因擴增，如(PCT/EP98/02180)所述進行完整人IgG1λ-抗體的表達。通過PCT/EP98/02180中所述的蛋白A親和層析從細胞培養(yǎng)上清液中純化該抗體。
表3引物表5’-VH引物組VH1,3,5,7:AGGTGCAGCTGCTCGAGTCTGGVH2: CAG(AG)TCACCTTGCTCGAGTCTGGVH4: CAGGTGCAGCTGCTCGAGTCGGGVH4B: CAGGTGCAGCTACTCGAGTGGGGVH6: CAGGTACAGCTGCTCGAGTCAGG3’-VH引物CGd1 GCATGTACTAGTTTTGTCACAAGATTTGG5’VL引物組VL1: AATTTTGAGCTCACTCAGCCCCACVL2: TCTGCCGAGCTCCAGCCTGCCTCCGTGVL3: TCTGTGGAGCTCCAGCCGCCCTCAGTGVL4: TCTGAAGAGCTCCAGGACCCTGTTGTGTCTGTGVL5: CAGTCTGAGCTCACGCAGCCGCCCVL6: CAGACTGAGCTCACTCAGGAGCCCVL7: CAGGTTGAGCTCACTCAACCGCCCVL8: CAGGCTGAGCTCACTCAGCCGTCTTCC3’VL引物CL2: CGCCGTCTAGAATTATGAACATTCTGTAGG
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1．一種抗體，其特征在于，該抗體包含人抗體的重鏈可變區(qū)和/或輕鏈可變區(qū)的至少一個互補決定區(qū)，所述重鏈和/或輕鏈可變區(qū)包含由圖5的輕鏈可變區(qū)(SEQ ID NO:1)，以及圖6的重鏈可變區(qū)(SEQ ID NO:3)描述的DNA序列編碼的氨基酸序列，所述氨基酸序列特異性識別丙型肝炎病毒糖蛋白E2的構(gòu)象依賴性表位，而且能沉淀共價或非共價結(jié)合的E2/E1復(fù)合物。
2．如權(quán)利要求1所述的抗體，其特征在于，所述抗體是單克隆抗體、多克隆抗體、嵌合抗體、人源化抗體、合成抗體、抗體片段、或所述抗體的化學修飾衍生物。
3．如權(quán)利要求1或2所述的抗體，其特征在于，該抗體包含如SEQ ID NO:2、4和/或6中所述的重鏈可變區(qū)和/或輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列。
4．一種抗體，其特征在于，該抗體能識別與權(quán)利要求1到3任一項所述的抗體識別的相同的表位或抗原。
5．一種抗原或其表位，其特征在于，該抗原或其表位能被權(quán)利要求1到4任一項所述的抗體識別。
6．一種多核苷酸，其特征在于，該多核苷酸編碼權(quán)利要求1到4任一項所述的抗體的免疫球蛋白鏈的至少一個可變區(qū)。
7．一種載體，其特征在于，該載體包含權(quán)利要求6所述的多核苷酸，可任選的與權(quán)利要求6編碼所述抗體的其它免疫球蛋白鏈可變區(qū)的多核苷酸組合。
8．一種宿主細胞，其特征在于，該細胞包含權(quán)利要求6所述的多核苷酸或權(quán)利要求7所述的載體。
9．一種制備能識別丙型肝炎病毒糖蛋白E2或其功能性片段或免疫球蛋白鏈的抗體的方法，其特征在于，該方法包括(a)培養(yǎng)權(quán)利要求8所述的任一細胞，和(b)從培養(yǎng)物中分離所述抗體或其功能性片段或免疫球蛋白鏈。
10．一種抗體或其片段，其特征在于，該抗體或其片段是由權(quán)利要求6所述的多核苷酸編碼的，或可通過權(quán)利要求9所述的方法獲得的。
11．一種藥物組合物，其特征在于，該藥物組合物含有治療量的權(quán)利要求1到4或10任一項所述的抗體，權(quán)利要求5所述的抗原，權(quán)利要求6所述的多核苷酸，權(quán)利要求7所述的載體，或權(quán)利要求8所述的細胞，和可任選的藥物學可接受的運載體。
12．一種診斷組合物，其特征在于，該診斷組合物包含權(quán)利要求1到4任一項所述的抗體，權(quán)利要求5所述的抗原，權(quán)利要求6所述的多核苷酸，權(quán)利要求7所述的載體或權(quán)利要求8所述的細胞，和可任選的在免疫診斷方法中常規(guī)使用的合適試劑。
13．一種預(yù)防個體丙型肝炎(重)感染的方法，其特征在于，該方法包含如下步驟施用權(quán)利要求1到4或10任一項所述的抗體，權(quán)利要求6所述的多核苷酸，或權(quán)利要求7所述的載體。
14．一種減輕人體慢性丙型肝炎的方法，其特征在于，該方法包含如下步驟用權(quán)利要求1到4或10任一項所述的抗體聯(lián)合藥物學上可接受的運載體，來治療所述個體。
15．如權(quán)利要求13或14所述的方法，其特征在于，所述個體是人或動物。
16．一種診斷個體慢性丙型肝炎的方法，其特征在于，用權(quán)利要求1到4或10任一項所述的抗體來測試所述個體的樣品，檢測是否中和了丙型肝炎病毒糖蛋白E2在靶細胞上的結(jié)合。
17．一種抑制丙型肝炎病毒糖蛋白E2結(jié)合到靶細胞上的中和試驗，其特征在于，該試驗使用權(quán)利要求1到4任一項所述的抗體。
18．一種檢測丙型肝炎病毒糖蛋白E2存在的體外免疫試驗，其特征在于，該方法測量所述糖蛋白E2和權(quán)利要求1到4或10任一項所述的抗體在非還原條件下的共沉淀。
19．一種檢測個體中抗丙型肝炎病毒的自身抗體的方法，其特征在于，該方法包括使來自所述個體的樣品與權(quán)利要求5所述的抗原接觸；并檢測與所述抗原結(jié)合的抗體的存在。
20．權(quán)利要求1到4或10任一項所述的抗體，權(quán)利要求5所述的抗原，權(quán)利要求6所述的多核苷酸，權(quán)利要求7所述的載體，或權(quán)利要求8所述的細胞的用途，其特征在于，該用途是制備藥物組合物，用于治療或預(yù)防個體中丙型肝炎病毒感染，或預(yù)防丙型肝炎病毒感染的復(fù)發(fā)。
21．如權(quán)利要求20所述的用途，其特征在于，設(shè)計將所述藥物組合物在肝臟移植前、中或后施用。
全文摘要
敘述了一種新穎的抗體,該抗體特異性識別HCV糖蛋白E2的構(gòu)象依賴性表位,并能中和E2蛋白與易感性細胞的結(jié)合。另外,提供了上述抗體識別的抗原和表位,以及編碼所述抗體的多核苷酸。還提供了載體,其包含所述多核苷酸和被其轉(zhuǎn)化的宿主細胞,以及其在所述抗體產(chǎn)生中的用途。另外,提供了藥物和診斷組合物,其包含任何上述的抗體、抗原、表位、多核苷酸、載體或細胞。還敘述了上述抗體、抗原、多核苷酸和載體在繼承性免疫治療,優(yōu)選在治療或預(yù)防肝移植中HCV感染的用途。
文檔編號G01N33/53GK1309664SQ99808641
公開日2001年8月22日 申請日期1999年7月20日 優(yōu)先權(quán)日1998年7月21日
發(fā)明者C·賴特爾, F·哈伯澤策爾, A·富爾尼勒, C·特列波, C·德格朗熱, G·安紹斯普 申請人:康耐克斯研究發(fā)展優(yōu)化有限公司, 國家健康及醫(yī)學研究院(Inserm)