專利名稱：用于檢測dna的特異堿基順序的方法和裝置的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及用于檢測特異性DNA(脫氧核糖核酸)堿基順序的一種方法和一種裝置。這樣的檢測一種特異性DNA堿基順序的操作被應用于臨床試驗、基因診斷、病理研究、藥物質(zhì)量控制及其他領域中。
特異性DNA堿基順序主要是利用Southern blotting法和液相雜交法(Liqpid phase hybridization)來檢測。然而，不利的是這樣一種方法由于需要進行B-F分離和將DNA片段拼結(jié)成膜因而處理起來太復雜。作為一種無需進行B-F分離而檢測一種特異堿基順序的方法，業(yè)已推薦了一種使用一種熒光標記單鏈DNA探針和一種固定劑的方法，所述固定劑是通過將堿基順序與所述DNA探針互補的單鏈DNA耦合到具有高分子量的載體上的方式制備的。當樣品中的DNA和所述DNA探針以競爭的方式同所述固定劑反應之后，根據(jù)熒光偏光度檢測所述特異堿基順序[參見日本專利申請公開本5-123196(1993)]。
另一方面，將表面敏化的(Surface Sensitized)喇曼光譜法用作一種檢測分子振動光譜的方法。這個方法利用了這樣一種現(xiàn)象，即當一種物質(zhì)被吸收在電極的表面或貴金屬(例如金或銀)的膠體上時引起了強的喇曼散射(例如，參見“Bunseki”1993，第577-585頁)。蛋白質(zhì)、膽紅素及其他類似物是通過這種表面敏化的喇漫光譜法研究的。眾所周知，當出現(xiàn)表面敏化的喇曼散射時，振動光譜就被強到107至108倍，這使得能夠進行高靈敏度的測量。
然而，不利的是使用所述熒光標記的DNA探針和所述固定互補DNA處理起來復雜并且由于要用各種化學物質(zhì)標記DNA而使其方便性差。
本發(fā)明的第一個任務是提供一種可以簡化對特異堿基順序的測量而無需用化學物質(zhì)標記DNA的操作。
本發(fā)明的第二個任務是提供一種用于完成前面所述的特異堿基順序檢測的裝置。
本發(fā)明的檢測DNA堿基順序的方法使用了一種DNA探針，這種探針是通過用貴金屬膠體顆粒標記具有待檢測的靶DNA的特征堿基順序的特異性單鏈DNA來制備的，該方法包括如下步驟一個通過升溫將樣品DNA分裂為單鏈DNA的步驟;一個在所述分裂步驟之前或之后將所述DNA探針同所述DNA樣品加以混合的步驟;一個降低所述被分裂的DNA樣品和所述DNA探針的混合溶液的溫度以便隨即使所述DNA探針和所述堿基順序互補的被分裂的樣品DNA鍵合的雜交步驟;以及隨后測量通過用激發(fā)光照射所述混合溶液所產(chǎn)生的喇曼散射光的步驟。所述DNA探針是通過使所述的特異性單鏈DNA同金、銀或銅的貴金屬膠體顆粒鍵合的方式制備的。所述膠體顆粒的適宜的尺寸是0.8至200nm。
檢測相應于所述DNA探針的堿基順序的一種較為可取的模式包括用光譜測定法分析在雜交步驟前后由所述DNA探針所得到的喇曼散射光成分以及根據(jù)所述喇曼散射光成分的光譜的特征之間所存在的差別來檢測所述堿基順序的方法。
盡管并不排除將本發(fā)明應用于一種進行B-F分離的不同的檢測方法，但是最好還是在雜交步驟后可以不進行B-F分離來檢測喇曼散射光。
本發(fā)明的用于檢測DNA堿基順序的裝置包括一個可以儲存所述DNA樣品和所述DNA探針的混合溶液的、帶有一個溫度傳感器和加熱/冷卻裝置的器皿、一個用于激發(fā)光照射儲存在該器皿中的混合溶液的光源部分、一個用來通過光譜測定法測量由儲存在所述器皿中的混合溶液發(fā)出的喇曼散射光成分的光譜測定部分以及一個用來根據(jù)預定的程序通過所述器皿中的溫度傳感器和加熱/冷卻裝置改變所述器皿的溫度的溫度控制器。


圖1A說明了一個通過將帶正電荷的金膠體72混合入含具有待檢測的靶DNA的特征堿基順序的特異性單鏈DNA70的溶液中的方式形成DNA探針74的過程。
圖1B說明了一個檢測相應于形成DNA探針74的所述單鏈DNA的一種堿基順序的方法。將用于測量的、含有DNA樣品76的溶液引入一個受到溫度控制的器皿78中并且用tris-鹽酸緩沖液或磷酸緩沖液將該溶液的pH值調(diào)節(jié)到4至8.5，而后將DNA探針74與該溶液相混合。將受到溫度控制的器皿78加熱到溫度為90-95℃，以便分裂DNA樣品76并將它轉(zhuǎn)化為單鏈DNA76a。而后，逐漸降低溫度，以便在37℃至70℃下保溫幾分鐘至一個小時。如果DNA樣品76包括了相應于形成DNA探針74的單鏈DNA的堿基順序，那么DNA樣品76的相應的單鏈DNA76a與DNA探針74雜交，在DNA探針76中形成雙鏈DNA。數(shù)字80表示帶有所述雙鏈DNA的DNA探針。
或者，在將DNA樣品76分裂為單鏈DNA76a之后，可以將DNA探針74與DNA樣品76相混合。
為了檢測在所述DNA樣品中是否存在相應于所述DNA探針的單鏈DNA的特異堿基順序的DNA，用激發(fā)光照射雜交步驟前后的含有所述DNA探針的溶液，以便用光譜測定法分析由相應的溶液發(fā)出的喇曼散射光成分。由所述雙鏈DNA物質(zhì)得到的喇曼散射光成分由于其上耦合有所述DNA物質(zhì)的貴金屬膠體顆粒的存在而被加強。當由雜交形成雙鏈DNA時，在雜交前后得到不同的喇曼光譜。
喇曼散射光成分提供了有關分子振動光譜的信息，這種光譜十分敏感地依賴于分子的空間結(jié)構(gòu)和電子狀態(tài)。其特點在于由分子振動中的能量改變決定的喇曼頻率對應于形成該物質(zhì)的兩個電子振動能級之間的差別。由喇曼散射光獲得的振動光譜(它對于分子個體敏感)提供了借助于諸如分子的參比振動分析的理論和分析處理高精度地識別分子的有效手段。因此，還可以根據(jù)分子光譜推測分子結(jié)構(gòu)并測量濃度。
在與貴金屬膠體結(jié)合的DNA探針之間分子結(jié)構(gòu)是不同的，這些探針有的是處于單鏈DNA狀態(tài)，有的是處于雙鏈DNA狀態(tài)(通過與具有互補堿基順序的單鏈樣品DNA雜交轉(zhuǎn)化得來)，因此，它們的喇曼光譜也彼此不同。
當在DNA探針中通過雜交而形成雙鏈DNA時，檢測的靈敏度也可能是不同的。
當在DNA探針中如此形成雙鏈DNA時，由喇曼光譜的峰位置的變化，或進一步由檢測靈敏度的變化，可以檢測出所述DNA樣品含有具有所述特異堿基順序的DNA。
根據(jù)本發(fā)明，所述DNA探針是通過用貴金屬膠體粒子標記具有待檢測的特異堿基順序的單鏈DNA而制備出來的，將該DNA探針同通過加熱使樣品DNA分裂而制備的單鏈DNA相混合，并降低溫度以獲得引起雜交的條件。在雜交步驟前后用激發(fā)光照射所述DNA探針，以便測量喇曼散射光成分，借此檢測所述DNA樣品是否會有堿基順序與形成所述DNA探針的那種DNA互補的DNA。于是，就可以在短時間內(nèi)簡單地檢測出所述特異堿基順序。
根據(jù)本發(fā)明的方法，可以不需要進行B-F分離就測量出喇曼散射光成分，于是處理被簡化了。
本發(fā)明的前面所述的以及其他的任務、特性、觀點和優(yōu)點通過以下結(jié)合附圖對本發(fā)明所作的詳細說明將變得更為清楚。
圖1A說明了形成DNA探針的步驟;
圖1B說明了雜交步驟;
圖2是一幅用圖示方式顯示用于實施本發(fā)明的方法的一個光學系統(tǒng)的方塊圖;
圖3是一幅詳細地顯示根據(jù)本發(fā)明的一個實施例的一個光學系統(tǒng)的方塊圖;
圖4是一幅顯示優(yōu)選器皿的例子的垂直剖視圖;
圖5是一幅顯示用于圖4所示的器皿的溫度控制系統(tǒng)的方塊圖;
圖6是一幅顯示優(yōu)選器皿的另一個例子的局部垂直剖視圖。
可以將帶負電荷的單鏈DNA同帶正電荷的膠體粒子用靜電方式和疏水方式鍵合起來。例如，一種帶正電荷的金膠體可以從市場上購到，商品名稱為“GENOGOLD”(由BioCell，U.S.A出品)。當將單鏈DNA與這樣一種帶正電荷的金膠體相混合時，可以很容易地得到在其中金膠體與所述單鏈DNA相鍵合的DNA探針。沒有與所述膠體粒子鍵合的未反應的單鏈DNA利用超速離心分離法、膠體過濾法或高效液相色譜法除去。為了抑制存在于樣品中的靶DNA以外的DNA對所述金膠體不發(fā)生特異吸收，所述DNA探針最好是用BSA或酪蛋白的蛋白質(zhì)溶液或等電點低于含有所述DNA探針的反應溶液的pH值的蛋白質(zhì)溶液阻斷。
另外，單鏈DNA也可以與膠體粒子鍵合，這是通過這樣的方式實現(xiàn)的使其中引入了SH基的單鏈DNA同鍵合有順丁烯二酰亞胺基的膠體粒子利用美國Nano探針進行順丁烯二酰亞胺反應，以便形成共價鍵。
還可以使單鏈DNA與膠體粒子鍵合，這是通過這樣的方式實現(xiàn)的使其中引入了生物素的單鏈DNA與鍵合有鏈球菌抗生物素蛋白的膠體粒子(利用Zaimet(美國)或E.Y實驗室(美國)的Nano探針)進行抗生物素蛋白-生物素鍵合。
圖2示出了根據(jù)本發(fā)明的一個實施例的一個DNA檢測器。
由一個加熱器和一個珀爾帖(Peltier)元件構(gòu)成受溫度控制的器皿80儲存含有DNA樣品和具有待檢測的特異DNA堿基順序的DNA探針的樣品15。數(shù)字67表示一個用于檢測器皿80的溫度的溫度傳感器。一個取自所述溫度傳感器67的檢測信號被輸入溫度控制器84，該溫度控制器依次將器皿80的溫度升高至使所述DNA樣品分裂所必須的水平，而后將該溫度降至雜交所必要的水平。
數(shù)字1表示一個激發(fā)光源，它是由一個激光單元構(gòu)成，用于測量喇曼散射光。所述激光單元可以選自一些具有從近紫外區(qū)至近紅外區(qū)這樣寬波長范圍的激光器，例如等幅振蕩Ar離子激光器、Kr離子激光器、He-Ne激光器和He-Cd激光器以及脈沖激光器例如NdYAG激光器。當該激光器的自發(fā)發(fā)射光被屏蔽，使得只有振蕩光束被用作所述激發(fā)光時，該激光單元可以與一個干涉濾光器或一個分光計組合起來。另外，還可以同時利用自發(fā)發(fā)射光，以便進行光譜的波長校正。
由光源1產(chǎn)生的激發(fā)光用一個光學系統(tǒng)10分隔成一個測量光束和一個參比光束，于是所述測量光束由光學系統(tǒng)10加以調(diào)節(jié)并被加到儲存在器皿80中的樣品15上。樣品15產(chǎn)生的喇曼散射光在與所述測量光束的入射方向成90°角的方向上被取出并且穿過一個用于調(diào)節(jié)光束的光學系統(tǒng)20由一個包括一個分光鏡的光譜檢測器檢測。
另一方面，所述參比光束穿過一個用于調(diào)節(jié)光束的光源系統(tǒng)40用一個檢測器26檢測，以便修正激發(fā)光強度的影響。信號處理運算單元50利用指示光源強度的檢測器26的輸出信號修正由光譜檢測器30檢測的所述喇曼散射光，以便得到一個喇曼光譜，于是檢測出特異堿基順序。信號處理運算單元50根據(jù)預定的溫度程度控制溫度控制器84以改變器皿80的溫度。數(shù)字35表示一個輸出單元，例如打印機或CRT(示波管)。
圖3詳細地示出了一些所述DNA檢測器的光學系統(tǒng)。一個光束分離器2(用于將從激光光源1接收的激發(fā)光光束分隔成所述測量光束和所述參比光束)、一個凸透鏡3(用于匯聚由光束分離器2分隔出的所述測量光束)、凸透鏡6和7(用于調(diào)整所述光束)以及一個光束分離器8(用于反射以便將所述測量光束導向儲存在器皿80中的樣品15)沿所述測量光束的光路分布，構(gòu)成光學系統(tǒng)10，用于用作為所述測量光束的發(fā)光光束照射樣品15。在所述測量光束的光路中，還在凸透鏡3和6之間設置一個濾光器4，用于由從激光光源1接收到的一系列振蕩光束中選擇一個波長的激光光束。
另一方面，一個凸透鏡9(用于匯聚所述喇曼散射光和穿過所述光束分離器8的測量光束)、凸透鏡12和13(用于調(diào)整所述發(fā)光束)沿由儲存在器皿80中的樣品15發(fā)出的喇曼散射光束的光路分布，構(gòu)成光學系統(tǒng)20，用于提取處在與所述測量光束的入射方向成180°角的方向上的喇曼散射光。一個用于除去一種激發(fā)光成分的濾光器11被設置在凸透鏡9和12之間。
在參比光束一側(cè)，沿所述光路還分布有反光鏡21和22(用于使所述光路轉(zhuǎn)向)和凸透鏡24和25(用于調(diào)整所述發(fā)光束)，以便將所述參比光束導向檢測器26。在反光鏡22和凸透鏡24之間設置了一個與設置在所述測量光束側(cè)的濾光器4的波長特性相同的濾光器23。
圖4示出了一個典型的有溫度控制的器皿80。
參見圖4，數(shù)字63表示一個鋁制器皿，包括一個鋁制金屬塊，在其上端朝向其內(nèi)部有一個孔，用于儲存樣品。這個孔的內(nèi)表面作過鏡面拋光處理并鍍金以提高紅外反射率。在該孔的底部設置有一個窗口65，用于從外部使激發(fā)光射向樣品64并且提取由樣品64向外發(fā)射的喇曼散射光，同時，將一塊石英玻璃窗板68安裝在這個窗口65中。在形成器皿63的金屬塊中在所述孔的側(cè)面和底部分別設有包括加熱器和珀爾帖(Peltier)元件的加熱/冷卻裝置62，62，同時鋁制漫射板61，61與加熱/冷卻裝置62，62的另一側(cè)接觸。一個溫度傳感器67被嵌入形成器皿63的金屬塊中。在圖4所示的器皿63中，激發(fā)光的入射方向與提取喇曼散射光的方向成180度角。
為了升高和降低器皿63的溫度，如圖5所示那樣，設置一個溫度控制器84，以便輸入溫度傳感器67的檢測信號并控制準備供給加熱/冷卻裝置62，62的電流量。
圖6示出了另一個典型的器皿。與圖4所示的、由中空的金屬塊整體形成的器皿63不同，在圖6中使用了一個石英玻璃器皿66。一個鋁制金屬塊被分為兩部分63a和63b，同時在兩部分63a和63b的相對的部分上形成儲存器皿66的空腔，結(jié)果所述金屬塊的兩部分63a和63b彼此組合起來用所述空腔將器皿66包圍起來。器皿66與由彼此組合起來的二部分63a和63b形成的金屬塊接觸。窗口65形成在金屬塊63a部分與器皿66的底部對應的位置上，以便供給激發(fā)光并且提取喇曼散射光。用于控制溫度的加熱/冷卻裝置62，62要安裝得使其每一側(cè)都與金屬塊的部分63b接觸，同時，在加熱/冷卻裝置62，62的另一側(cè)設置漫射板61，61并且在金屬塊部分63a中嵌入溫度傳感器67。
雖然業(yè)已對本發(fā)明作了詳細的描述和舉例說明，但是這種描述和舉例說明僅僅是一種說明和例子，而并不是要對本發(fā)明加以限定，只有所附的權(quán)利要求書才能限定本發(fā)明的精神和范圍。
權(quán)利要求
1.一種檢測一種DNA堿基順序的方法，其特征在于該方法包括如下步驟通過升高溫度將樣品DNA(76)分裂為單鏈DNA(76a)的步驟；在所述分裂步驟前后將一種DNA探針(74)與所述樣品DNA(76)相混合的步驟，所述的DNA探針(74)是通過用貴金屬的膠體粒子(72)標記具有待測靶DNA的特征堿基順序的特異單鏈DNA(70)制備出來的；降低所述被分裂的樣品DNA(76a)和所述DNA探針(74)的混合溶液的溫度，以便使所述DNA探針(74)同堿基順序互補的被分裂的樣品DNA(76a)鍵合的雜交步驟；以及測量通過用激發(fā)光照射所述混合溶液而產(chǎn)生的喇曼散射光、從而檢測出與所述DNA探針(74)相應的所述堿基順序的步驟。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測DNA堿基順序的方法，其特征在于該方法是一種單一的檢測法，包括用所述激發(fā)光照射所述混合溶液而在所述雜交步驟之后不必進行B-F分離。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測DNA堿基順序的方法，其特征在于對相應于所述DNA探針(74)的所述堿基順序的所述檢測是利用通過在所述雜交步驟前后對所述DNA探針(74)所作的光譜分析獲得喇曼散射光成分的光譜特性之間的差別完成的。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測DNA堿基順序的方法，其特征在于所述膠體粒子的貴金屬膠體是用選自金、銀和銅的任意金屬制備的，所述膠體的顆粒直徑為0.8至200nm。
5.一種用于檢測DNA堿基順序的裝置，其特征在于該裝置包括一個器皿(80)，具有一個溫度傳感器(67)和電子加熱/冷卻裝置(62)，可以儲存一種DNA樣品和一種DNA探針的混合溶液，所述DNA探針是通過用貴金屬膠體粒子標記具有待檢測的特異堿基順序的單鏈DNA來制備的;一個用于用激發(fā)光照射儲存在所述器皿(80)中的所述混合溶液的一個光源部分(1);一個光譜測量部分(30)，用于用光譜測量法測量從儲存在所述器皿(80)中的所述混合溶液發(fā)出的喇曼散射光;一個溫度控制器(84)，用于根據(jù)一個預定的程序利用所述溫度傳感器(67)和所述器皿(80)的所述加熱/冷卻裝置(62)改變的所述器皿(80)的溫度。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的用于檢測DNA堿基順序的裝置，其特征在于所述光源部分(1)包括一個激光單元。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的用于檢測DNA堿基順序的裝置，其特征在于所述光源部分還包括用于從由所述激光單元產(chǎn)生的光中選擇出具有一特異波長的振蕩光束。
8.根據(jù)權(quán)利要求5所述的用于檢測DNA堿基順序的裝置，其特征在于該裝置還包括一個用于將由所述光源部分(1)發(fā)出的激發(fā)光分離成一個測量光束和一個參比光束的光學系統(tǒng)(10);以及校正裝置(50)，用于根據(jù)所述參比光束的強度校正通過測定光束的所述光譜測定部分(30)的輸出信號。
9.根據(jù)權(quán)利要求5所述的用于檢測DNA堿基順序的裝置，其特征在于所述器皿(80)是由一個導熱金屬塊(63)構(gòu)成的，所述金屬塊在其上部朝向其內(nèi)部設置有一個用于儲存所述混合溶液的孔，所述孔具有一個鍍金的、經(jīng)過鏡面拋光的內(nèi)表面，以及具有一個窗口(68)的底部，所述窗口用于接收所述激發(fā)光并發(fā)射所述喇曼散射光并具有安裝于其中的石英玻璃窗板。
10.根據(jù)權(quán)利要求5所述的用于檢測DNA堿基順序的裝置，其特征在于所述樣品器皿包括一個石英玻璃器皿(66)，以及一個導熱金屬塊，在其上部朝向其內(nèi)部具有一個用于儲存所述石英玻璃器皿(66)的孔，所述孔在其底部設置有一個用于接收所述激發(fā)光和發(fā)射所述喇曼散射光的窗口(65);設置在所述金屬塊上的所述電子冷卻/加熱裝置(62)和所述溫度傳感器(67)。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的用于檢測DNA堿基順序的裝置，其特征在于所述金屬塊包括彼此組合在一起的兩部分(63a，63b)，這兩部分圍成用于儲存所述石英玻璃器皿(66)的所述孔。
全文摘要
將帶正電的金膠體(72)混合到含待測特異堿基順序的單鏈DNA(70)溶液中，以形成DNA探針(74)。含DNA樣品(76)和探針的溶液移入一器皿(78)中，加熱到90到95℃，使樣品分裂，然后逐漸降低溫度，在37至70℃保溫幾分至1小時。若樣品包括形成探針的單鏈DNA特異堿基順序時，由分裂的樣品制出的單鏈DNA(76a)和探針雜交，在探針中形成雙鏈DNA。由此，可簡單地檢測特異堿基順序而無須用化學物質(zhì)標記DNA。
文檔編號G01N21/65GK1112960SQ9510293
公開日1995年12月6日 申請日期1995年2月14日 優(yōu)先權(quán)日1994年2月14日
發(fā)明者竇曉鳴, 上野山晴三, 高間利夫 申請人:株式會社京都第一科學