專利名稱：篩選具有表示所選特性的種群的細(xì)胞或成型體的方法和設(shè)備的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明一般與篩選細(xì)胞或成形體以進(jìn)行種群計(jì)數(shù)的方法和設(shè)備有關(guān)，這種群計(jì)數(shù)表示出一些用于研究、診斷或工業(yè)的所選特征。具體地說(shuō)，本發(fā)明綜合應(yīng)用電子技術(shù)和粘有專用單克隆抗體的微球體對(duì)一種WBC種群和至少它的一個(gè)子集進(jìn)行直接分析、對(duì)成形體進(jìn)行分析和對(duì)多種血細(xì)胞進(jìn)行分析。
一般說(shuō)來(lái)，本發(fā)明與一種自動(dòng)分析器以及用這種分析器來(lái)篩選生物細(xì)胞或成形體以進(jìn)行種群計(jì)數(shù)的方法有關(guān)。這種種群計(jì)數(shù)表征了一些我們用來(lái)作研究、診斷、治療或工業(yè)上的各種特性。具體地說(shuō)，具體體現(xiàn)本發(fā)明的一些自動(dòng)分析器和方法由于獨(dú)特地將電子技術(shù)和具有選擇能力的生物分子(如抗體)的特殊性能結(jié)合在一起來(lái)對(duì)細(xì)胞和成形體進(jìn)行篩選和選擇分類，就能對(duì)細(xì)胞和成形體實(shí)行多部分類，將細(xì)胞和成形體功能表型，以及在其它細(xì)胞中把白血病細(xì)胞、淋己瘤細(xì)胞和硬腫瘤細(xì)胞區(qū)分開(kāi)來(lái)。
采用佛洛里達(dá)·海里厄的柯?tīng)柼仉娮庸镜腁型柯?tīng)柼赜?jì)數(shù)計(jì)可以成功地使自動(dòng)血細(xì)胞計(jì)數(shù)器對(duì)人體外周血液進(jìn)行全血細(xì)胞(CBC)常規(guī)分析達(dá)到自動(dòng)化。這種儀器的電子微粒傳感系統(tǒng)原理在1953年10月20日頒發(fā)給瓦拉斯·H·柯?tīng)柼氐拿绹?guó)專利2，656，508中有所報(bào)導(dǎo)，采用只是根據(jù)這柯?tīng)柼仉娮觽鞲性砉ぷ鞯奈⒘７治鰞x就能避免使用故障多、耗資大的光學(xué)傳感裝置或激光傳感裝置。
這種柯?tīng)柼仉娮觽鞲性戆l(fā)展推廣到諸如各種S型柯?tīng)柼赜?jì)數(shù)器的更為復(fù)雜的儀器，這些儀器用專用的計(jì)算機(jī)程序使CBC參數(shù)、絕對(duì)細(xì)胞計(jì)數(shù)、血小板計(jì)數(shù)和形志、紅血細(xì)胞(RBC)形態(tài)能解釋正常的和不正常的血樣。
柯?tīng)柼仉娮游⒘鞲性響?yīng)用了一個(gè)使用直流(DC)孔徑電源的孔徑傳感電路。這種微粒傳感器結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，非常穩(wěn)定可靠。美國(guó)和世界其它各地的臨床試驗(yàn)室大都普遍采用柯?tīng)柼赜?jì)數(shù)器自動(dòng)分析器就證明了這一點(diǎn)。這個(gè)基本的孔徑傳感電路的一個(gè)改進(jìn)型在1970年頒發(fā)給瓦拉斯?？?tīng)柼睾屯郀柼??；艨说拿绹?guó)專利3，502，974中有所報(bào)導(dǎo)。除了標(biāo)準(zhǔn)的直流孔徑電源外，還加了一個(gè)高頻孔徑電流，這使敏感一個(gè)用來(lái)進(jìn)行分類的附加參數(shù)成為可能。高頻孔徑電流產(chǎn)生一個(gè)信號(hào)，這個(gè)信號(hào)是血細(xì)胞內(nèi)部的導(dǎo)電性和細(xì)胞體積的函數(shù)。同時(shí)由直流孔徑電路產(chǎn)生一個(gè)常規(guī)的直流幅度信號(hào)，這個(gè)信號(hào)基本上指示了細(xì)胞的體積。用一個(gè)高速除法電路將射頻振幅除以直流脈沖振幅，得到一個(gè)為細(xì)胞體積和內(nèi)部電阻的函數(shù)的商，通常稱之謂“濁度”。這個(gè)原理在1970年也是頒發(fā)給瓦拉斯·柯?tīng)柼睾屯郀柼亍せ艨说拿绹?guó)專利3，502，973中有進(jìn)一步的說(shuō)明。該參數(shù)可以用于細(xì)胞分類系統(tǒng)。無(wú)論是單一孔徑或一對(duì)分開(kāi)的孔徑都可用于這種用途。
不同種群的分類是通過(guò)檢驗(yàn)所產(chǎn)生的一對(duì)信號(hào)的數(shù)據(jù)來(lái)進(jìn)行的。一個(gè)度量微粒的體積，而另一個(gè)度量細(xì)胞內(nèi)部的電阻或濁度。表示這數(shù)據(jù)的一種方便的形式是稱為散布圖的二維圖形。這類圖形在梅拉美特·梅拉耐和孟德?tīng)査删庉嫷摹凹?xì)胞流式計(jì)數(shù)和分類”(約翰·威廉父子公司1979年版)第371頁(yè)中有詳細(xì)說(shuō)明。
圖5A是一個(gè)正常血樣數(shù)據(jù)的例子。每一點(diǎn)代表一個(gè)單獨(dú)的細(xì)胞。離底線的高度表示這細(xì)胞的相對(duì)體積，而點(diǎn)離右方垂直基線的距離表示相對(duì)濁度。正常白血細(xì)胞(WBC)(在去掉紅血細(xì)胞后)的圖呈現(xiàn)三個(gè)點(diǎn)簇，分別表示三個(gè)不同的種群，這是因?yàn)樗鼈兊拇笮『蛢?nèi)部成份有本質(zhì)的不同而引起的。如果需要的話，可以用適當(dāng)?shù)碾娐穼?duì)這些種群進(jìn)行計(jì)數(shù)，得到每一種群的細(xì)胞數(shù)。依據(jù)這些固有的差別就可以對(duì)這些細(xì)胞進(jìn)行分類。
起初柯?tīng)柼仉娮游⒘鞲性碛脕?lái)對(duì)紅血細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，而后用來(lái)確定紅血細(xì)胞的一些其它參數(shù)，這就較為復(fù)雜一些。將紅血細(xì)胞從全外周血中除去后，只要除去紅血細(xì)胞的過(guò)程並不顯著地?fù)p害所留下的待測(cè)白血細(xì)胞種群的性質(zhì)，就可著手對(duì)白血細(xì)胞的種群進(jìn)行分析。為此開(kāi)發(fā)了各種紅血細(xì)胞的溶胞劑，這些溶胞劑雖然很有用，而且廣泛地使用著，但對(duì)于接著測(cè)定白血細(xì)胞來(lái)說(shuō)並不是一切都令人滿意的。
上述單使用直流體積或使用在各個(gè)角度上光的散射進(jìn)行白血球流式分析的方法就可以顯示出三簇白血球，分別相應(yīng)于淋巴細(xì)胞，單核細(xì)胞和粒性白細(xì)胞。粒性白細(xì)胞包括嗜中性、嗜堿性和嗜酸性這三個(gè)種群。根據(jù)一些樣品能對(duì)嗜酸性種群的濃度作一個(gè)粗略而有用的估計(jì)。對(duì)于這種方法來(lái)說(shuō)，第五主要種群相對(duì)說(shuō)來(lái)是太小了。采用專門(mén)的熒光技術(shù)也已觀察到過(guò)一簇清晰的嗜酸性種群。
這些熒光技術(shù)已用于諸如柯?tīng)柼毓镜腅pICS血細(xì)胞流式計(jì)數(shù)器之類的血細(xì)胞流式計(jì)數(shù)儀器。此類儀器應(yīng)用了細(xì)胞在鞘流限定的一個(gè)氣柱中以排成一個(gè)單列逐個(gè)通過(guò)激光束的方式運(yùn)動(dòng)的原理。從細(xì)胞來(lái)的光散射信號(hào)和/或熒光信號(hào)就用來(lái)對(duì)細(xì)胞的種群進(jìn)行分類。染有吸水性染料或熒光染料的細(xì)胞使有可能對(duì)附加的細(xì)胞種群進(jìn)行分類。自動(dòng)多參數(shù)分析的測(cè)試設(shè)備和熒光染料的這種進(jìn)展由R.C。里夫等人在臨床化學(xué)(1977年卷23，1492-1498頁(yè))中作了進(jìn)一步說(shuō)明。這些進(jìn)展將同時(shí)進(jìn)行白血球種群分類數(shù)擴(kuò)展為四個(gè)，即淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞、嗜酸性細(xì)胞和“粒性細(xì)胞”(包括嗜中性細(xì)胞和嗜堿性細(xì)胞)。
近來(lái)的血液學(xué)分析儀器已經(jīng)綜合應(yīng)用光散射技術(shù)和細(xì)胞的過(guò)氧化酶(吸水性染料)染色技術(shù)，以區(qū)分五種不同的白血球。并且，配有諸如單克隆抗體之類具有特殊反應(yīng)的生物分子的染料已經(jīng)將白血球分類數(shù)增加到能夠進(jìn)行功能細(xì)分的程度。
一種改進(jìn)的單獨(dú)的自動(dòng)儀器和使用這種儀器的方法在原先的專利申請(qǐng)(美國(guó)序號(hào)025，345，1987年3月13日存檔，題為“篩選表征所選特性進(jìn)行種群計(jì)數(shù)的細(xì)胞或成形體的自動(dòng)分析器和方法”)有所說(shuō)明。這個(gè)原先申請(qǐng)綜合應(yīng)用了電子傳感孔徑原理、用來(lái)對(duì)所規(guī)定的細(xì)胞種群或成形體進(jìn)行識(shí)別和/或計(jì)數(shù)的所選生物分子的特點(diǎn)以及微粒技術(shù)。這種自動(dòng)分析器能結(jié)合特殊的溶胞劑和/或附著在具有不同成分的微球或載體的抗體一起使用。
具有選擇吸附能力的細(xì)微粒子使有可能修改與至少一個(gè)種群的原來(lái)位置相應(yīng)的參數(shù)。把大量細(xì)微粒子加到所選目標(biāo)種群上會(huì)影響所測(cè)體積和/或濁度，結(jié)果使表示一個(gè)種群的那些點(diǎn)的位置發(fā)生偏移。
特性已知的抗體用來(lái)包覆細(xì)微粒子。包覆后的粒子就能吸附在一定的細(xì)胞上，這種細(xì)胞呈現(xiàn)在該抗體專門(mén)作用的抗原。這些被包覆或經(jīng)標(biāo)記的細(xì)胞是粒子與細(xì)胞的組合體，猶如一個(gè)新的整體一樣。這個(gè)新整體的濁度參數(shù)、體積參數(shù)、或濁度和體積這二個(gè)參數(shù)都可以看成表示細(xì)胞和粒子二者對(duì)所得信號(hào)共同作用的結(jié)果。如果成分的特性不同，則新的整體將移動(dòng)到一個(gè)與凈效應(yīng)相應(yīng)的新位置。與只是細(xì)胞情況下的原來(lái)位置比較，這新位置應(yīng)該能用來(lái)對(duì)諸如此類的新整體或新整體群進(jìn)行分類。如果附著在細(xì)胞上的粒子是磁性粒子，按這時(shí)粒子的特性，當(dāng)然可用磁鐵來(lái)吸獲這新整體。如果混合得很快，就會(huì)出現(xiàn)一些出乎意料的結(jié)果，其中包括完全捕獲一個(gè)種群而對(duì)所要研究的細(xì)胞特性並無(wú)不良影響。
從一個(gè)血樣中僅有三個(gè)不同的細(xì)胞種群能容易地加以識(shí)別和計(jì)數(shù)，這利用了這三個(gè)種群的與以上所述直流體積和濁度參數(shù)有關(guān)的固有獨(dú)特性質(zhì)。為了能對(duì)更多的種群進(jìn)行檢測(cè)和計(jì)數(shù)，必須采取一些諸如改善溶胞系統(tǒng)的附加措施。當(dāng)然，這些后來(lái)補(bǔ)充的種群是淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞和粒性細(xì)胞這三個(gè)基本種群的子種群。根據(jù)先驅(qū)申請(qǐng)所進(jìn)行的各個(gè)步驟說(shuō)明了這三個(gè)基本種群的子種群是怎樣得到的。
結(jié)合二種或更多種生物微粒應(yīng)用那些簡(jiǎn)單的孔徑傳感技術(shù)，就能使表示一給定種群的點(diǎn)簇出現(xiàn)在一個(gè)獨(dú)特的新位置上。由于種群在點(diǎn)標(biāo)圖或散布圖上的這種有選擇的運(yùn)動(dòng)是可以復(fù)現(xiàn)的，因此就能用來(lái)對(duì)從三個(gè)基本種群中分離出來(lái)的一個(gè)種群進(jìn)行分類。
通過(guò)把微粒附著在所選定的各個(gè)細(xì)胞上，就能調(diào)整直流體積和濁度傳感技術(shù)原來(lái)固有的結(jié)合方式。用作微粒表面涂覆的生物分子(其中包括抗體)的性質(zhì)和特殊性能賦予這些微粒具有選擇能力。單是一個(gè)種群的細(xì)胞，如果其表面沒(méi)有微粒，可能占據(jù)一個(gè)與其它種群或子種群沒(méi)有什么不同的點(diǎn)標(biāo)圖位置，因而不能互相區(qū)分。用這種方法能把具有選擇附著能力的微粒加到我們所要識(shí)別、計(jì)數(shù)和研究的一個(gè)具體種群的細(xì)胞上去。把足量的具有選擇能力的微粒有選擇地加到所關(guān)心的一個(gè)種群上去，由于質(zhì)量、體積和濁度的這種新的獨(dú)特的結(jié)合，導(dǎo)致那個(gè)種群在點(diǎn)標(biāo)圖上的位置發(fā)生偏移。
把具體的細(xì)胞種群分離開(kāi)來(lái)并不會(huì)對(duì)剩下的細(xì)胞種群的性質(zhì)有很大影響。舉例來(lái)說(shuō)，按本發(fā)明，不是用一直沿用的化學(xué)RBC溶胞劑來(lái)從全血中除去紅血球或紅細(xì)胞(RBC)，這就能測(cè)量T4和/或T8淋巴細(xì)胞。T4和T8細(xì)胞數(shù)的比例已經(jīng)用來(lái)指示與嚴(yán)重的病毒感染(包括愛(ài)滋病毒及其它一些病毒)一致的免疫缺乏癥。細(xì)胞表面存在著特殊的受體，這可用來(lái)把一個(gè)種群劃分成一些子種群。對(duì)這些子種群進(jìn)行計(jì)數(shù)就可檢測(cè)疾病的發(fā)作。例如，白血病的主要形式是外周血液淋巴細(xì)胞的急劇增加。如果快速增殖淋巴細(xì)胞的子種群具有T11受體，那么這個(gè)患者就有免疫不正常的危險(xiǎn)。
此外，如果T11陽(yáng)性淋巴細(xì)胞的子種群具有T4受體，則這個(gè)患者劃為通常在日本發(fā)生的那一類病人。更進(jìn)一步，如果T4受體子種群擴(kuò)展為2H4陽(yáng)性，則說(shuō)明病人不僅有多種感染的趨勢(shì)，而且患有嚴(yán)重的白血病。因?yàn)門(mén)11、T4、2H4陽(yáng)性細(xì)胞是抑制的誘導(dǎo)體，從功能上抑制了病人產(chǎn)生抗體的能力。因此這病人受到多種感染，必須進(jìn)行白血病和免疫缺乏治療(參見(jiàn)K.Takatsuki，etal，GANNmonograPhonCancerResearch2813-22，1982;C.Morimoto，etal，CoulterJapanSymPosium，1984;C.Morimoto，etal，Immunology134(3)1508-1515，1985;C.Morimoto，etal，NewEnglandJournalofMedicine316(2)67-71，1987)。本發(fā)明還可用于對(duì)懷疑為諸如細(xì)菌、包括病毒之類的成形體的分析。
體現(xiàn)本發(fā)明的方法和設(shè)備可以與諸如涉及反應(yīng)物和成形體或細(xì)胞的免疫反應(yīng)之類的各種免疫反應(yīng)一起應(yīng)用。在使用時(shí)，細(xì)胞定義成動(dòng)物細(xì)胞和植物細(xì)胞，這兩種細(xì)胞可以分別或一起加以識(shí)別。細(xì)胞是能作為一個(gè)獨(dú)立單元活動(dòng)的活體的最小結(jié)構(gòu)體。例如，人體的RBC和WBC種群、從組織或血樣中產(chǎn)生的癌或其它不正常細(xì)胞都是。成形體定義為可能含有附著物的細(xì)菌、病毒和霉菌。本發(fā)明也可用于對(duì)病人的診斷、監(jiān)護(hù)和治療。特別是，本發(fā)明能用來(lái)除去或移動(dòng)一些種群，以便分析那些不這樣就不易識(shí)別的種群或子種群。有理由可以相信，那些適于加標(biāo)的細(xì)胞或成形體能用本發(fā)明的方法和設(shè)備以與人體血細(xì)胞的例子相同的方式加以敏感。無(wú)論是否有附著物，均可敏感到參數(shù)的變化。
本發(fā)明提供了一種單獨(dú)的多用途分析器和使用該分析器的方法。該分析器結(jié)合了電子微粒傳感技術(shù)和具有選擇能力的生物分子的特殊性能，大大促進(jìn)了臨床實(shí)驗(yàn)室使用和工業(yè)應(yīng)用的自動(dòng)分析器領(lǐng)域的發(fā)展。人體外周血液中的多種白細(xì)胞子種群及其相互關(guān)系的檢測(cè)對(duì)醫(yī)學(xué)研究和人體疾病診斷是十分重要的。這些數(shù)據(jù)作為對(duì)諸如白血病之類的疾病進(jìn)行識(shí)別和分類的手段非常有用。由采用本發(fā)明而識(shí)別出來(lái)的不正常情況給診斷提供了有關(guān)分析信息，分析范圍並不只限于檢測(cè)白細(xì)胞種群，正如本發(fā)明的說(shuō)明和附圖所示。
本發(fā)明的一個(gè)極有價(jià)值的特點(diǎn)是應(yīng)用了單獨(dú)、穩(wěn)定的柯?tīng)柼貍鞲胁僮?。這種操作十分穩(wěn)定，而且不需要復(fù)雜、昂貴的光學(xué)系統(tǒng)。附加RF振蕩器和檢測(cè)器所需的電路裝置非常經(jīng)濟(jì)、緊湊和可靠。所需的就只是一個(gè)單一孔徑，但再加一個(gè)第二孔徑或甚至第三孔徑能很經(jīng)濟(jì)地提高樣本通過(guò)速率。
本發(fā)明提供了一種篩選計(jì)數(shù)種群的細(xì)胞或成形體以識(shí)別這些細(xì)胞或成形體所呈現(xiàn)的特征和性質(zhì)的方法和設(shè)備。從全血樣或從去除紅血細(xì)胞和/或白血細(xì)胞的種群的樣品中能將白血細(xì)胞的多個(gè)部分或五個(gè)部分區(qū)分開(kāi)來(lái)。可以將全血樣或部分血樣進(jìn)行篩選，以提供一種WBC種群或至少其一個(gè)WBC種群子集的直接分析。從樣品中除去或預(yù)先除去RBC種群，這並不會(huì)對(duì)WBC種群及其子集的有關(guān)特性產(chǎn)生多大影響。
改變至少是有關(guān)WBC種群子集的體積和/或濁度參數(shù)，這樣至少該種群和子集就可用電子方法加以分析，以確定該WBC種群的至少一個(gè)特征。因此至少一個(gè)WBC種群子集在種群和子集分析前從樣品中可以首先去掉。通過(guò)將大小不同的微球貼附到二個(gè)不同的子集就可以同時(shí)改變這二個(gè)子集。此外，可將多種微球附著到有關(guān)WBC子集的各細(xì)胞上。這些程序因此就提供了包括對(duì)所要求的子集的直接WBC分析，而並不使用光學(xué)技術(shù)。
因此，本發(fā)明的第一個(gè)目的是提供一種從其中具有至少一些白血細(xì)胞種群、至少一個(gè)具有至少一個(gè)子集的白血細(xì)胞種群的至少是部分全血樣中得到至少一種白血細(xì)胞種群分析的方法，該方法的特征是改變有關(guān)白血細(xì)胞種群的至少一個(gè)白血細(xì)胞種群的子集的體積和/或濁度參數(shù)、用電子方法對(duì)所改變的白血細(xì)胞種群子集和所選有關(guān)白血細(xì)胞種群進(jìn)行分析，從而確定該所選白血細(xì)胞種群的至少一個(gè)特征。
本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供一種從其中具有至少一些白血細(xì)胞種群、至少一個(gè)具有至少一個(gè)子集的白血細(xì)胞種群的至少是部分全血樣中得到至少一種白血細(xì)胞種群分析的設(shè)備，該設(shè)備的特征是具有改變有關(guān)白血細(xì)胞種群的至少一個(gè)白血細(xì)胞種群的子集的體積和/或濁度參數(shù)的裝置，以及具有用電子方法對(duì)所改變的白血細(xì)胞種群的子集和所選有關(guān)白血細(xì)胞種群進(jìn)行分析從而確定該所選白血細(xì)胞種群的至少一個(gè)特征的裝置。
本發(fā)明的所推薦的具體裝置將參照說(shuō)明附圖予以舉例說(shuō)明。這些附圖有

圖1-13說(shuō)明原先申請(qǐng)025，345中披露的具體裝置;
圖1為原先申請(qǐng)的一種細(xì)胞種群分析器具體裝置的原理方框圖;
圖2為原先申請(qǐng)的第二種分析器具體裝置的原理方框圖;
圖3為與圖1和圖2相應(yīng)的先驅(qū)申請(qǐng)的一種具體的分析器的具體裝置;
圖4為原先申請(qǐng)的另一種分析器具體裝置的原理方框圖;
圖5A和5B為用類似于圖2和圖3所示分析器系統(tǒng)樣機(jī)得到的一組結(jié)果的點(diǎn)散布圖;
圖6為原先申請(qǐng)的又一種分析器具體裝置的原理方框圖;
圖7為原先申請(qǐng)的再一種分析器具體裝置的原理方框圖;
圖8A和8B、圖9A和9B、圖10A和10B以及圖11A和11B為用類似于圖6和圖7所示的分析器系統(tǒng)樣機(jī)得到的一組結(jié)果的散布圖;
圖12為原先申請(qǐng)的又一種分析器具體裝置的原理方框圖;
圖13為用類似于圖12所示的分析器系統(tǒng)樣機(jī)得到的一組結(jié)果的散布圖;
圖14-26D是對(duì)于本發(fā)明的一些具體裝置的;
圖14為本發(fā)明的一種WBC種群子集分析器具體裝置的原理方框圖;
圖15為本發(fā)明的WBC種群子集分析器具體裝置的另一個(gè)原理方框圖;
圖16為與圖14和15相應(yīng)的本發(fā)明一種具體分析器的具體裝置;
圖17A和圖17B為用類似于圖3和圖16所示的分析器系統(tǒng)樣機(jī)得到的一組結(jié)果的散布圖;
圖18A為用類似圖16所示的分析器系統(tǒng)樣機(jī)所得到的L、M和G種群的散布圖，而圖18B為所得到的L、M和B種群的散布圖;
圖19A-D、20A-D和21A-D為不同患者血樣的CD4、CD8、CD2和CD20子種群的散布圖;
圖22A為類似于圖18A散布圖的散布圖，圖22B為說(shuō)明E和N種群偏移的散布圖，而圖22C為說(shuō)明E、N和CD4種群偏移的散布圖;
圖23A-D為說(shuō)明使用一種附著于有關(guān)WBC子集的微球和附著于第一種微球的第二種微球進(jìn)行直接WBC子集分析的散布圖。
圖24A-C為說(shuō)明在本發(fā)明的偏移分析中所使用的微球大小的影響的散布圖;
圖25A-D為說(shuō)明采用本發(fā)明技術(shù)同時(shí)對(duì)二個(gè)WBC子種群進(jìn)行分析的散布圖;以及圖26A-D為根據(jù)不同參數(shù)的散布圖所說(shuō)明的相同種群的散布圖。
圖1-13說(shuō)明原先申請(qǐng)025，345的具體裝置。
參照?qǐng)D1，體現(xiàn)原先申請(qǐng)(序號(hào)025，345)的細(xì)胞種群分析方法和設(shè)備的第一種具體裝置簡(jiǎn)標(biāo)以數(shù)字10。分析器10包括含有至少第一批活的生物細(xì)胞(未示出)的生物樣品12，諸如在全血樣中或從全血樣中取出的細(xì)胞。生物樣品12的細(xì)胞在進(jìn)行定量和/或定性測(cè)定或分析時(shí)要參加生物反應(yīng)。生物樣品12可以含有緩沖劑，細(xì)胞就加進(jìn)這種緩沖劑里。
經(jīng)通路14的樣品12與經(jīng)通路18的至少一種反應(yīng)劑16混合。然后，由功能上指定為去除RBC的場(chǎng)所20將紅血細(xì)胞(RBC)從混合物中除去。場(chǎng)所20可以用好幾種方法從混合物中除去RBC。反應(yīng)劑16中的溶胞劑可以將RBC溶胞。一種這樣的優(yōu)選溶胞劑和可以隨同使用的抑制劑在1987年12月歸檔、題為“用于從全血樣中分離、識(shí)別和/或分析白血球的方法和反應(yīng)劑系統(tǒng)”序號(hào)為130，911的專利(為1987年3月13日歸檔、序號(hào)為025，303的CIP、標(biāo)題相同)中有所說(shuō)明，該專利在此收作參考。反應(yīng)物16可以是或可以含有許多帶抗體的磁性微球，這種抗體是專門(mén)對(duì)RBC的，附著在RBC上(未示出)。在這個(gè)例子中，所用的具體的紅血細(xì)胞專用抗體在1985年11月19日歸檔題為“用來(lái)分離人體外周血液中白血球的單克隆抗體以及回收使用所述單克隆抗體的方法”的申請(qǐng)799，489中有所說(shuō)明，該申請(qǐng)?jiān)诖耸兆鲄⒖?。反?yīng)劑16除了樣品緩沖劑還可以有一種緩沖劑，或者這種緩沖劑可以代替樣品緩沖劑。反應(yīng)劑16還能是優(yōu)選RBC溶胞劑和RBC專用微球的組合。
一旦RBC基本上從混合物中除去，一部分混合物就通過(guò)通路24送到白血細(xì)胞(WBC)分析器22。WBC分析器22至少要對(duì)混合物中的WBC進(jìn)行計(jì)數(shù)。WBC分析器22也能測(cè)量WBC的一個(gè)或多個(gè)體積或濁度參數(shù)。由分析器22所得出的結(jié)果經(jīng)通路28送至比較器26。
已除去紅血球的混合物的第二部分經(jīng)通路32送到除去WBC子集的場(chǎng)所30。白血球子集可以用許多方法從混合物中除去?？梢詫в袑ｉT(mén)對(duì)WBC某一子集、附著在上面的單克隆抗體的微球加到混合物里。非磁性微球就能粘到WBC上，改變或移動(dòng)這些細(xì)胞的合成濁度或體積參數(shù)。磁性微球也能粘到WBC上，這樣用一個(gè)磁場(chǎng)就可從混合物中將這些WBC除去。
已除去WBC子群或已改變一個(gè)或幾個(gè)參數(shù)的混合物然后就經(jīng)通路36送到WBC子集分析器34。分析器34可以與分析器22完全相同。然后，分析器34所得到的結(jié)果經(jīng)通路38送到比較器26。比較器26能把分析器22送來(lái)的WBC結(jié)果與分析器34送來(lái)的經(jīng)改變的結(jié)果加以比較，確定所選的白血細(xì)胞種群的至少一個(gè)特征(如在某一特定范圍內(nèi)的細(xì)胞數(shù))。
參照?qǐng)D2，體現(xiàn)先驅(qū)申請(qǐng)的細(xì)胞種群分析方法和設(shè)備的第二個(gè)具體裝置簡(jiǎn)標(biāo)為參考數(shù)40。分析器40包括也含有至少一個(gè)首批活的生物細(xì)胞(未示出)的生物樣品42，如在全血樣中或從全血樣中取出的細(xì)胞。生物樣品42的細(xì)胞在進(jìn)行定量和/或定性測(cè)定或分析時(shí)要參加生物反應(yīng)。樣品42中也可能有緩沖劑，細(xì)胞就加進(jìn)這緩沖劑中。
經(jīng)通路44，樣品42與經(jīng)通路48來(lái)的至少一種反應(yīng)物46混合。在分析器40中，由功能指定為除去RBC和移動(dòng)WBC的場(chǎng)所50從混合物中除去RBC，並同時(shí)改變或移動(dòng)至少一個(gè)WBC子集的至少一個(gè)特征。如上所述，該場(chǎng)所可以用許多方法來(lái)除去混合物中的RBC，這在前面就場(chǎng)所20已經(jīng)例舉了。同時(shí)在這同一混合物部分WBC被粘到一般說(shuō)來(lái)是非磁性的微球上，改變或移動(dòng)了細(xì)胞的合成濁度和/或體積參數(shù)。
然后，已除去RBC和已移動(dòng)WBC子種群的混合物經(jīng)通路54送至分析器52。分析器52可以與分析器22大體相同。因此，分析器40對(duì)所選WBC種群或WBC子集的至少一個(gè)特征提供了快速直接的分析。
體現(xiàn)原先申請(qǐng)并能完成第一和第二分析器10和40的分析方法的分析設(shè)備的詳細(xì)具體裝置在圖3中簡(jiǎn)標(biāo)為參考數(shù)56。
在設(shè)備56中，只例示了一種具體的計(jì)數(shù)。按原先申請(qǐng)的原理可以作出幾乎無(wú)數(shù)的改變。并且，對(duì)設(shè)備56的說(shuō)明只是一般性的功能情況，而詳細(xì)的具體裝置的結(jié)構(gòu)可以用許多眾所周知的方法來(lái)實(shí)現(xiàn)。
設(shè)備56包括一個(gè)用來(lái)將有關(guān)生物樣品(如樣品12或42)抽入設(shè)備56的抽氣泵機(jī)構(gòu)58。抽氣機(jī)58經(jīng)通路60與連到采樣頭63的采樣閥62相連。溶胞劑泵64可以含有如同部分反應(yīng)劑18或46那樣的溶胞劑，而且經(jīng)通路66也與閥62相連。在適當(dāng)?shù)臅r(shí)候，閥62和泵58能吸取生物樣品12或42以及經(jīng)泵64送來(lái)的溶胞劑。
然后，反應(yīng)劑混合物或生物樣品本身經(jīng)泄放通路68送到混合裝置70。混合裝置70包括送入樣品或反應(yīng)劑的混合艙72。在這一點(diǎn)上，分析器10和40的工作情況不一樣，因此將分別說(shuō)明。
對(duì)于分析器10來(lái)說(shuō)，如果RBC已經(jīng)被來(lái)自泵64的溶胞劑溶胞，則在反應(yīng)結(jié)束時(shí)，從場(chǎng)所74經(jīng)通路76提供抑制劑或停溶劑。通過(guò)對(duì)艙72內(nèi)的溶胞劑和樣品的攪拌可以促進(jìn)反應(yīng)，如在78所示功能。
在此能采用的合適的混合裝置70的具體細(xì)節(jié)在1987年3月13日歸檔、題為“增強(qiáng)生物反應(yīng)的小容量高速混合的方法和裝置”、序號(hào)025，337中有所說(shuō)明，在此收作參考。由于使用混合器70，反應(yīng)速度大為提高，但并不顯著損害細(xì)胞內(nèi)我們所關(guān)心的一些特性，這在諸如提高反應(yīng)溫度就會(huì)發(fā)生。此外，反應(yīng)通常可以在遠(yuǎn)短于1分鐘的時(shí)間內(nèi)完成，一般大致為15秒或更短。這使自動(dòng)化程度高的體積分析設(shè)備56能夠進(jìn)行高速分析。
然后，被溶胞劑除去RBC並且已經(jīng)停止反應(yīng)的反應(yīng)劑(當(dāng)從場(chǎng)所20送出時(shí))經(jīng)通路80送到容納艙82，在這種情況下，該艙將容納第二部分混合物。第一部分混合物將從艙82經(jīng)通路84送至WBC分析器86(即分析器22)。按照瓦勒斯。H.柯?tīng)柼卦诿绹?guó)專利2，656，508中說(shuō)明的以及體現(xiàn)在柯?tīng)柼仉娮庸敬淼拇罅可逃醚?xì)胞計(jì)數(shù)器中的計(jì)數(shù)和測(cè)量大小的技術(shù)，分析器86可以具有許多實(shí)際形式。
通常，分析器86包括一個(gè)流式傳感器或傳感艙88。艙88包括一個(gè)具有一個(gè)穿通的孔徑92的變換器90。艙88包括一個(gè)具有與那里的流體進(jìn)行接觸的第一電極96的第一艙段94。
艙段94和電極96通過(guò)孔徑92與其中具有第二電極100的第二艙段98相聯(lián)系。電極96和100經(jīng)反應(yīng)引線102和104與RF/DC電源和傳感電路106相連。電路106將直流(或低頻電流或信號(hào))和高頻信號(hào)耦合到電極96和100之間。
低頻信號(hào)用來(lái)敏感由通過(guò)孔徑92的一個(gè)細(xì)胞所引起的信號(hào)脈沖的振幅。高頻信號(hào)用來(lái)獲得通過(guò)孔徑92的同一個(gè)細(xì)胞的電濁度。
瓦勒斯.H.柯?tīng)柼睾屯郀柼?R.霍克在美國(guó)專利3，502，974和此后的幾個(gè)專利以及柯?tīng)柼仉娮庸敬淼某霭嫖镏袑?duì)測(cè)量細(xì)胞的電濁度作了說(shuō)明。一種能在這里應(yīng)用的具體電路在題為“測(cè)量微粒的電阻和電抗的微粒分析器”的案例168，008中有所說(shuō)明，該案例在1986年10月21日歸檔，現(xiàn)為美國(guó)序號(hào)921，654，在此收作參考。
由電路106從受感細(xì)胞產(chǎn)生的信號(hào)經(jīng)DC信號(hào)引線108和RF信號(hào)引線110耦合到比較器112(與比較器26相似)。比較器112能保持從第一部分，亦即沒(méi)有減去WBC子集的那部分，產(chǎn)生的信號(hào)，以便與從所說(shuō)明的第二部分得到的結(jié)果相比較。
分析器86能包括一個(gè)以眾所周知的方式將細(xì)胞聚集到傳感器88的鞘流。這鞘流可由射流系統(tǒng)114提供，經(jīng)一對(duì)通路116和118以眾所周知方式耦合到傳感器88。樣品反應(yīng)混合物能經(jīng)導(dǎo)入管120送入傳感器88，也能經(jīng)排出管122從傳感器88排放到容廢器124。
當(dāng)?shù)谝徊糠只旌衔镎诜治銎?6內(nèi)進(jìn)行分析時(shí)，第二部分混合物就保持在艙82內(nèi)，而混合器72由清洗通路126清洗，通過(guò)排廢通路128排干。一旦艙72清洗完畢，第二部分經(jīng)通路130送回到艙72。像場(chǎng)所30一樣，現(xiàn)在通過(guò)經(jīng)通路134、閥136和艙通路138加入由場(chǎng)所132送出的WBC微球體的方法把WBC子集減去。
混合機(jī)構(gòu)78將WBC微球體與第二部分混合。如WBC微球體是非磁性的，則帶有被粘WBC微球體的反應(yīng)混合物經(jīng)通路80、艙82和通路84送入分析器86(即分析器34)，在那里對(duì)第二部分進(jìn)行類似對(duì)第一部分那樣的分析。然后，結(jié)呆在比較器112(即比較器26)內(nèi)進(jìn)行比較。在第二部分中粘有微球體的WBC子集至少一個(gè)WBC子集改變了細(xì)胞參數(shù)(如細(xì)胞濁度)，以提供改變了的結(jié)果，然后能對(duì)這結(jié)果進(jìn)行分析。
如果這種WBC微球體是磁性的，則粘在這上面的WBC子集在混合過(guò)程中和/或混合以后用一個(gè)磁場(chǎng)或磁鐵140除去。磁場(chǎng)可由相對(duì)艙72作機(jī)械運(yùn)動(dòng)的電磁裝置或磁鐵140產(chǎn)生，以捕獲粘在磁性微球體上的WBC子集。然后，除去了所粘的WBC子集的第二部分經(jīng)通路80、艙82和通路84送到分析器86(類似分析器34)，其方式與上述相同，以便進(jìn)行分析。
設(shè)備56隨后就為取下一次分析樣品作準(zhǔn)備。探頭63可由探頭清洗機(jī)構(gòu)142清洗，而一些通路和艙72、82能方便地加以沖洗。對(duì)一個(gè)接一個(gè)的樣品混合物的各種分析都是自動(dòng)快速進(jìn)行的。接連二個(gè)樣品混合物分析的間隔能夠達(dá)到大致幾分鐘或更短一些。
在操作分析設(shè)備56時(shí)，與分析器40類似，含有RBC溶胞劑/反應(yīng)劑46和樣品42的反應(yīng)混合物在艙72內(nèi)與來(lái)自場(chǎng)所132的非磁性WBC微球體混合，這些微球體就粘到一個(gè)WBC子集上。將抑制劑74加到反應(yīng)混合物，然后經(jīng)通路80、艙82和通路84將這混合物送到分析器86(類似于分析器52)進(jìn)行分析。
如果不用溶胞劑，無(wú)論是在分析器10還是40中，樣品12或42可以經(jīng)閥62送到混合器70，不帶任何溶胞劑。在這種情況下，可以利用上面粘有RBC專用抗體的微球體以磁力除去RBC。這些微球體從RBC微球體場(chǎng)所144經(jīng)通路146所到閥136，再經(jīng)通路138送到艙70。那里沒(méi)有溶胞劑，混合后被粘住的RBC用磁鐵140以磁力去除，其方式大致與前面所述以磁力去除被粘住的WBC相同。
此外，為了提高反應(yīng)速度，可以用既含RBC溶胞劑又含RBC磁性微球體的樣品反應(yīng)混合物。將反應(yīng)混合物攪拌，抑制溶胞;再以磁力去除被粘住的RBC，然后進(jìn)行如上所述的WBC分析。
現(xiàn)在參照?qǐng)D4，體現(xiàn)原先申請(qǐng)的細(xì)胞種群分析方法和設(shè)備的另一種具體裝置簡(jiǎn)標(biāo)以參考數(shù)148。分析器148包括生物樣品150，這生物樣品也至少含有第一批活的生物細(xì)胞(如在全血樣中或從全血樣中取出的細(xì)胞)。樣品150也可以含有緩沖劑，細(xì)胞加在緩沖劑內(nèi)。
經(jīng)通路152樣品150與經(jīng)通路156來(lái)的至少一種反應(yīng)物154混合。然后，如前所述，RBC由功能指定為去除RBC的場(chǎng)所158除去。去除了RBC后的反應(yīng)混合物經(jīng)通路160送到WBC分析器162。分析器162得出的結(jié)果經(jīng)通路166送到比較器164，提供了具有對(duì)單核細(xì)胞(M)、淋巴細(xì)胞(L)和粒性細(xì)胞(G)的結(jié)果的三種WBC的差別。
然后，混合物經(jīng)通路170送到具有去除嗜中性(N)功能的場(chǎng)所168。用移動(dòng)或改變一個(gè)參數(shù)(如濁度)的方法或用磁力除去的方法從混合物中移去N，這二種方法均如上述。在這個(gè)例子中，所用的具體的N專用抗體在案例168，306、題為“專用于嗜中性細(xì)胞的單克隆抗體”、1986年12月8日歸檔、現(xiàn)為美國(guó)序號(hào)938，864中有所說(shuō)明。
已除去或已移動(dòng)N的混合物然后就經(jīng)通路174送到另一個(gè)WBC分析器172。分析器172得到的結(jié)果經(jīng)通路176送到比較器164。分析器172的結(jié)果用來(lái)獲得四種WBC的差別，仍有對(duì)M和S的結(jié)果，但現(xiàn)在由于N被除去或移動(dòng)，還有對(duì)嗜酸性(E)和嗜堿性(B)所得到的結(jié)果。分析器162和172得出的二個(gè)分析結(jié)果然后由比較器164加以比較，以便形成五種WBC的差別。具體地說(shuō)，從G的數(shù)目中減去B和E的數(shù)目就得出被移去的N的數(shù)目。
現(xiàn)在參照?qǐng)D5A和5B，這二個(gè)圖是用類似于分析器148的典型分析方法從全血樣中得到的結(jié)果的散布圖。生物樣品150是20微升的全血樣，該血樣與摻有140微升緩沖溶液以形成反應(yīng)劑154的40微升上面粘有RBC專用抗體的磁性微球體混合。反應(yīng)混合物攪拌15秒后在場(chǎng)所158中的磁場(chǎng)里放置10秒鐘。除去了RBC的混合物由分析器162進(jìn)行分析，結(jié)果如圖5A的散布圖所示，該數(shù)為L(zhǎng)為45.6(1)，M為5.6(2)，G為48.7(3)。
然后，混合物在場(chǎng)所168中與10微升粘有N專用抗體的磁性微球體混合，該混合物在攪拌30秒后在磁場(chǎng)中放置10秒。再將除去了N的混合物送到分析器176，形成圖5B的散布圖，結(jié)果該數(shù)是L為81.0(1)，M為0.6(2)，E為11.0(3)，B為1.8(4)。然后，比較器164給出五種WBC差別，該數(shù)是45.6L，5.6M，41.6N，6.0E及1.2B。這與用作將載片上的樣品染色計(jì)數(shù)的讀數(shù)44.0L，3.4M，45.0N，6.1E及0.4B的標(biāo)準(zhǔn)顯示W(wǎng)BC差別相應(yīng)。
圖6為體現(xiàn)原先申請(qǐng)的細(xì)胞種群分析方法和設(shè)備的又一種具體裝置，簡(jiǎn)標(biāo)以178。分析器178包括生物樣品180，這生物樣品也是至少含有第一批活的生活細(xì)胞，也可以包括一種緩沖劑。
經(jīng)通路182，樣品180與經(jīng)通路186來(lái)的反應(yīng)物184混合。功能上說(shuō)明如下混合物的第一部分經(jīng)通路188送到具有去除RBC和N功能的場(chǎng)所190。用如前所述的方式除去或移動(dòng)RBC和N，而后，這第一部分經(jīng)通路192送到WBC分析器194。
這提供了由分析器194經(jīng)通路196送到比較器198的一個(gè)結(jié)果。這結(jié)果含有上面所指的包括M、L、E和B的這四種的差別。
同時(shí)，樣品180的第二部分和反應(yīng)物184的混合物經(jīng)通路200送到具有除RBC功能的場(chǎng)所202。除去了RBC后的混合物經(jīng)通路204送到另一個(gè)WBC分析器206，分析器206得出的結(jié)果經(jīng)通路208送到比較器198。分析器206得出的結(jié)果只包括上面所指的M、L和G這三種WBC的差別。比較器198比較分析器194和206送來(lái)的結(jié)果，從而得出五種WBC的差別。
體現(xiàn)分析器178的方法和設(shè)備的一個(gè)具體的分析設(shè)備在圖7中簡(jiǎn)稱以210。此外，只示出了一種具體的硬件計(jì)數(shù)，但與分析設(shè)備56一樣，分析設(shè)備210可用各種不同結(jié)構(gòu)形式來(lái)實(shí)現(xiàn)。
設(shè)備210包括一個(gè)由通路216連到采樣閥214的抽氣泵機(jī)構(gòu)212。閥214可以包括采樣頭218以抽取有關(guān)生物樣品(如樣品180)。稀釋劑輸送泵220由通路222連到閥214，以便在需要的時(shí)候?yàn)橹T如全血樣之類的樣品提供稀釋劑。而后混合物的第一部分經(jīng)通路224和通路226送到第一混合裝置228。同時(shí)，混合物的第二部分經(jīng)通路224和230送到第二混合裝置232。
混合器228(相當(dāng)于場(chǎng)所190)大體上與混合器232(相當(dāng)于場(chǎng)所202)相同，將予首先說(shuō)明。混合器228包括一個(gè)混合艙234，混合物的第一部分就送到這個(gè)艙內(nèi)?；旌掀?28包括所有上述各種選擇方案，如果需要可以包括RBC溶胞劑的溶胞劑輸入通路236。
如果采用溶胞劑，則在236所示的功能進(jìn)行混合后，經(jīng)抑制劑通路240加入抑制劑。同時(shí)，通過(guò)加入粘有N專用抗體的合適的磁性或非磁性微球體來(lái)除去N。這種微球體是從微球體源242經(jīng)通路244送入艙234內(nèi)的。如果對(duì)N或RBC用磁性微球體，則要用磁鐵246或磁場(chǎng)以磁力來(lái)除去粘住的細(xì)胞。
已混合和停止溶胞(如果需要的話)的混合物經(jīng)通路248通過(guò)閥250和通路252送到WBC分析器254(即分析器194)。分析器254與分析器86相同，就不再詳細(xì)說(shuō)明。此外，分析器254包括帶有孔徑258的傳感艙256，混合物和細(xì)胞穿過(guò)這個(gè)孔徑。鞘流射流系統(tǒng)260能連到艙256。細(xì)胞所產(chǎn)生的信號(hào)由RF/DC源和傳感電路262檢測(cè)，其輸出送到比較器264，如同前述。
同時(shí)，混合物的第二部分送入混合艙266。在這第二部分中只要除去RBC(即類似于場(chǎng)所202)，RBC能用經(jīng)通路268送入艙266的RBC溶胞劑除去。把溶胞劑與樣品混合，而后經(jīng)抑制劑通路270加入抑制劑?；蛘?，用粘有RBC專用抗體的磁性微球體來(lái)除去RBC，這種微球體是從微球體源272經(jīng)通路274送入艙266內(nèi)的。微球體經(jīng)攪拌混合后(該功能由276完成)用磁鐵278將粘在磁性微球體上的RBC除去。
而后，已除去RBC的混合物經(jīng)通路280送到閥250，再經(jīng)通路252送到分析器254，以便得到以上所提到的結(jié)果?；旌掀?28和232包括相應(yīng)合適的清洗通路282和284以及排廢通路286和288，還包括探頭清洗機(jī)構(gòu)290，以便在吸入下一個(gè)或一些要分析的樣品前清洗設(shè)備210。
圖8A和8B示出了用類似于分析器178的分析方法從一個(gè)全血樣品得到的結(jié)果的散布圖。在這個(gè)例子中，樣品180為20微升的全血，而反應(yīng)物184為40微升的粘有RBC專用抗體的磁性微球體，摻以140微升的緩沖劑溶液?；旌衔锏囊徊糠衷趫?chǎng)所202內(nèi)攪拌20秒，再在磁場(chǎng)內(nèi)放置10秒。然后，除去了RBC的混合物在分析器206內(nèi)進(jìn)行分析，得到圖8A的散布圖，該圖給出讀數(shù)L為29.4(1)，M為8.1(2)，G為62.4(3)。
同時(shí)，相同混合物的另一部分在場(chǎng)所190與10微升的粘有N專用抗體的磁性微球體相混合，以便在場(chǎng)所190除去RBC和N?；旌衔飻嚢?0秒，再在磁場(chǎng)中放置10秒。除去了N和RBC的混合物然后由分析器194進(jìn)行分析，得到圖8B的散布圖，該圖給出的數(shù)L為73.5(1)，M為21.7(2)，E為34.3(3)，B為1.4(4)。這二種讀數(shù)在比較器198內(nèi)進(jìn)行比較，得到五種WBC差別的讀數(shù)L為29.4，M為8.0，N為60.8，E為1.2，B為0.6。並且還與顯微鏡方法測(cè)定的結(jié)果作了比較，其讀數(shù)為L(zhǎng)為29.4，M為5.0，N為65.0，E為1.0，而B(niǎo)小于1。
圖9A和9B為類似于圖8A和8B的五種WBC差別的例子的散布圖的結(jié)果。用圖8A和8B所作說(shuō)明中的步驟對(duì)20微升的全血樣進(jìn)行分析，得到圖9A的散布圖，其讀數(shù)L為35.4(1)，M為14.6(2)，G為50.3(3)。圖9B的散布圖的讀數(shù)L為66.4(1)，M為25.0(2)，E為6.6(3)，B為2.0(4)。所得出的五種WBC差別給出讀數(shù)L為35.4，M為14.6，N為45.5，E為3.5，B為1.1。與此相對(duì)應(yīng)的顯微鏡方法的讀數(shù)L為36，M為11，N為49，E為3，B為1。
圖10A和10B為也類似于圖8A、8B和圖9A、9B的五種WBC差別的散布圖結(jié)果，但在這個(gè)例子中使用了溶胞劑。在這個(gè)例子中，20微升的全血樣與80微升的緩沖物以及240微升的上面所提到的RBC優(yōu)選溶胞物相混合?；旌衔飻嚢?秒以后加入抑制劑。時(shí)間非常關(guān)鍵，因?yàn)榇笥?0秒以后，尚未被抑制的溶胞劑將開(kāi)始對(duì)WBC的性質(zhì)發(fā)生非常顯著的影響。對(duì)除去了RBC的混合物進(jìn)行分析，從而得出圖10A的散布圖，其讀數(shù)為L(zhǎng)為25.7(1)，M為9.6(2)，G為65.0(3)。
含有第二個(gè)20微升全血樣的混合物的第二部分與120微升的緩沖劑和10微升粘有N專用抗體的磁性微球體混合，攪拌30秒后在磁場(chǎng)內(nèi)放置10秒。然后將RBC優(yōu)選溶胞劑加入到除去了N的混合物內(nèi)，在停溶前攪拌6秒。得到的散布10B給出百分比讀數(shù)為L(zhǎng)為74.6(1)，M為21.6(2)，E為2.9(3)，B為0.8(4)。得到的五種WBC差別的百分比讀數(shù)為L(zhǎng)為25.6，M為9.6，N為63.5，E為1.06，B為0.3。用顯微鏡方法得出的讀數(shù)為L(zhǎng)為29.4，M為5.0，N為65.0，E為1.0，而B(niǎo)小于1。
類似于圖10A和10B的五種WBC差別的散布圖結(jié)果的另一個(gè)例子示于圖11A和11B。全血樣有二個(gè)同時(shí)進(jìn)行分析的樣品，分析步驟與對(duì)圖10A和10B可作的說(shuō)明相同。圖11A這個(gè)散布圖提供的讀數(shù)為L(zhǎng)為31.9(1)，M為17.6(2)，G為50.4(3)。而圖11B這個(gè)散布圖提供的讀數(shù)為L(zhǎng)為67.1(1)，M為24.1(2)，E為7.6(3)，B為1.2(4)。得到的五種WBC差別的結(jié)果是L為31.9，M為11.4，N為46.0，E為3.6，B為0.7。作為比較，相應(yīng)用顯微鏡方法得到的讀數(shù)為L(zhǎng)為36，M為11，N為49，E為3，B為1。
體現(xiàn)在原先申請(qǐng)的細(xì)胞種群分析方法和設(shè)備的又一個(gè)具體裝置在圖12中簡(jiǎn)標(biāo)為292。分析器292包括一個(gè)還是至少含有第一批活的生物細(xì)胞，如果需要也含有緩沖劑的生物樣品294。經(jīng)通路296樣品294與經(jīng)通路300來(lái)的至少一種反應(yīng)劑298混合。在分析器292中，在功能指定場(chǎng)所302中順序地或同時(shí)地將RCB去除和將N移位。RBC去除功能標(biāo)為304，而移動(dòng)N功能標(biāo)為306，以便指示這二個(gè)功能可以同時(shí)執(zhí)行，也可以順序執(zhí)行?？梢杂么帕蛉馨?，或如上所述用這二者的組合來(lái)除去RBC。用將粘有一種N專用抗體微球體加入混合物來(lái)除去或移動(dòng)N。
一旦除去了RBC和移動(dòng)了N，所得到的混合物經(jīng)通路308送到分析器310。在這種情況下，由于N很明顯地離開(kāi)E和B的圖形，因此可以直接得到M、L、E、B和N這五種WBC的差別。用設(shè)備56和210或稍加變動(dòng)，分析器292就能完成這個(gè)功能。
用分析器292直接得出五種WBC差別的一個(gè)例子的散布圖結(jié)果示于圖13。在這個(gè)例子中，生物樣品294為20微升的全血樣，而反應(yīng)物298為10微升粘有N專用抗體的非磁性微球體摻了100微升的緩沖劑、在子場(chǎng)所306內(nèi)攪拌了30秒。240微升的RBC優(yōu)選溶胞劑加到子場(chǎng)所304內(nèi)的混合物中，攪拌6秒后加入抑制劑。而后，除去了RBC和移動(dòng)了N的混合物由分析器310加以分析，得到圖13的這個(gè)散布圖。該散布圖所給出的直接讀數(shù)為L(zhǎng)為29.6，M為13.6，N為52.2，E為3.4，B為1.06。作為比較，顯微鏡測(cè)量的讀數(shù)為L(zhǎng)為35，M為5，N為56，E為4，B為0，在這個(gè)具體例子中，該血樣也用柯?tīng)柼仉娮庸镜耐ㄓ眉?xì)胞計(jì)數(shù)儀進(jìn)行了分析，結(jié)果是L為29，M為11.1，G(包括N、E和B)為59.9。
現(xiàn)在參照?qǐng)D14-26D對(duì)本發(fā)明的一些具體裝置加以說(shuō)明。
參照?qǐng)D14，WBC種群子集分析器的方法和設(shè)備的第一個(gè)具體裝置標(biāo)記為320。分析器320包括至少含有第一批語(yǔ)的生物細(xì)胞(未示出)的生物樣品322，它包括具有至少一個(gè)可確定子集的至少一種白血細(xì)胞種群，諸如在全血樣中或從全血樣中取出的細(xì)胞。如在此所采用的，WBC子集是專用單克隆抗體能粘在上面的一個(gè)WBC種群的子集。世界健康組織和國(guó)際免疫學(xué)會(huì)對(duì)單克隆抗體現(xiàn)已規(guī)定了一種命名法。單克隆抗體由分化簇(CD)術(shù)語(yǔ)來(lái)定義，這種術(shù)語(yǔ)為細(xì)胞或細(xì)胞群和專用于這種CD群的單克隆抗體定義了具體的特性。僅作為例子而言，在以后的例子中要用到四個(gè)CD群CD4、CD8、CD2和CD20。單克隆抗體的CD術(shù)語(yǔ)、特性和一些商品源情況說(shuō)明于表1中。
表1分化簇抗體特性(商品來(lái)源)CD2(gp50)T11(Coulter)ERossetteOKTLL(Ortho);受體Leu5a(BD)CD4(pg56)T4(Coulter)協(xié)助/誘導(dǎo)物TOKT4a(Ortho);
Leu3a(BD)CD8(gp32-33)T8(Coulter)細(xì)胞毒素/抑制者TOKT8(Ortho);
Leu2a(BD)CD20(gp35)BL(Coulter)除了原生細(xì)胞的所有Leu16(BD)B細(xì)胞除了骨髓，一些非T細(xì)胞的B腫瘤細(xì)胞表中
agp-糖蛋白分子重量千道爾頓bCoulter-CoulterImmunologyDivisionofCoulterCorporation(Hialeah，F(xiàn)lorida)BD-Becton-DickinsonImmunocytometrySystems(MountainView，California)Ortho-OrthoDiagnosticSystems(Raritan，NewJersey)生物樣品322的細(xì)胞在進(jìn)行定量和/或定性測(cè)定或分析時(shí)要參加生物反應(yīng)。樣品322可能包括緩沖劑，細(xì)胞加在這緩沖劑里。
經(jīng)通路324樣品322與經(jīng)通路328來(lái)的至少一種反應(yīng)劑326混合。在分析器320中，由具有去除RBC和偏移WBC子集功能的場(chǎng)所330同時(shí)或順序?qū)BC從混合物中除去和改變至少一個(gè)WBC子集的至少一個(gè)參數(shù)。如在先驅(qū)申請(qǐng)中所述，場(chǎng)所330從混合物中除去RBC可以有許多方法，諸如對(duì)場(chǎng)所20所列舉的。同時(shí)或順序，在同一混合物部分至少一個(gè)WBC子集被粘到具有專用于粘到這種子集上的單克隆抗體的WBC微球體上，改變了這種細(xì)胞的合成濁度和/或體積參數(shù)。
除去了RBC和移動(dòng)了WBC子種群后的混合物然后經(jīng)通路334送到分析器332。分析器332可以大體與分析器22相同。通常將有關(guān)的WBC子集表示成有關(guān)WBC種群的百分比。因此，分析器320對(duì)WBC種群的所選子集的至少一個(gè)特征提供了快速直接分析。分析器320可以用于其它數(shù)目較多的細(xì)胞遮蔽不了所移動(dòng)的WBC子集的情況，或雖有遮蔽但該WBC子集的所移動(dòng)的細(xì)胞數(shù)占有足夠大的百分比，使它們?nèi)菀妆蛔R(shí)別出來(lái)的情況。
參照?qǐng)D15，WBC種群子集分析的方法和設(shè)備的第二種具體裝置簡(jiǎn)標(biāo)為340。分析器340包括含有至少第一批活的生物細(xì)胞(未示出)的生物樣品342，它至少包括具有至少一個(gè)子集的一個(gè)白血細(xì)胞種群，如在全血樣中或從全血樣中取出的。生物樣品342的細(xì)胞在進(jìn)行定量和/或定性測(cè)定或分析時(shí)也要參加生物反應(yīng)。生物樣品342可以包括加有細(xì)胞的緩沖劑。
經(jīng)通路344樣品342與經(jīng)通路348來(lái)的至少一種反應(yīng)劑346混合。在分析器340中，具有除去RBC和移動(dòng)WBC子集功能的場(chǎng)所350同時(shí)或順序?qū)BC從混合物中除去和使至少一個(gè)WBC子集的至少一個(gè)特征發(fā)生改變或偏移。如前所述，可以有許多方式使場(chǎng)所350將RBC從混合物中除去，諸如對(duì)場(chǎng)所20所列舉。此外，同時(shí)或接著在相同的混合物部分至少有一個(gè)WBC子集粘到微球體上，改變了這些細(xì)胞的合成濁度和/或體積參數(shù)。
同時(shí)或接著至少有一個(gè)WBC種群或子集從混合物中除去。由于除去了WBC的種群或子集，所以所關(guān)心的WBC子集就不會(huì)被那個(gè)WBC種群搞混。最好是在WBC種群粘到粘有專用于這種WBC種群的單克隆體的磁性微球體上以后用磁力將它們除去。
除去了RBC和WBC的種群和移動(dòng)了WBC子集種群后的混合物然后經(jīng)通路354送到分析器352。分析器352也可以與分析器22大體相同。
體現(xiàn)原先申請(qǐng)和能夠?qū)崿F(xiàn)第一種和第二種分析器320、340的分析方法的一種詳細(xì)的具體裝置在圖16上概略地標(biāo)為360。
在設(shè)備360中，像設(shè)備56一樣，只說(shuō)明一種具體的計(jì)數(shù)情況，按第一個(gè)原先申請(qǐng)的原理可以作出幾乎無(wú)窮的變化。此外，對(duì)設(shè)備360的說(shuō)明只是一般原理性的，而具體的裝置可以用許多所知的方式構(gòu)成。
設(shè)備360包括抽氣泵機(jī)構(gòu)362，用來(lái)將有關(guān)的生物樣品(如樣品322或342)抽入到設(shè)備360。抽氣機(jī)362經(jīng)通路364連到與采樣頭368相連的采樣閥366。溶胞劑泵370含有溶胞劑(如部分反應(yīng)劑326或346)，經(jīng)通路372也連到閥366。閥366和泵362在適當(dāng)時(shí)候能吸取生物樣品322或342以及經(jīng)泵370來(lái)的溶胞劑。最好，生物樣品322或342與溶胞劑分開(kāi)加入。
然后，反應(yīng)的混合物或就是生物樣品本身經(jīng)排放通路374送入到混合裝置376?；旌掀?76包括混合艙378，樣品或反應(yīng)劑送入該艙。分析器320和340僅在工作上略有不同，這里將一起說(shuō)明。
在工作時(shí)，如果RBC已經(jīng)由來(lái)自泵370的溶胞劑溶胞，則在反應(yīng)完成時(shí)加入經(jīng)通路382由場(chǎng)所380所提供的抑制劑或停溶劑。于是除去RBC的反應(yīng)就結(jié)束了。通過(guò)在艙378內(nèi)攪拌溶胞劑和樣品可以促進(jìn)反應(yīng)，功能如在384所示。
無(wú)論是在除去RBC前、后或同時(shí)都可以移動(dòng)WBC，在使用分析器340的情況下，也可以除去一個(gè)WBC種群或子集。通過(guò)加入從場(chǎng)所386經(jīng)通路388、閥390和艙通路390來(lái)的專用WBC微球體使WBC子集發(fā)生偏移。WBC微球體與混合物或樣品用攪拌機(jī)384攪拌混合。
適當(dāng)?shù)幕旌涎b置376的具體情況與混合裝置70大體相同。使用了混合器大大提高了反應(yīng)速度，而且不會(huì)像提高反應(yīng)溫度那樣發(fā)生明顯損害細(xì)胞有關(guān)性質(zhì)的現(xiàn)象。此外，反應(yīng)一般在少于幾分鐘內(nèi)就可完成，大致是二分鐘或者更短。這使自動(dòng)化程度高的體積分析設(shè)備360可以進(jìn)行快速分析。
在分析器320中，在用溶胞劑除去RBC和WBC子集被移動(dòng)后，經(jīng)抑制的反應(yīng)物就經(jīng)通路394送到WBC分析器396(即分析器332)。按照瓦拉斯·H·柯?tīng)柼卦诿绹?guó)專利2，656，508中所說(shuō)明總、體現(xiàn)在柯?tīng)柼仉娮庸镜脑S多血細(xì)胞計(jì)數(shù)器商品中的計(jì)數(shù)和測(cè)量大小的技術(shù)，分析器396可以具有許多具體型式。
如前所述，一般說(shuō)來(lái)分析器396包括一個(gè)流式傳感器或敏感艙398。艙398包括一個(gè)具有一個(gè)貫穿的孔徑402的變換器400。艙398包括一個(gè)具有與那里的流體接觸的第一電極406的第一艙段404。
艙段404和電極406通過(guò)孔徑402與具有第二電極410的第二艙段408通信。電極406和410通過(guò)反應(yīng)引線412和414連接到RF/DC源和傳感電路416。電路416將直流(或是低頻電流或信號(hào))和高頻信號(hào)耦合到電極406和410之間。
低頻信號(hào)用來(lái)敏感由通過(guò)孔徑402的一個(gè)細(xì)胞所引起的一個(gè)信號(hào)脈沖的振幅。高頻信號(hào)用來(lái)得出通過(guò)孔徑402的這個(gè)細(xì)胞的電濁度。
對(duì)于測(cè)量細(xì)胞電濁度的情況，瓦拉斯·H·柯?tīng)柼睾屯郀柼亍·霍夫在美國(guó)專利3，502，974及以后的一些專利和柯?tīng)柼仉娮庸敬沓霭嫖镏杏兴f(shuō)明。在此可用的一種具體電路揭示在美國(guó)序號(hào)921，654的專利中，在此收作參考。
由電路416從被敏感的細(xì)胞產(chǎn)生的信號(hào)通過(guò)DC信號(hào)引線418和RF信號(hào)引線420耦合到比較器422(與比較器26相似)。
分析器396可以包括一個(gè)將細(xì)胞聚集到傳感器398內(nèi)的鞘流，其方式是眾所周知的。鞘流由射流系統(tǒng)424提供，通過(guò)一對(duì)通路426和428以眾所周知的方法耦合到傳感器398。樣品反應(yīng)的混合物經(jīng)導(dǎo)入管430送到傳感器398，而通過(guò)排出管432排放到容廢器434。
每次操作后，混合器378都要由清洗通路436加以沖洗干凈，由排廢通路438排干。一旦艙378清潔完畢，另一個(gè)樣品或樣品部分就可以送入設(shè)備3603。
在分析器340中，工作情況與加有磁性白血細(xì)胞種群或子集微球體的分析器320相同。被粘住的WBC子集在混合過(guò)程中和/或混合后用磁場(chǎng)或磁鐵440除去。磁場(chǎng)可以用電磁裝置或磁鐵440產(chǎn)生，電磁裝置或磁鐵440相對(duì)艙378作機(jī)械運(yùn)動(dòng)，把粘有磁性的WBC子集捕獲。除去了被粘的WBC子集后的混合物就通過(guò)通路394送到分析器396(其方式同前述)以便得出分析結(jié)果(與分析器320相同)。
然后，設(shè)備360準(zhǔn)備為下一次分析取下一個(gè)樣品。探頭368由探頭清洗機(jī)構(gòu)442清洗，各通路和艙378也以方便的方式?jīng)_洗干凈。接連著的樣品混合物的每次分析都是以自動(dòng)方式快速進(jìn)行的。接連二個(gè)樣品混合物分析之間的時(shí)間大致小于5分鐘。
如果不用溶胞劑，無(wú)論是在分析器320或340中，經(jīng)閥366樣品322或342送到混合器376並不帶任何溶胞劑。在這種情況下，RBC可以利用粘有RBC專用抗體的微球體以磁力除去。這種微球體從RBC微球體場(chǎng)所444經(jīng)通路446送到閥390，再經(jīng)通路392送到艙376。如果不用溶胞劑，被粘住的RBC在混合后也要用磁鐵440以與對(duì)粘有磁性的WBC上面所述的大體相同的方式用磁力除去。
此外，在第二種情況下，為了促進(jìn)反應(yīng)的速度和效率，可以采用樣品與RBC溶胞劑和RBC磁性微球體的反應(yīng)混合物。攪拌這種反應(yīng)混合物，抑制溶胞后用磁力將被粘的RBC除去，然后再進(jìn)行如前所述的WBC分析。
現(xiàn)在參照?qǐng)D17A和17B，以散布圖的方式示出了用一個(gè)類似設(shè)備360的典型分析器從一個(gè)全血樣中得出的二組結(jié)果。除去二個(gè)WBC種群直接對(duì)T8子集進(jìn)行分析。T8子集是那些具有T8專用抗體可粘在上面的受主式抗原的細(xì)胞或成形體。在圖中，這些細(xì)胞或成形體標(biāo)為T(mén)+8。那些沒(méi)有T8專用抗體的受主式抗原的細(xì)胞或成形體則標(biāo)為T(mén)-8。在這個(gè)例子中，生物解質(zhì)342是20微升混合器376使用的全血樣。在圖17A和17B中，20微升的全血樣(即解質(zhì)342)與40微升的粘有RBC專用抗體的磁性微球體混合，與120微升的緩沖劑溶液和10微升的粘有N和E專用抗體的磁性微球體混合，與30微升的緩沖劑溶液混合，一起形成反應(yīng)劑346。一種典型的N和E專用抗體在美國(guó)序號(hào)068，618、題為“專用于嗜中性和嗜酸性的一般遺傳素部位的單克隆抗體”、1987年6月3日歸檔的專利中有所說(shuō)明，在此收作參考。
磁性微球體可以具有任何合適的型式，在本例中用的是印第安那州的印第安那城的賽拉定公司出售的聚苯乙烯磁性微球體，直徑為0.7微米。10%固體粒子的重量體積比反應(yīng)混合物在混合器376內(nèi)攪拌10秒后在磁鐵440的磁場(chǎng)內(nèi)放置15秒，然后除去了RBC、E、N后得到的混合物在分析器396內(nèi)進(jìn)行分析。得到的散布圖A如圖17A中所示。
在12.5微升的粘有T8專用抗體的非磁性微球體與12.5微升的緩沖劑溶液混合組成的反應(yīng)劑346的情況下，用相同的程序得到散布圖(圖17B)。T8專用抗體的商標(biāo)為柯?tīng)柼亍た寺。煽聽(tīng)柼毓镜目聽(tīng)柼孛庖卟客瞥?。非磁性微球體也可以具有任何合適的型式，在本例中采用由俄勒岡州普德蘭的交換面動(dòng)力公司推出的IDC微球，(直徑為1.76微米，8%固體粒子的重量體積比)。
加入T8微球體將被粘的CD8細(xì)胞移到區(qū)域B，通過(guò)比較散布圖17A和17B可以看到，在B區(qū)這些CD8細(xì)胞就可分開(kāi)，進(jìn)行識(shí)別和計(jì)數(shù)。在圖17A中，CD8細(xì)胞被其它的WBC細(xì)胞遮蔽了。從散布圖上要移去N和S，否則這些細(xì)胞會(huì)影響圖17B中的經(jīng)移動(dòng)的CD8細(xì)胞的識(shí)別。圖17A示出了移去了N和S的情況，而圖17B則清楚地示出了CD8的被粘細(xì)胞從區(qū)域A移到區(qū)域B的情況。緩沖溶液可以是密索里州圣路易斯的西格瑪化學(xué)公司推出的磷酸鹽緩沖鹽溶液。
圖18A還示出了由分析器352得出的正常散布圖或M、L和G細(xì)胞種群的三個(gè)參數(shù)的組織圖的位置情況。不除去G，則如圖17B可見(jiàn)，經(jīng)移動(dòng)的WBC子集所在的區(qū)域B會(huì)被數(shù)目相當(dāng)大的G細(xì)胞弄模糊。圖18B為說(shuō)明在除去E和N后留下WBC種群M、L和B的情況的散布圖。雖然B還部分地弄模糊了我們所關(guān)心的那個(gè)區(qū)域，但這些WBC種群的百分?jǐn)?shù)很小，不會(huì)對(duì)子集百分?jǐn)?shù)進(jìn)行所需計(jì)算發(fā)生多大影響。然而如果需要的話，也可從子集百分?jǐn)?shù)中減去B所產(chǎn)生的影響。
現(xiàn)在參照?qǐng)D19A-D，20A-D和21A-D，說(shuō)明對(duì)從三個(gè)不同患者取出的各個(gè)樣品進(jìn)行CD2、CD4、CD8和CD20WBC子種群直接子集分析的情況。對(duì)每個(gè)子種群，將28微升的全血樣與20毫升的粘有N和E專用抗體的磁性微球體(2.5%重量/體積溶液)混合。此外，粘有與各個(gè)有關(guān)WBC子集相應(yīng)的單克隆抗體的非磁性微球體也與樣品混合。包覆在微球體上的T4、T8、T11或B1的量分別為40微升(每種均為1%重量/體積溶液)。各相應(yīng)的總混合物(例如N和E微球體加上T8)與磷酸鹽緩沖鹽水和1%牛血清白蛋白組成的總量為150微升、PH值為7.2至7.4的緩沖溶液相混合。各相應(yīng)的混合物在艙378內(nèi)用攪拌器376攪拌2分鐘，然后在磁場(chǎng)440內(nèi)放置1分鐘。在這些例子中，用上面提到的溶胞劑接著將RBC除去。首先加入WBC微球體，然后用來(lái)自落胞劑源370的300微升的溶胞劑(如由柯?tīng)柼仉娮庸就瞥龅募t血球溶胞劑)除去RBC。然后混合物用來(lái)自源380的120微升抑制劑(如也由柯?tīng)柼仉娮庸就瞥龅姆€(wěn)定劑，一種白細(xì)胞保存劑)抑制，再送到分析器396分析。
在各個(gè)散布圖中的右邊的方框(1)表示相應(yīng)所關(guān)心的WBC子種群。圖中所示的方框1、2、3、等人工式自動(dòng)地套在所關(guān)心的WBC種群式子集周圍。
這些結(jié)果與用常規(guī)的流式細(xì)胞計(jì)所得的結(jié)果作了比較。對(duì)于三種樣品以百分?jǐn)?shù)給出了用本發(fā)明方法(SHIFT)與流式細(xì)胞計(jì)(CYT)的下列比較結(jié)果
圖22A也示出了由分析器352得出的正常散布圖或M、L和G種群的三個(gè)參數(shù)分布情況。不除去N和E，CD4細(xì)胞種群就要被遮住分不清楚。通過(guò)用N和E專用單克隆抗體微球體將N和E移到一個(gè)區(qū)域或圖22B中所示方框1，則就能將CD4種群移入這個(gè)方框或區(qū)域2進(jìn)行觀察。這個(gè)區(qū)域會(huì)已經(jīng)被N和E遮住，如在圖22A中所見(jiàn)。在這個(gè)例子中，對(duì)于圖22C來(lái)說(shuō)，28微升的全血樣與50微升的粘有N和E專用單克隆抗體的2.2微米的微球體、50微升的粘有T4專用單克隆抗體的微球體以及22微升的稀釋劑相混合。圖22B是無(wú)T4微球體而稀釋劑為72微升，其它不變的情況，圖22A是無(wú)任何微球體而稀釋劑為122微升其它不變的情況。
參照?qǐng)D23A-D，可以看到采用多種粘到所關(guān)心的WBC子集上的微球體直接對(duì)WBC進(jìn)行分析的情況。圖23A和23B分別示出了就L種群與分別都用0.8微米的非磁性微球體移動(dòng)的T4WBC子集和T11WBC子集的散布圖。這移動(dòng)不是以區(qū)分圖23A和23B中的WBC子集。圖23C和23D分別示出了就L種群與粘在0.8微米和2.2微米的二種微球體上被移動(dòng)的T4WBC子集和T11WBC子集的散布圖。由于2.2微米的微球體有Goat抗游動(dòng)IgG抗體粘在上面，而這種抗體粘到粘在0.8微米微球體上的T4或T11抗體，因此2.2微米的微球體就粘到0.8微米的微球體上。
粘到所關(guān)心的WBC子集上的非磁性微球體的大小的影響例示于圖24A-C。在這個(gè)例子中，28微升的全血樣與10微升的粘有N和E專用抗體的磁性微球體(2.5%重量/體積溶液)和40微升的粘有T0專用抗體的非磁性微球體(1%重量/體積溶液)。T8的微球體具有二種不同的粒徑，說(shuō)明在散布圖上偏移的不同。將緩沖溶液加入，形成體積為150微升的混合物。混合物攪拌2分鐘后在磁場(chǎng)內(nèi)放置1分鐘。除去N和E后的混合物再加以溶胞，除去RBC后進(jìn)行分析。圖24A示出了一個(gè)沒(méi)有附著一個(gè)微球體的作參考標(biāo)準(zhǔn)的WBC子集、一個(gè)粘有2.2微米的非磁微球體的T8WBC子集和一個(gè)粘有30微米的非磁微球體的T8WBC子集。寬度和高度表示所檢測(cè)的信號(hào)的標(biāo)準(zhǔn)偏差。圖24b為說(shuō)明T8WBC子集用粘在上面的3.0微米的微球體移動(dòng)的情況，而圖24C為說(shuō)明T8WBC子集用粘在上面的2.2微米的微球體移動(dòng)情況的散布圖。對(duì)于不同的微球體分析得T8WBC子集的百分比相應(yīng)為20.9和19.3。顯然，較大的微球體形成較清晰的圖形，如圖24B所示。
現(xiàn)在參照?qǐng)D25A-D，來(lái)說(shuō)明按照本發(fā)明同時(shí)直接分析二個(gè)WBC子群的情況。在這個(gè)例子中，28微升的全血樣與10微升的粘有N和E專用抗體的磁性微球體、52微升的緩沖溶液和40微升的粘有T8專用抗體、3.0微米的非磁性微球體混合，攪拌2分鐘。然后將混合物放在磁場(chǎng)里1分鐘，再將除NN和E的混合物溶胞以除去RBC，然后進(jìn)行分析。圖25A示出了一個(gè)不粘有任何微球體的WBC子集的參考樣本、一個(gè)粘有2.2微米的非磁性微球體的T4讀數(shù)和一個(gè)粘有3.0微米的非磁性微球體的T8讀數(shù)。這說(shuō)明二個(gè)被移動(dòng)了的WBC子種群之間的差別。圖25B是一個(gè)散布圖分析，只有粘到2.2微米的微球體上的T4WBC子種群被移到區(qū)域A，而圖25C也是一個(gè)散布圖分析，只有粘到3.0微米的微球體上的T8WBC子種群被移到區(qū)域B。圖25D示出了一個(gè)散布圖分析，T4和T8WBC子種群被移到相應(yīng)的區(qū)域A和B。這使我們可以同時(shí)對(duì)T4和T子種群進(jìn)行分析。
現(xiàn)在參照?qǐng)D26A-D，在利用不同的參數(shù)得到的四個(gè)不同的散布圖上表示L、M和G這三個(gè)種群。雖然前面的例子是用DC對(duì)濁度(RF/DC)的關(guān)系來(lái)說(shuō)明的，但是實(shí)際上可以利用任何二個(gè)不同參數(shù)來(lái)形成散布圖。圖26A示出了一個(gè)用DC對(duì)RF的散布圖，圖26B用RF對(duì)濁度，圖26C用DC-RF對(duì)濁度而圖26D則用與前面一樣的DC對(duì)濁度。此外，雖然已經(jīng)用了DC對(duì)RF或RF/DC，只要信號(hào)可以相互能夠分開(kāi)那么可以用任何二種不同的頻率信號(hào)，因?yàn)樗鼈兊念l譜位置和/或相位關(guān)系是不同的。濁度是一個(gè)優(yōu)選參數(shù)，因?yàn)樗旧鲜荝F信號(hào)的歸一化。顯然，如圖26A-D所示，數(shù)據(jù)的表示形式可以隨需要而變。DC是所要敏感的細(xì)胞或成形體的體積的函數(shù)，而RF是所要敏感的細(xì)胞或成形體的內(nèi)部導(dǎo)電性和體積的函數(shù)。
此外，雖然本發(fā)明方法和設(shè)備已經(jīng)利用全血樣作了說(shuō)明，但有時(shí)候也有要用除去了RSC和/或一些WBC部分樣品的情況。顯然，還要除去RBC，但有爭(zhēng)議的是在本發(fā)明的設(shè)備的外部而不是在內(nèi)部除去RBC?？梢杂迷S多常規(guī)方式來(lái)實(shí)現(xiàn)這種去除RBC或配制，如使用溶胞試劑、密度或濃度技術(shù)等。在使用本發(fā)明的自動(dòng)化分析器中最好是用全血樣，這樣，樣品分析既快又完整。
根據(jù)以上說(shuō)明本發(fā)明可作許多發(fā)動(dòng)和變化。樣品12、42、150、180、294、322和342可以包括全血、含有細(xì)胞的人類體液或含有諸如細(xì)菌、病毒、霉菌之類成形體的其它液體。微球體的量規(guī)定為每單位體積稀釋劑中微球體的重量。雖然有些例子是順序執(zhí)行的，但這些工序也可以同時(shí)執(zhí)行。同時(shí)分析要考慮使用稍為復(fù)雜一點(diǎn)的設(shè)備組件。因此，可以理解，在所附權(quán)利要求范圍內(nèi)，不用說(shuō)本發(fā)明是可以實(shí)現(xiàn)的。
權(quán)利要求
1.從其中具有至少白血細(xì)胞種群、至少一個(gè)白血細(xì)胞種群具有至少一個(gè)子集的至少部分全血樣中獲得至少一個(gè)白血種群分析的方法，其特征是改變所關(guān)心的所述白血細(xì)胞種群的至少一個(gè)白血細(xì)胞種群子集的體積和/或濁度參數(shù)用電子技術(shù)對(duì)所述被改變的白血細(xì)胞種群子集和所述選定所關(guān)心的白血細(xì)胞種群進(jìn)行分析，從而確定所述選定的白血細(xì)胞種群的至少一個(gè)特征。
2.按照權(quán)利要求1的方法進(jìn)一步表征為在對(duì)所述被改變的白血細(xì)胞種群子集進(jìn)行分析前從所述白血細(xì)胞種群中減去至少一個(gè)白血細(xì)胞種群。
3.按照權(quán)利要求2的方法進(jìn)一步表征為提供粘有專用于所述白血細(xì)胞種群的單克隆抗體的磁性微球體，將所述磁性微球體與所述樣品混合，使得所述磁性微球體粘到所述白血細(xì)胞種群上，通過(guò)在吸引磁場(chǎng)內(nèi)所述磁性微球體同時(shí)除去所述樣品的至少一部分剩余的方法除去所述白血細(xì)胞種群。
4.按照權(quán)利要求1的方法進(jìn)一步表征為在分析所述被改變的白血細(xì)胞種群前從所述白血細(xì)胞種群中至少減去嗜中性和嗜酸性種群。
5.按照權(quán)利要求4的方法進(jìn)一步表征為加入粘有專用于所述嗜中性和嗜酸性種群的單克隆抗體的磁性微球體，將所述磁性微球體與所述樣品混合，使得所述磁性微球體粘到所述嗜中性和嗜酸性的種群上，通過(guò)在吸引磁場(chǎng)里的所述磁性微球體時(shí)除去所述樣品的至少一部分剩余的方法除去所述嗜中性和嗜酸性種群。
6.按照權(quán)利要求1的方法進(jìn)一步表征為通過(guò)加入粘有專用于CD4白血細(xì)胞種群子集的專用單克隆抗體的微球體，將所述微球體與所述樣品混合以使所述微球體粘到所述CD4子種群上來(lái)移動(dòng)所述CD4子種群的至少一個(gè)電特征的途徑來(lái)改變所述CD4白血細(xì)胞種群子集。
7.按照權(quán)利要求1的方法進(jìn)一步表征為通過(guò)加入粘有專用于CD8白血細(xì)胞種群子集的專用單克隆抗體的微球體、將所述微球體與所述樣品混合以使所述微球體粘到所述CD8子種群上來(lái)移動(dòng)所述CD8子種群的至少一個(gè)電特征的途徑來(lái)改變所述CD8白血細(xì)胞種群子集。
8.按照權(quán)利要求1的方法進(jìn)一步表征為通過(guò)加入粘有專用于CD2白血細(xì)胞種群子集的專用單克隆抗體的微球體、將所述微球體與所述樣品混合以使所述微球體粘到所述CD2子種群上來(lái)移動(dòng)所述CD2子種群的至少一個(gè)電特征的途徑來(lái)改變所述CD2白血球種群子集。
9.按照權(quán)利要求1的方法進(jìn)一步表征為通過(guò)加入粘有專用于CD20白血球種群子集的專用單克隆抗體的微球體、將所述微球體與樣品混合以使所述微球體粘到所述CD20子種群上來(lái)移動(dòng)所述CD20子種群的至少一個(gè)電特征的途徑來(lái)改變所述CD20白血細(xì)胞種群子集。
10.按照權(quán)利要求1的方法進(jìn)一步表征為改變所述關(guān)心的白血細(xì)胞種群的至少一個(gè)第二白血細(xì)胞子集的體積和/或濁度參數(shù);用電子方法分析至少其中一個(gè)所述被改變的白血細(xì)胞子集和所述選定關(guān)心的白血細(xì)胞種群，以便確定所述選定的白血細(xì)胞種群的至少一個(gè)特征。
11.按照權(quán)利要求10的方法進(jìn)一步表征為用電子方法分析二個(gè)所述被改變的白血細(xì)胞子集。
12.按照權(quán)利要求10的方法進(jìn)一步表征為通過(guò)加入粘有一種專用于所述第一白血細(xì)胞子集的單克隆抗體、具有第一粒徑的微球體和加入粘有一種專用于所述第二白血細(xì)胞子集的單克隆抗體、具有與所述第一粒徑不同的第二粒徑的微球體、將所述微球體與所述樣品混合使所述微球體粘到所述二個(gè)白血細(xì)胞種群上的途徑來(lái)改變所述二個(gè)白血細(xì)胞子集。
13.按照權(quán)利要求1的方法進(jìn)一步表征為通過(guò)加入粘有一種專用于所述白血細(xì)胞子集的單克隆抗體的第一組微球體、將所述微球體與所述樣品混合以使所述微球體粘到所述白血細(xì)胞種群上，然后加入粘有專用于粘在所述第一組微球體上的所述單克隆抗體的一種單克隆抗體的第二組微球體、將所述第二組微球體與所述樣品和所述第一組微球體混合使所述第二組微球體粘到上面的途徑來(lái)改變所述白血細(xì)胞種群。
14.一種用來(lái)從其中具有至少白血細(xì)胞種群、至少一個(gè)白血細(xì)胞種群有至少一個(gè)子集的至少部分全血樣中得出至少一個(gè)白血種群分析的設(shè)備表征為用來(lái)改變所關(guān)心的所述白血細(xì)胞種群的至少一個(gè)白血細(xì)胞種群子集的體積和/或濁度的裝置(330，350，376);用電子技術(shù)對(duì)所述被改變的白血細(xì)胞種群子集和所述選定所關(guān)心的白血細(xì)胞種群進(jìn)行分析，從而確定所述選定的白血細(xì)胞種群的至少一個(gè)特征的裝置(332，352，416)。
15.按照權(quán)利要求14的設(shè)備進(jìn)一步表征為用來(lái)在對(duì)所述被改變的白血細(xì)胞種群子集進(jìn)行分析前從所述白血細(xì)胞種群中減去至少一個(gè)白血細(xì)胞種群的裝置(350，376)。
16.按照權(quán)利要求15的設(shè)備進(jìn)一步表征為用來(lái)通過(guò)加入粘有一種專用于所述白血細(xì)胞種群的單克隆抗體的磁性微球體來(lái)減去所述白血細(xì)胞種群的裝置(386)，用來(lái)將所述磁性微球體與所述樣品混合使得所述磁性微球體粘到所述白血細(xì)胞種群上的裝置(384)以及用來(lái)通過(guò)在吸引磁場(chǎng)里的所述磁性微球體時(shí)除去所述樣品的至少部分剩余的方法來(lái)除去所述白血細(xì)胞種群的裝置(440)。
17.按照權(quán)利要求14的設(shè)備進(jìn)一步表征為用來(lái)在分析所述被改變的白血細(xì)胞種群子集前從所述白血細(xì)胞種群中減去至少嗜中性和嗜酸性種群的裝置(386)。
18.按照權(quán)利要求17的設(shè)備進(jìn)一步表征為用來(lái)通過(guò)加入粘有一種專用于所述嗜中性和嗜酸性種群的單克隆抗體的磁性微球體來(lái)減去所述嗜中性和嗜酸性種群的裝置(386)，用來(lái)將所述磁性微球體與所述樣品混合使所述微球體粘到所述嗜中性和嗜酸性種群上的裝置(384)和用來(lái)通過(guò)在吸引磁場(chǎng)內(nèi)所述磁性微球體時(shí)除去所述樣品的至少部分剩余來(lái)除去所述嗜中性和嗜酸性種群的裝置(440)。
19.按照權(quán)利要求14的設(shè)備進(jìn)一步表征為用來(lái)通過(guò)加入粘有一種專用于CD4白血細(xì)胞種群子集的專用單克隆抗體的微球體來(lái)改變所述CD4白血細(xì)胞種群子集的裝置(386)和用來(lái)將所述微球體與所述樣品混合、使所述微球體粘到所述CD4子種群從而移動(dòng)所述CD4子種群的至少一個(gè)電特征的裝置(384)。
20.按照權(quán)利要求14的設(shè)備進(jìn)一步表征為用來(lái)通過(guò)加入粘有一種專用于CD8白血細(xì)胞種群子集的專用單克隆抗體的微球體來(lái)改變所述CD8白血細(xì)胞種群子集的裝置(386)和用來(lái)將所述微球體與所述樣品混合，使所述微球體粘到所述CD8子種群從而移動(dòng)所述CD8子種群的至少一個(gè)電特征的裝置(384)。
21.按照權(quán)利要求14的設(shè)備進(jìn)一步表征為用來(lái)通過(guò)加入粘有一種專用于CD2的白血細(xì)胞種群子集的專用單克隆抗體的微球體來(lái)改變所述CD2白血細(xì)胞種群子集的裝置(386)和用來(lái)將所述微球體與所述樣品混合、使所述微球體粘到所述CD2子種群上從而移動(dòng)所述CD2子種群的至少一個(gè)電特征的裝置(384)。
22.按照權(quán)利要求14的設(shè)備進(jìn)一步表征為用來(lái)通過(guò)加入粘有一種專用于CD20的白血細(xì)胞種群子集的專用單克隆抗體的微球體來(lái)改變所述CD20白血細(xì)胞種群子集的裝置(386)和用來(lái)將所述微球體與所述樣品混合、使所述微球體粘到所述CD20子種群上從而移動(dòng)所述CD20子種群的至少一個(gè)電特征的裝置(384)。
23.按照權(quán)利要求14的設(shè)備進(jìn)一步表征為用來(lái)改變所述關(guān)心的白血細(xì)胞種群的至少一個(gè)第二白血細(xì)胞子集的體積和/或濁度參數(shù)的裝置(386)，和用來(lái)用電子技術(shù)分析至少其中一個(gè)所述被改變的白血細(xì)胞子集和所述選定關(guān)心的白血細(xì)胞種群從而確定所述選定的白血細(xì)胞種群的至少一個(gè)電特征的裝置(416，422)。
24.按照權(quán)利要求23的設(shè)備進(jìn)一步表征為用來(lái)用電子技術(shù)分析二個(gè)所述被改變的白血細(xì)胞子集的裝置(416，422)。
25.按照權(quán)利要求23的設(shè)備進(jìn)一步表征為用來(lái)通過(guò)加入粘有一種專用于所述第一白血細(xì)胞子集的單克隆抗體的、具有第一粒徑的微球體和加入粘有一種專用于所述第二白血細(xì)胞子集的單克隆抗體、具有與所述第一粒徑不同的第二粒徑的微球體來(lái)改變所述二個(gè)白血細(xì)胞子集的裝置(386)和用來(lái)將所述微球體與所述樣品混合、使所述微球體粘到所述白血細(xì)胞種群上的裝置(384)。
26.按照權(quán)利要求14的設(shè)備進(jìn)一步表征為用來(lái)通過(guò)加入粘有一種專用于所述白血細(xì)胞子集的單克隆抗體的第一組微球體來(lái)改變所述白血細(xì)胞種群子集的裝置(386)，用來(lái)將所述微球體與所述樣品混合使所述微球體粘到所述白血細(xì)胞種群上，再加入粘有一種專用于粘在所述第一組微球體上的所述單克隆抗體的單克隆體的第二組微球體的裝置(384)和用來(lái)將所述第二組微球體與所述樣品和所述第一組微球體混合、使所述第二組微球體粘到上面的裝置(384)。
全文摘要
本發(fā)明提供自動(dòng)、快速回收、計(jì)數(shù)和/或分析細(xì)胞或成型體的至少一個(gè)所選定的種群和全血樣或部分血樣的至少一個(gè)子的方法和設(shè)備。制備一定量的含有白血細(xì)胞的生物解質(zhì)，將專用或至少對(duì)某些所選定的生物細(xì)胞是優(yōu)選的至少一種反應(yīng)劑引入到生物解質(zhì)，快速攪動(dòng)，就能改變這些細(xì)胞的濁度和/或體積參數(shù)，然后在一個(gè)工序或幾個(gè)工序中對(duì)混合物進(jìn)行計(jì)數(shù)和分析，從而得出對(duì)所要求的白血細(xì)胞種群和子集的分析。
文檔編號(hào)G01N33/553GK1043566SQ8910934
公開(kāi)日1990年7月4日 申請(qǐng)日期1989年12月16日 優(yōu)先權(quán)日1988年12月16日
發(fā)明者托馬斯·盧塞爾, 肯尼恩·H·科特萊特, 沃萊斯·H·庫(kù)爾特, 卡洛斯·M·羅德里格斯, 羅納德·鮑爾, 康斯坦斯·馬麗·哈杰克, 杰姆斯·卡雷·修德森 申請(qǐng)人:科特電子公司