本發(fā)明屬于原料藥分析檢測領域，特別涉及一種衍生化hplc法測定原料藥中水合肼的方法。

背景技術：

水合肼作為一種重要的精細化工原料，主要用于合成ac、d1pa、tsh等發(fā)泡劑；也用作鍋爐和反應釜的脫氧和脫二氧化碳的清洗處理劑；在農藥工業(yè)中用于生產除草劑、植物生長調和劑和殺菌、殺蟲、殺鼠藥；在醫(yī)藥工業(yè)中用于生產抗結核、抗糖尿病的藥物，肼可對肝、腎、血液等系統(tǒng)產生毒副作用。有數(shù)據(jù)顯示，肼可能具有致癌作用；因此這類化合物往往容易在藥品中殘留，過量攝入可能對人體造成危害。目前國際上普遍采用毒理學關注閾值(thresholdoftoxicologicalconcern，ttc)來對基因毒性雜質進行限度控制。基因毒性雜質限度通常較低，因此，需要建立高靈敏度的分析方法對藥物中的這類化合物進行監(jiān)控。

如何快速、簡便、高靈敏度地監(jiān)測生產過程中的肼的殘留量，一直是藥物殘留檢測研究的一個問題。

現(xiàn)今，大多數(shù)文獻報道的方法都是針對測定水環(huán)境中的水合肼。常用的檢測水合肼的方法有流動注射化學發(fā)光分析、熒光分析、分光光度法、氣相色譜分析法等。分光光度法測定水中水合肼，對于檢測藥物而言其專屬性、靈敏度不高。氣相色譜對水合肼分析一般采用直接和衍生化法。直接法是采用熱導檢測器(tcd)進行，由于熱導檢測器不是很靈敏，造成此方法分析靈敏度低，另外，由于水合肼是強堿性化合物，對于柱子的選擇也有較高的要求。張渝等人用糠醛衍生-氣相色譜/質譜法測定地表水中的肼，雖然質譜檢測器是一種靈敏度和通用的檢測器，然而高昂的價格限制了它的推廣使用。

相比于水樣分析，測定原料藥中殘留的水合肼面臨著更多的挑戰(zhàn)。首先原料藥基質的復雜性遠高于水樣，因此要求分析方法具備高度的專屬性，這樣才能有效的減少干擾；為此，前處理條件越簡單對結果的準確性越有利?？紤]到上述事實，我們希望通過液相衍生化技術來改善這些問題。液相衍生化技術通過化學反應給待測物引入特定的基團，不僅可以提高檢測靈敏度，還能改善待測物的分離效果，適合于肼殘留的定量分析。jennywang等人用液相衍生化技術測定肼，參考他們的衍生化反應條件進行衍生化反應后，發(fā)現(xiàn)衍生產物腙的收率只有3.1％，無法測定原料藥中低含量的水合肼，因此，對水合肼衍生化反應條件進行了一系列的研究。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是針對現(xiàn)有技術的上述不足，提供衍生化hplc法測定水合肼的方法。

為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用以下技術方案：一種衍生化hplc法測定水合肼的方法，包含以下步驟：

(1)在100℃水浴條件下，使用醛酮類衍生化試劑對待測液體進行衍生化反應生成在406nm處有較強吸收的產物；

(2)以步驟(1)中衍生化反應結束后的反應液作為進樣樣品，利用hplc法，基于反相分配色譜法原理，在406nm測定其中水合肼的衍生化產物，從而實現(xiàn)對待測液體中水合肼的定性或定量檢測。

進一步的，步驟1中衍生化反應是以二甲亞砜-冰醋酸-水為反應體系。

進一步的，二甲亞砜-冰醋酸-水反應體系中冰醋酸體積濃度為10％～50％；水的體積濃度為0％～5％；，2-羥基-1-萘甲醛在反應體系中的濃度為0.6～3mg/ml；衍生化反應時間為20～120min；衍生化反應溫度為50～100℃水浴。

進一步的，步驟1中醛酮類衍生化試劑為2-羥基-1-萘甲醛。

進一步的，步驟2中hplc法采用高效液相色譜儀，采用反相分配色譜法，以非極性鍵合相為固定相，極性流動相，檢測波長為406nm。

進一步的，高效液相色譜儀采用glsciencesincinertsustain色譜柱，進樣量20μl；流動相梯度：a相為乙腈，b相為三氟乙酸水溶液。

hplc法優(yōu)選：采用高效液相色譜儀；采用反相分配色譜法：以非極性鍵合為固定相，采用極性流動相，檢測波長為406nm。

hplc法更進一步優(yōu)選使用儀器為shimadzulc-20ad液相色譜儀，該色譜儀配制有在線真空脫氣機、二元梯度泵，自動進器、柱溫箱紫外檢測器和labsolutions工作站；色譜柱采用glsciencesincinertsustain150mm×4.6mm，5μm；進樣量20μl；流動相梯度：a相為乙腈，b相為0.4％三氟乙酸(ph1.2)，0min70％a相，5min90％a相，12min90％a相，13min70％a相，23min70％a相；柱溫35℃；檢測波長406nm。

本發(fā)明所述的方法可用于多種樣品中水合肼的定性與定量檢測，優(yōu)選在測定原料藥中水合肼的應用。

本發(fā)明基于水合肼在紫外區(qū)吸收很弱，通過醛酮類衍生化試劑的衍生化反應，生成在近可見紫外區(qū)吸收較強的物質。大多數(shù)藥物及其雜質在近可見光區(qū)紫外吸收很弱，建立了一種簡單的、通過柱前衍生化hplc測定水合肼的方法。方法驗證的結果顯示藥物中常見的有機酸和其它雜質均不會對分析造成干擾，表明該方法專屬性良好。此方法的最低檢測限為0.6504ng/ml，最低定量限為2.168ng/ml，線性關系良好(r＞0.999)；平均回收率在96.7％～106.9％之間(rsd為4.3％)，無基質干擾；且衍生化產物在72小時內穩(wěn)定性良好。

附圖說明

圖1是實施例原料藥、衍生試劑(hna)、衍生產物的紫外光譜圖，確定檢測波長。

圖2是實施例反應條件對水合肼衍生化的影響：(a)體系中水的比例對衍生化效率的影響；(b)反應時間對衍生化效率的影響；(c)反應溫度對衍生化效率的影響；(d)體系中冰醋酸比例對衍生化效率的影響；(e)hna濃度對衍生化效率的影響。待測物的濃度均為1mg/ml。

圖3是實施例水合肼濃度與衍生化產物峰面積線性回歸方程。

具體實施方式

下面結合附圖對本發(fā)明的技術方案做進一步的說明。

1.1.儀器

shimadzulc-20ad液相色譜儀(含在線真空脫氣機、二元梯度泵，自動進樣器、柱溫箱、紫外檢測器和labsolution色譜工作站)sartoriusbt125d電子天平(北京賽多利斯有限公司)。

1.2.試劑

冰醋酸(99.5％)、水合肼(98％)、2-羥基-1-萘甲醛(98％)、二甲亞砜(99％)、純化水、乙腈(tedia,色譜純)、三氟乙酸(色譜純)。

1.3.溶液的制備

2-羥基-1-萘甲醛(以下簡稱hna)：取試劑250mg，精密稱定，置于50ml容量瓶中，用二甲亞砜稀釋至刻度，溶解搖勻即可。

水合肼：稱取試劑10mg置于10ml容量瓶，用二甲亞砜溶解稀釋制成每1ml中含1mg的溶液作為水合肼貯備液1；從貯備液1中移取0.1ml至10ml容量瓶中，用二甲亞砜稀釋制成每1ml中含10μg的溶液，作為水合肼貯備液2；從貯備液2中移取1ml至10ml容量瓶中，

用二甲亞砜稀釋制成每1ml中含1μg作為水合肼貯備液3。

1.4.衍生化實驗條件

精密稱定適量供試品，置于10ml容量瓶中，分別加入0.3ml水、3ml冰醋酸和3mlhna，加二甲亞砜稀釋至刻度，搖勻，沸水浴加熱20min，取出、冷卻后取20μl直接進樣。

反應原理：

供試品溶液制備：精密稱定適量供試品，置于10ml容量瓶，分別加入0.3ml水、3ml冰醋酸和3mlhna，加二甲亞砜稀釋至刻度，搖勻，沸水浴加熱20min，取出、冷卻后取20μl直接進樣。

對照品溶液制備：精密稱定適量供試品，置于10ml容量瓶，分別加入0.3ml水、3ml冰醋酸和3mlhna、0.1ml水合肼溶液貯備液3，加二甲亞砜稀釋至刻度，搖勻，沸水浴加熱20min，取出、冷卻后取20μl直接進樣。

色譜條件：shimadzulc-20ad液相色譜儀，該色譜儀配制有在線真空脫氣機、二元梯度泵，自動進樣器、柱溫箱、紫外檢測器和labsolutions工作站；色譜柱采用glsciencesincinertsustain150mm×4.6mm,5μm；進樣量20μl；柱溫35℃；檢測波長406nm。梯度洗脫程序見表1。

表1梯度洗脫程序

標曲繪制方法：精密稱取供試品10mg置10ml容量瓶中，加3mlhna，3ml冰醋酸，0.3ml水，分別移取水合肼貯備液(200ng/ml)0ml、0.05ml、0.2ml、0.35ml、0.5ml、0.65ml、0.8ml，用dmso稀釋至刻度，搖勻，沸水浴加熱20min取出，搖勻，冷卻，按上述最佳色譜條件取20μl注入液相色譜儀，測定衍生化產物的峰面積。以水合肼濃度c(ng/ml)為橫坐標，衍生化產物峰面積a為縱坐標，采用最小二乘法進行線性回歸分析，計算線性回歸方程及相關系數(shù)。每個濃度平行測定3次，扣除樣品中殘留后按所得峰面積平均值(y)對水合肼濃度做標準曲線。

定量方法：采用外標法定量。

為了確保衍生化反應快速進行同時避免產物降解，需對體系中冰醋酸的比例、水的比例、衍生化試劑的用量、反應時間和反應溫度進行考察。以衍生化產物峰面積為指標，單因素考察了不同濃度的hna(2.0、5.0、10.0mg/ml)、冰醋酸比例(0、30％、50％)、水的比例(0、1％、3％、5％)、反應時間(20min、40min、60min、90min、120min)和反應溫度(25℃、50℃、70℃、100℃)對衍生化反應效率的影響。具體結果見圖1的a-e。

方法學驗證與應用

3.1專屬性

專屬性試驗主要考察了衍生試劑、供試品、水合肼、空白在衍生產物出峰處無干擾，說明該方法的專屬性良好。

3.2線性與范圍

精密稱取供試品10mg置10ml容量瓶中，加3mlhna(5mg/ml)，3ml冰醋酸，0.3ml水，分別移取水合肼貯備液(200ng/ml)0ml、0.05ml、0.2ml、0.35ml、0.5ml、0.65ml、0.8ml，用二甲亞砜稀釋至刻度，搖勻，配制成濃度為1ng/ml、4ng/ml、7ng/ml、10ng/ml、13ng/ml、16ng/ml的溶液，置沸水浴加熱20min，取出，冷卻，搖勻，按上述最佳色譜條件取20μl注入液相色譜儀，測定衍生化產物的峰面積。以水合肼濃度c(ng/ml)為橫坐標，衍生化產物峰面積a為縱坐標，采用最小二乘法進行線性回歸分析，計算線性回歸方程及相關系數(shù)。每個濃度平行測定3次，扣除樣品中殘留后按所得峰面積平均值(y)對水合肼濃度進行線性回歸，線性回歸方程為a＝664.63c-57.676，r＝0.999，說明本品在1ng/ml～16ng/ml范圍內線性良好，測定結果見表2。線性圖見圖3。

表2

3.3檢測限與定量限

以信噪比3:1為方法的檢測限，以信噪比10:1為方法的定量限。結果顯示水合肼的最低檢測限為0.6504ng/ml，相當于樣品檢測濃度的0.6ppm；最低定量限為2.168ng/ml，相當于樣品檢測濃度的2ppm。

3.4準確度

稱取原料藥10mg置10ml量瓶中，作為回收率基質樣品。以雜質水合肼的含量(0.001％基質樣品濃度)為基準100％。精密移取水合肼貯備液3：0.07ml、0.10ml、0.13ml，分別置于盛有基質樣品的10ml量瓶中，加3mlhna、3ml冰醋酸、0.3ml水，用dmso稀釋至刻度，搖勻，配制成含雜質70％、100％、130％的溶液，同法平行3次，作為供試品溶液。將供試品溶液置沸水浴加熱20min，取出，冷卻，搖勻。按上述最佳色譜條件進行測定。測定結果見表3。

表3藥物中水合肼的準確度結果

由表中結果可以看出，該方法的平均回收率在96.7％～106.9％之間，相對標準偏差為4.3％。

3.5穩(wěn)定性試驗

準確稱取供試品，按上述衍生化反應配制對照溶液分別在室溫下放置0、1、2、3、25、72小時后，按上述測定方法進行測定。結果表明，在室溫條件下，衍生產物腙放置至少3天內穩(wěn)定。

綜上所述，本發(fā)明方法能夠有效的分離原料藥與水合肼衍生產物腙，能夠準確、快速測定水合肼，該方法簡單、快速、準確、有效，精密度高，是測定原料藥中水合肼的理想方法。參考文獻

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以上所述，僅是本發(fā)明的較佳實施例而已，并非對本發(fā)明做任何形式的限制。凡是依據(jù)本發(fā)明的技術和方法實質對以上實施例所作的任何簡單修改、等同變化與修飾，均仍屬于本發(fā)明的技術和方法方案的范圍內。