本發(fā)明屬于醫(yī)學(xué)生物類免疫檢測(cè)試劑領(lǐng)域，具體涉及一種快速檢測(cè)uPA及PAI-1的試劑盒。

背景技術(shù)：

惡性腫瘤嚴(yán)重地威脅著廣大人民群眾的生命安全及身心健康。早期檢測(cè)被廣泛認(rèn)為是降低癌癥死亡率的最好方法。目前臨床應(yīng)用多種殊檢查以期望提高腫瘤的早期診斷率，包括x線檢查、超聲檢查、CT檢查、磁共振檢查、內(nèi)腔鏡檢查等。這些檢查手段能夠從不同角度、不同側(cè)面對(duì)腫瘤進(jìn)行診斷，各有其局限性。腫瘤標(biāo)志物的出現(xiàn)使人們對(duì)腫瘤的早期診斷寄予了極大希望。腫瘤標(biāo)志物的檢測(cè)對(duì)腫瘤輔助診斷及判斷腫瘤預(yù)后、轉(zhuǎn)歸、評(píng)價(jià)療效，都具有重要的意義。

尿激酶纖溶酶原激活劑系統(tǒng)是由尿激酶纖溶酶原激活物(uPA)及其特異性受體(uPAR)和抑制劑(PAIs，主要為PAI-1)組成。尿激酶纖溶酶原激活劑系統(tǒng)不僅激活纖溶酶，在細(xì)胞外基質(zhì)和基底膜降解中起重要作用，并促進(jìn)血管形成。在細(xì)胞遷移和侵襲過程中，uPA及PAI-1能激活多種蛋白溶解酶，降解細(xì)胞外基質(zhì)、基底膜，促進(jìn)腫瘤浸潤、轉(zhuǎn)移。研究表明，uPA、PAI-1表達(dá)與乳腺癌、胃癌等多種腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移有關(guān)，國內(nèi)外相關(guān)研究表明，uPA和PAI-1在乳腺癌組織中的表達(dá)水平均高于癌旁組織或乳腺良性腫瘤或正常乳腺組織。在美國臨床腫瘤學(xué)會(huì)乳腺癌腫瘤標(biāo)志物應(yīng)用指南更新版(2007年)中，uPA和PAI-1已列入乳腺癌患者的預(yù)后指標(biāo)。

uPA是一種絲氨酸蛋白酶，由多種腫瘤細(xì)胞或其他細(xì)胞分泌，其與細(xì)胞膜上特異性受體uPAR結(jié)合，激活纖溶酶原成為纖溶酶，主要對(duì)細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)蛋白與基膜水解起作用。另外，uPA還激活潛在活性的膠原酶，與纖溶酶一起均促使細(xì)胞外基質(zhì)(包括層黏連蛋白、纖維連接蛋白、蛋白多糖和Ⅳ型膠原等)和血管基膜的降解，最終導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的浸潤和轉(zhuǎn)移。除組織中的濃度外，uPA的酶活性受PAIs的調(diào)控。

PAIs屬絲氨酸蛋白酶抑制因子家族，已知有PAI-1、PAI-2和PAI-3三種。PAI-1是一種相對(duì)分子質(zhì)量為52×10³的糖蛋白，是正常人血漿中uPA的主要抑制劑。PAI-1能夠促進(jìn)uPA-uPAR的細(xì)胞內(nèi)吞、降解，避免ECM的過度降解，還可以干擾uPAR與細(xì)胞表面黏附因子、ECM成分的結(jié)合，使細(xì)胞黏附力降低，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞遷移。目前有關(guān)PAI-1在腫瘤生物學(xué)中的確切作用還不清楚，其在纖溶酶原激活系統(tǒng)中可能擔(dān)當(dāng)重要的調(diào)節(jié)劑或者是腫瘤細(xì)胞防止自身降解的保護(hù)劑，而不是這個(gè)系統(tǒng)單純的抑制劑。也有學(xué)者認(rèn)為，PAI-1在腫瘤浸潤轉(zhuǎn)移中與uPA有協(xié)同和調(diào)節(jié)作用。

多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，uPA、PAI-1在多種腫瘤組織中表達(dá)，如乳癌、胃癌、子宮內(nèi)膜癌等，兩者的高表達(dá)可促進(jìn)腫瘤的浸潤和轉(zhuǎn)移，uPA和PAI-1的表達(dá)增加提示癌癥患者具有高的復(fù)發(fā)率，是惡性腫瘤的不良預(yù)后因素?，F(xiàn)有技術(shù)多采用免疫組化方法或ELISA法檢測(cè)腫瘤組織或患者血清中uPA、PAI-1的表達(dá)，采用免疫組化方法只能對(duì)uPA、PAI-1進(jìn)行定性或半定量測(cè)定，因此，不能得到uPA、PAI-1定量檢測(cè)結(jié)果以實(shí)現(xiàn)對(duì)病情的診斷或治療情況進(jìn)行監(jiān)測(cè)。采用ELISA試劑盒雖然可以對(duì)uPA或PAI-1進(jìn)行定量測(cè)定，但重復(fù)性較差，精密度較低，操作過程繁瑣，受人為操作因素影響很大，不利于高通量的全自動(dòng)檢測(cè)，特異性和靈敏性有待提高。因此，有必要開發(fā)一種操作簡單，兼具高的檢測(cè)靈敏性和特異性，且能同時(shí)檢測(cè)uPA、PAI-1的試劑盒，以滿足市場(chǎng)的需求。

免疫層析技術(shù)是基于抗原抗體特異性免疫反應(yīng)的一種新型膜檢測(cè)技術(shù)。層析過程中，以結(jié)合了標(biāo)記物的待測(cè)液為流動(dòng)相，通過毛細(xì)管作用，在固相膜上與受體發(fā)生特異性反應(yīng)從而富集，根據(jù)肉眼可見的標(biāo)記物(如膠體金、膠體硒等)或酶反應(yīng)的顯色條帶來定性檢測(cè)或定量檢測(cè)。目前沒有關(guān)于利用免疫層析技術(shù)同時(shí)檢測(cè)uPA、PAI-1的相關(guān)研究報(bào)道。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

為解決現(xiàn)有技術(shù)存在的問題，本發(fā)明的目的在于一種操作簡單，兼具高的檢測(cè)靈敏性和特異性，且能同時(shí)檢測(cè)uPA、PAI-1的試劑盒，以滿足市場(chǎng)的需求。

本發(fā)明另外一個(gè)目的在于提供一種所述檢測(cè)uPA、PAI-1的試劑盒的使用方法。

本發(fā)明的上述目的是通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的：

本發(fā)明提供了一種快速檢測(cè)uPA及PAI-1的試劑盒，其包括檢測(cè)反應(yīng)載體、uPA標(biāo)準(zhǔn)品、PAI-1標(biāo)準(zhǔn)品，所述的檢測(cè)反應(yīng)載體為鋪有膜材料的試紙條，所述的試紙條由PVC底板、及位于PVC底板表面的從點(diǎn)樣端開始依次為樣品墊、熒光標(biāo)記物結(jié)合墊、硝酸纖維膜、吸水紙組成。

進(jìn)一步地，所述的熒光標(biāo)記物結(jié)合墊的膜材料為玻璃纖維紙，所述的玻璃纖維紙上包被熒光乳膠標(biāo)記穩(wěn)定液，所述的硝酸纖維膜上離加樣端較近的一側(cè)依次有uPA檢測(cè)線、PAI-1檢測(cè)線、質(zhì)控線，所述的uPA檢測(cè)線上包被有uPA抗體，PAI-1檢測(cè)線上包被有PAI-1抗體，質(zhì)控線上包被有羊抗鼠免疫球蛋白IgG。

進(jìn)一步地，所述的熒光乳膠標(biāo)記穩(wěn)定液為含2～6％(w/v)3-(N-嗎啉)丙磺酸、1～2％(w/v)十二烷基磺酸鈉、0.5～1％(w/v)海藻酸鈉、1～2％(w/v)甘氨酸的熒光乳膠顆粒標(biāo)記的uPA抗體和PAI-1抗體混合液。

優(yōu)選地，所述的熒光乳膠標(biāo)記穩(wěn)定液為含6％(w/v)3-(N-嗎啉)丙磺酸、1.5％(w/v)十二烷基磺酸鈉、0.5％(w/v)海藻酸鈉、2％(w/v)甘氨酸的熒光乳膠顆粒標(biāo)記的uPA抗體和PAI-1抗體混合液。

其中，上述的熒光乳膠顆粒標(biāo)記的uPA抗體和PAI-1抗體混合液為熒光乳膠顆粒標(biāo)記的uPA抗體溶液與熒光乳膠顆粒標(biāo)記的PAI-1抗體溶液以的1:1的體積比混合。

進(jìn)一步地，所述的熒光乳膠顆粒標(biāo)記的uPA抗體或PAI-1抗體均為鼠源的單克隆抗體。

本發(fā)明提供的試劑盒主要依賴抗體抗原特異性結(jié)合反應(yīng)，采用雙抗夾心免疫層析和熒光乳膠免疫層析技術(shù)來捕獲并分離目標(biāo)物質(zhì)，具體為：1)當(dāng)樣品中同時(shí)存在uPA和PAI-1抗原時(shí)，每種抗原首先與熒光乳膠顆粒標(biāo)記的對(duì)應(yīng)的單抗結(jié)合，形成抗原-熒光乳膠標(biāo)記抗體復(fù)合物，通過毛細(xì)管作用，層析到檢測(cè)線處，所述的抗原-熒光乳膠標(biāo)記抗體復(fù)合物與層析線上另一種uPA抗體或PAI-1抗體結(jié)合，形成抗體-抗原-熒光乳膠標(biāo)記抗體的雙抗夾心復(fù)合物，在uPA檢測(cè)線和PAI-1檢測(cè)線均產(chǎn)生紅色的條帶，未與檢測(cè)線上抗體結(jié)合的熒光乳膠標(biāo)記抗體繼續(xù)向上層析，到達(dá)質(zhì)控線，質(zhì)控線上的羊抗鼠免疫球蛋白IgG會(huì)與熒光乳膠標(biāo)記抗體結(jié)合，產(chǎn)生紅色條帶，判定為陽性結(jié)果；2)當(dāng)樣品中只存在uPA或PAI-1抗原時(shí)，只產(chǎn)生一條紅色的條帶(uPA檢測(cè)線或和PAI-1檢測(cè)線上)，質(zhì)控線出現(xiàn)紅色條帶；3)當(dāng)樣品中不存在uPA和PAI-1抗原時(shí)，則檢測(cè)線處不出現(xiàn)紅色條帶，只在質(zhì)控線處出現(xiàn)紅色條帶，判定為陰性結(jié)果；4)當(dāng)檢測(cè)線處出現(xiàn)紅色條帶，但質(zhì)控線上不出現(xiàn)紅色條帶，判定結(jié)果無效，需重新試驗(yàn)。

本發(fā)明還提供一種所述的熒光乳膠顆粒標(biāo)記的uPA抗體或PAI-1抗體溶液的制備，其包括以下步驟：

(1)將熒光乳膠微球體溶液在20000rpm離心10min，去除上清收集沉淀物，然后加入PBS緩沖溶液調(diào)節(jié)熒光乳膠微球體濃度為1.0╳10¹²個(gè)/mL，在100W超聲波中分散30s，得乳膠微球分散液；

(2)往乳膠微球分散液中依次加入1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亞胺和N-羥基硫代琥珀酰亞胺，震蕩混合均勻，置于恒溫?fù)u床進(jìn)行反應(yīng)30min，然后在10000rpm離心15min，去除上清收集沉淀物，然后加入PBS緩沖溶液復(fù)溶，調(diào)節(jié)熒光乳膠微球體濃度為1.0╳10¹⁰個(gè)/mL，即得活化乳膠溶液；

(3)往活化乳膠溶液中加入uPA抗體或PAI-1抗體，震蕩混合均勻，置于水平搖床上在室溫下進(jìn)行反應(yīng)2h，然后在10000rpm下離心洗滌3次，每次10min，往沉淀中加入硼酸鹽緩沖溶液稀釋至離心前體積，即得熒光乳膠顆粒標(biāo)記的uPA抗體或PAI-1抗體溶液，其中，所述的硼酸鹽緩沖溶液為含1％(w/v)蔗糖、2％(w/v)BSA，pH7.4，濃度為0.01mol/L的硼酸鹽緩沖溶液。

進(jìn)一步地，所述步驟(2)中1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亞胺在乳膠微球分散液中的終濃度為4～6mg/mL，N-羥基硫代琥珀酰亞胺在乳膠微球分散液中的終濃度為2～4mg/mL；

所述步驟(3)中uPA抗體或PAI-1抗體的濃度為0.3～0.5mg/mL，所述uPA抗體或PAI-1抗體的加入的體積與活化乳膠溶液的體積比為1:5。

進(jìn)一步地，所述的熒光乳膠微球?yàn)槭杷杂袡C(jī)染料熒光物質(zhì)與丙烯酸酯類單體聚合而成，所述熒光乳膠微球的粒徑為100～150nm。

上述的疏水性有機(jī)染料熒光物質(zhì)選自羅丹明系列染料、香豆素染料、氟硼類染料、方酸類染料、花菁類染料中的一種或多種。

丙烯酸酯類單體選自丙烯酸丁酯單體、甲基丙烯酸甲酯單體、甲基丙烯酸羥乙酯單體、丙烯酸單體、丙烯酸羥乙酯單體、甲基丙烯酸氨乙酯單體的一種或多種。

本發(fā)明所述的熒光乳膠微球可以為市售產(chǎn)品，也可以為自制產(chǎn)品，其制備方法為：將丙烯酸酯類單體、疏水性有機(jī)染料熒光物質(zhì)、超純水混合、攪拌、加熱，在過硫酸鹽的作用下發(fā)生無皂乳化聚合，得到反應(yīng)產(chǎn)物，再將反應(yīng)產(chǎn)物過濾、離心去上清，洗滌沉淀物，即得熒光乳膠顆粒，具體操作可參考公開號(hào)為CN 102174144 B的中國專利申請(qǐng)“一種熒光乳膠顆粒及其制備方法”。

進(jìn)一步地，所述的樣品墊和熒光標(biāo)記物結(jié)合墊均經(jīng)過預(yù)處理，其中，樣品墊預(yù)處理使用的預(yù)處理緩沖液為含2％(w/v)BSA、0.1％(v/v)吐溫-20且濃度為0.05mol/L、pH為7.2的磷酸鹽緩沖溶液；

熒光標(biāo)記物結(jié)合墊預(yù)處理使用的預(yù)處理緩沖液為含2％(w/v)BSA、0.05～0.15％(w/v)六偏磷酸鈉、0.1～0.4％(w/v)檸檬酸鈉、0.1％(v/v)吐溫-20、且濃度為0.05mol/L、pH為7.2的磷酸鹽緩沖溶液。

優(yōu)選地，所述的所述的熒光標(biāo)記物結(jié)合墊預(yù)處理使用的預(yù)處理緩沖液為含2％(w/v)BSA、0.1％(w/v)六偏磷酸鈉、0.25％(w/v)檸檬酸鈉、0.1％(v/v)吐溫-20、且濃度為0.05mol/L、pH為7.2的磷酸鹽緩沖溶液。

本發(fā)明所述的檢測(cè)反應(yīng)載體的制備與膠體金測(cè)試卡、檢測(cè)試紙的制備類似，包括以下步驟：

(1)樣品墊和結(jié)合墊預(yù)處理：將樣品墊或結(jié)合墊置于預(yù)處理液中浸泡2h，取出，在37℃條件下烘干；

(2)將熒光乳膠標(biāo)記穩(wěn)定液噴涂于經(jīng)預(yù)處理后的結(jié)合墊，噴涂量為4μl/cm，37℃條件下烘干，制成熒光標(biāo)記物結(jié)合墊；

(3)在硝酸纖維膜上的uPA檢測(cè)線、PAI-1檢測(cè)線、質(zhì)控線上分別噴涂uPA抗體溶液、PAI-1抗體溶液、羊抗鼠免疫球蛋白IgG溶液，所述的uPA抗體溶液、PAI-1抗體溶液、羊抗鼠免疫球蛋白IgG溶液的濃度均為1mg/ml，噴涂量均為1μl/cm；uPA檢測(cè)線、PAI-1檢測(cè)線和質(zhì)控線中兩線間隔5mm，37℃條件下烘干30min，然后置于封閉液中浸泡60min，取出烘干處理60min；

(4)將樣本墊、熒光標(biāo)記物結(jié)合墊、硝酸纖維膜和吸水紙依次組裝在PVC底板上，即得。

其中，上述步驟(3)中的uPA抗體和PAI-1抗體均為鼠抗人單克隆抗體，購自Abcam，用PBS緩沖溶液稀釋至1mg/ml；羊抗鼠免疫球蛋白IgG，購自Abnova，用PBS緩沖溶液稀釋至1mg/ml。

本發(fā)明試劑盒中熒光標(biāo)記物結(jié)合墊的膜材料玻璃纖維紙和硝酸纖維膜均購自Millipore，孔徑均為5μm。

此外，本發(fā)明提供的試劑盒中還包括uPA標(biāo)準(zhǔn)品、PAI-1標(biāo)準(zhǔn)品，所述的uPA標(biāo)準(zhǔn)品制備為：使用含0.1mol/L氯化鈉、2％(w/v)BSA，pH為7.2的磷酸鹽緩沖溶液將uPA抗原配制成濃度分別為100、300、600、1200、2400、5000pg/ml的標(biāo)準(zhǔn)液，即得。

所述的PAI-1標(biāo)準(zhǔn)品制備為：使用含0.1mol/L氯化鈉、2％(w/v)BSA，pH為7.2的磷酸鹽緩沖溶液將PAI-1抗原配制成濃度分別為5、25、50、100、125、150ng/ml的標(biāo)準(zhǔn)液，即得。

本發(fā)明提供的試劑盒除了可對(duì)uPA、PAI-1進(jìn)行定性檢測(cè)外，還可進(jìn)行定量檢測(cè)，分別將不同梯度濃度的uPA標(biāo)準(zhǔn)品、PAI-1標(biāo)準(zhǔn)品滴加到樣品墊上，每個(gè)濃度設(shè)置5個(gè)重復(fù)，膜層析10min后，使用免疫分析儀器通過采集檢測(cè)線(T)和質(zhì)控線(C)上條帶的熒光信號(hào)，計(jì)算T/C信號(hào)值，以T/C信號(hào)值為縱坐標(biāo)，對(duì)應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)，分別建立uPA和PAI-1的定標(biāo)曲線。通過檢測(cè)待測(cè)樣品uPA和PAI-1的T/C信號(hào)值，代入定標(biāo)曲線，即可求得待測(cè)樣品中uPA和PAI-1的量。

本發(fā)明試劑盒中未提及的試劑盒的外包裝以及各試劑組分的獨(dú)立包裝容器等均可以按照所屬領(lǐng)域的常規(guī)操作進(jìn)行，符合相關(guān)行業(yè)規(guī)定即可。本發(fā)明的方法中未詳細(xì)提及的操作步驟也可參照所屬領(lǐng)域的常規(guī)操作進(jìn)行，所用檢測(cè)儀器設(shè)備，如免疫分析儀器的使用均按說明書操作進(jìn)行。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)勢(shì)在于：

(1)與傳統(tǒng)檢測(cè)腫瘤標(biāo)志物的ELISA試劑盒比較，本發(fā)明提供的試劑盒可同時(shí)定量測(cè)定樣本中的uPA和PAI-1，通過一次加樣操作就能對(duì)兩者的含量進(jìn)行測(cè)定，大大簡化了操作過程，具有較高的檢測(cè)靈敏度，對(duì)uPA檢測(cè)的最低限度為0.01ng/ml，對(duì)PAI-1檢測(cè)的最低限度為0.1ng/ml，且對(duì)兩者的檢測(cè)沒有交叉反應(yīng)，互不干擾，特異性高，可快速評(píng)估腫瘤患者的預(yù)后癥狀。

(2)本發(fā)明提供的試劑盒結(jié)合了雙抗夾心免疫層析和熒光乳膠免疫層析技術(shù)來捕獲并分離uPA和PAI-1，利用抗原-熒光乳膠標(biāo)記抗體復(fù)合物不斷地通過膜上的捕獲帶，不僅對(duì)待測(cè)物具有濃縮作用，而且也是標(biāo)記物被自動(dòng)分離，不需要額外的洗滌步驟，減少了污機(jī)會(huì)。

(3)本發(fā)明提供的試劑盒以疏水性有機(jī)染料熒光物質(zhì)與丙烯酸酯類單體聚合而成的熒光乳膠微球?yàn)檩d體標(biāo)記相應(yīng)的抗體，進(jìn)行熒光檢測(cè)，大大提高了檢測(cè)的特異性和靈敏度，比一般的膠體金標(biāo)記抗體靈敏度提高10～100倍，可有效排除背景顏色的干擾，使結(jié)果易于判斷。

(4)采用本發(fā)明提供的預(yù)處理液對(duì)熒光結(jié)合墊進(jìn)行預(yù)處理，使得試劑盒具有更佳的顯色效果，提高檢測(cè)的靈敏度，同時(shí)可大大降低血清樣本中其他物質(zhì)的干擾，提高檢測(cè)的準(zhǔn)確度。

具體實(shí)施方式

以下通過具體實(shí)施方式進(jìn)一步描述本發(fā)明，但本發(fā)明不僅僅限于以下實(shí)施例。

實(shí)施例1熒光乳膠顆粒的制備

制備方法：

取10g甲基丙烯酸甲酯、0.02g羅丹明B、0.01g 2-甲基烯丙基磺酸鈉和100ml的超純水置于反應(yīng)釜中，攪拌加熱，攪拌速度為200rpm，并通入氮?dú)?，?dāng)體系升溫至70℃，加入4ml過硫酸鉀，保溫進(jìn)行反應(yīng)120min，反應(yīng)結(jié)束后冷卻，使用注射器式濾器調(diào)整反應(yīng)產(chǎn)物的粒徑至100nm，然后將反應(yīng)產(chǎn)物過濾、離心去上清，沉淀物洗滌3次，即得熒光乳膠顆粒，

實(shí)施例2熒光乳膠顆粒標(biāo)記抗體的制備

1.熒光乳膠顆粒標(biāo)記uPA抗體的制備

制備方法：

(1)將熒光乳膠微球體溶液在20000rpm離心10min，去除上清收集沉淀物，然后加入PBS緩沖溶液調(diào)節(jié)熒光乳膠微球體濃度為1.0╳10¹²個(gè)/mL，在100W超聲波中分散30s，得乳膠微球分散液；

(2)往乳膠微球分散液中依次加入1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亞胺和N-羥基硫代琥珀酰亞胺，所述1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亞胺在乳膠微球分散液中的終濃度為6mg/mL，N-羥基硫代琥珀酰亞胺在乳膠微球分散液中的終濃度為4mg/mL，震蕩混合均勻，置于恒溫?fù)u床進(jìn)行反應(yīng)30min，然后在10000rpm離心15min，去除上清收集沉淀物，然后加入PBS緩沖溶液復(fù)溶，調(diào)節(jié)熒光乳膠微球體濃度為1.0╳10¹⁰個(gè)/mL，即得活化乳膠溶液；

(3)往活化乳膠溶液中加入濃度為0.5mg/mL uPA抗體，uPA抗體加入的體積與活化乳膠溶液的體積比為1:5，震蕩混合均勻，置于水平搖床上在室溫下進(jìn)行反應(yīng)2h，然后在10000rpm下離心洗滌3次，每次10min，往沉淀中加入硼酸鹽緩沖溶液稀釋至離心前體積，即得熒光乳膠顆粒標(biāo)記的uPA抗體溶液，其中，所述的硼酸鹽緩沖溶液為含1％(w/v)蔗糖、2％(w/v)BSA，pH7.4，濃度為0.01mol/L的硼酸鹽緩沖溶液。

2.熒光乳膠顆粒標(biāo)記PAI-1抗體的制備

制備方法同上述熒光乳膠顆粒標(biāo)記uPA抗體的制備。

實(shí)施例3本發(fā)明檢測(cè)試劑盒的制備

1.樣品準(zhǔn)備：

(1)熒光乳膠標(biāo)記穩(wěn)定液的制備：以配制100mL的熒光乳膠標(biāo)記穩(wěn)定液為例，具體為如下：

分別取實(shí)施例2制得的熒光乳膠顆粒標(biāo)記的uPA抗體溶液和熒光乳膠顆粒標(biāo)記的PAI-1抗體溶液各50mL，混合均勻，加入6g 3-(N-嗎啉)丙磺酸、1.5g十二烷基磺酸鈉、0.5g海藻酸鈉、2g甘氨酸，混合均勻，即得熒光乳膠標(biāo)記穩(wěn)定液。

(2)uPA抗體溶液或PAI-1抗體溶液或羊抗鼠免疫球蛋白IgG溶液的制備：取1mg的uPA抗體或PAI-1抗體或羊抗鼠免疫球蛋白IgG，加入1mlPBS緩沖溶液，溶解，即得。

(3)樣品墊預(yù)處理液的制備：以配制100mL的預(yù)處理液為例，具體為如下：

①取0.599g磷酸二氫鈉溶于100ml水中，制成濃度為0.05mol/L的磷酸二氫鈉溶液，另取0.710g磷酸氫二鈉溶于100ml水中，制成濃度為0.05mol/L的磷酸氫二鈉溶液，分別取0.05mol/L的磷酸二氫鈉溶液28ml，0.05mol/L的磷酸氫二鈉溶液72ml，混合，制得濃度為0.05mol/L、pH為7.2的磷酸鹽緩沖溶液。

②取2g BSA、0.1ml吐溫-20，加入100ml濃度為0.05mol/L、pH為7.2的磷酸鹽緩沖溶液，攪拌均勻即得。

(4)結(jié)合墊預(yù)處理液的制備：以配制100mL的預(yù)處理液為例，具體為如下：

取2g BSA、0.1g六偏磷酸鈉、0.25g檸檬酸鈉、0.1ml吐溫-20，加入100ml濃度為0.05mol/L、pH為7.2的磷酸鹽緩沖溶液，攪拌均勻即得。

2.檢測(cè)反應(yīng)載體的制備：

(1)樣品墊和結(jié)合墊預(yù)處理：將樣品墊或結(jié)合墊置于預(yù)處理液中浸泡2h，取出，在37℃條件下烘干；

(2)將熒光乳膠標(biāo)記穩(wěn)定液噴涂于經(jīng)預(yù)處理后的結(jié)合墊，噴涂量為4μl/cm，37℃條件下烘干，制成熒光標(biāo)記物結(jié)合墊；

(3)在硝酸纖維膜上的uPA檢測(cè)線、PAI-1檢測(cè)線、質(zhì)控線上分別噴涂uPA抗體溶液、PAI-1抗體溶液、羊抗鼠免疫球蛋白IgG溶液，所述的uPA抗體溶液、PAI-1抗體溶液、羊抗鼠免疫球蛋白IgG溶液的濃度均為1mg/ml，噴涂量均為1μl/cm；uPA檢測(cè)線、PAI-1檢測(cè)線和質(zhì)控線中兩線間隔5mm，37℃條件下烘干30min，然后置于封閉液中浸泡60min，取出烘干處理60min；

(4)將樣本墊、熒光標(biāo)記物結(jié)合墊、硝酸纖維膜和吸水紙依次組裝在PVC底板上，即得。

3.uPA標(biāo)準(zhǔn)品、PAI-1標(biāo)準(zhǔn)品的制備：

(1)uPA標(biāo)準(zhǔn)品制備為：使用含0.1mol/L氯化鈉、2％(w/v)BSA，pH為7.2的磷酸鹽緩沖溶液將uPA抗原配制成濃度分別為100、300、600、1200、2400、5000pg/ml的標(biāo)準(zhǔn)液，即得。

(2)PAI-1標(biāo)準(zhǔn)品制備為：使用含0.1mol/L氯化鈉、2％(w/v)BSA，pH為7.2的磷酸鹽緩沖溶液將PAI-1抗原配制成濃度分別為5、25、50、100、125、150ng/ml的標(biāo)準(zhǔn)液，即得。

實(shí)施例4本發(fā)明檢測(cè)試劑盒的使用

(1)確認(rèn)血清待測(cè)樣品(或標(biāo)準(zhǔn)品)和試劑盒各組分已至室溫。

(2)往樣本墊中加入40μl血清待測(cè)樣品(或標(biāo)準(zhǔn)品)，膜層析10min以后，置于免疫分析儀器中在470nm的激發(fā)光、525nm發(fā)射光下，采集uPA或PAI-1檢測(cè)線(T)和質(zhì)控線(C)上條帶的熒光信號(hào)，計(jì)算T/C信號(hào)值，以T/C信號(hào)值為縱坐標(biāo)，對(duì)應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)，分別建立uPA和PAI-1的定標(biāo)曲線。通過檢測(cè)待測(cè)樣品uPA和PAI-1的T/C信號(hào)值，代入定標(biāo)曲線，即可求得待測(cè)樣品中uPA和PAI-1的量。

實(shí)施例5本發(fā)明檢測(cè)試劑盒的方法學(xué)檢定

按照本領(lǐng)域中常規(guī)的制造和檢定規(guī)程對(duì)實(shí)施例中制備成的檢測(cè)試劑盒進(jìn)行檢定，結(jié)果如下：

①分析靈敏度

以不同濃度的uPA標(biāo)準(zhǔn)溶液和PAI-1標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行檢測(cè)，其中，當(dāng)uPA標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為0.01ng/ml時(shí)，當(dāng)PAI-1標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為0.1ng/ml時(shí)，uPA檢測(cè)線和PAI-1檢測(cè)線開始有顯色，與陰性結(jié)果有明顯區(qū)別；分別對(duì)0.01ng/ml uPA標(biāo)準(zhǔn)溶液和0.1ng/ml PAI-1標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行重復(fù)測(cè)定10次，每次測(cè)定線均顯色，且顯色深淺基本一致，故本發(fā)明試劑盒中的檢測(cè)試紙條對(duì)uPA抗原測(cè)定的最低檢出限為0.01ng/ml，對(duì)PAI-1抗原測(cè)定的最低檢出限為0.1ng/ml。

②線性關(guān)系

以u(píng)PA標(biāo)準(zhǔn)液濃度的對(duì)數(shù)或PAI-1標(biāo)準(zhǔn)液濃度的對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)，對(duì)應(yīng)檢測(cè)的T/C信號(hào)值的對(duì)數(shù)為縱坐標(biāo)，由雙對(duì)數(shù)數(shù)學(xué)模型Log-Log函數(shù)處理，測(cè)得uPA劑量-反應(yīng)曲線的相關(guān)系數(shù)為r＝0.9986，表明自制試劑盒在uPA濃度為100-5000pg/ml的范圍內(nèi)具有良好的劑量反應(yīng)線性關(guān)系；測(cè)得PAI-1劑量-反應(yīng)曲線的相關(guān)系數(shù)為r＝0.9992，表明自制試劑盒在PAI-1濃度為5-150ng/ml的范圍內(nèi)具有良好的劑量反應(yīng)線性關(guān)系。

③精密度

分別對(duì)濃度為300、1200、5000pg/ml的uPA標(biāo)準(zhǔn)液和濃度為25、100、150ng/ml的PAI-1標(biāo)準(zhǔn)液進(jìn)行測(cè)定，每個(gè)濃度各設(shè)10個(gè)復(fù)孔。分別對(duì)同一批次和不同批次的試劑盒中上述3個(gè)濃度的uPA標(biāo)準(zhǔn)液和PAI-1標(biāo)準(zhǔn)液進(jìn)行重復(fù)測(cè)定10次。并計(jì)算測(cè)量值的平均值和標(biāo)準(zhǔn)差，按照公式計(jì)算變異系數(shù)CV＝標(biāo)準(zhǔn)差/平均值╳100％，結(jié)果顯示，采用本發(fā)明試劑盒中的檢測(cè)試紙條檢測(cè)uPA的批內(nèi)變異系數(shù)(CV％)為2.2～3.0％，批間變異系數(shù)(CV％)為3.8～5.2％，采用本發(fā)明試劑盒中的檢測(cè)試紙條檢測(cè)PAI-1的批內(nèi)變異系數(shù)(CV％)為1.6～2.8％，批間變異系數(shù)(CV％)為2.7～4.0％，符合試劑盒檢定規(guī)程要求，精密度良好。

④特異性

分別以腫瘤標(biāo)志性抗原CA 125 100ng/ml、CA 15-3 100ng/ml、血紅蛋白50ng/ml和人血白蛋白200ng/ml作為待測(cè)樣品，用本發(fā)明檢測(cè)試紙條測(cè)定，每個(gè)濃度重復(fù)測(cè)定3次，結(jié)果均顯示為陰性，表明本發(fā)明檢測(cè)試紙條與其他蛋白沒有交叉反應(yīng)，檢測(cè)的特異性高。

⑤穩(wěn)定性

將檢測(cè)試紙條密封分別置于4℃、37℃存放0天、3天、5天和7天，在不同的處理時(shí)間之后分別測(cè)定uPA和PAI-1標(biāo)準(zhǔn)品，結(jié)果顯示，各時(shí)間點(diǎn)的試劑盒信號(hào)值變化不大，線性關(guān)系良好，表明本發(fā)明檢測(cè)試劑盒具有良好的熱穩(wěn)定性。

對(duì)比例1檢測(cè)試劑盒的制備

對(duì)比例1檢測(cè)試劑盒的制備與實(shí)施例3檢測(cè)試劑盒的制備基本相同，區(qū)別在于，將實(shí)施例2制得的熒光乳膠顆粒標(biāo)記的uPA抗體溶液和熒光乳膠顆粒標(biāo)記的PAI-1抗體溶液以等體積混合后，直接噴涂于經(jīng)預(yù)處理后的結(jié)合墊，噴涂量為4μl/cm，37℃條件下烘干，制成熒光標(biāo)記物結(jié)合墊。

對(duì)比例2檢測(cè)試劑盒的制備

對(duì)比例2檢測(cè)試劑盒的制備與實(shí)施例3檢測(cè)試劑盒的制備基本相同，區(qū)別在于，所述的結(jié)合墊不進(jìn)行預(yù)處理，直接將熒光乳膠標(biāo)記穩(wěn)定液噴涂于結(jié)合墊，噴涂量為4μl/cm，37℃條件下烘干，制成熒光標(biāo)記物結(jié)合墊；

實(shí)施例6采用對(duì)比例1、2和實(shí)施例3制得檢測(cè)試劑盒對(duì)食管癌患者血清中uPA和PAI-1檢測(cè)比較

對(duì)比例1、2檢測(cè)試劑盒的使用方法參考實(shí)施例4具體的步驟。

分別采用對(duì)比例1、2試劑盒和實(shí)施例3試劑盒同時(shí)對(duì)食管癌病人血清樣本40份進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果見下表。

由對(duì)比例1和實(shí)施例1可知，采用熒光乳膠標(biāo)記穩(wěn)定液而非熒光乳膠顆粒標(biāo)記抗體混合液，噴涂于經(jīng)預(yù)處理后的結(jié)合墊，可顯著提高檢測(cè)試紙條檢測(cè)的靈敏度，對(duì)uPA和PAI-1的最低檢測(cè)限均可提高10倍，并降低批內(nèi)、批間變異系數(shù)，提高檢測(cè)的精密度。

由對(duì)比例2和實(shí)施例1可知，將結(jié)合墊預(yù)先進(jìn)行預(yù)處理，可使試劑盒具有更佳的顯色效果，大大提高檢測(cè)的靈敏度和精密度。

以上僅是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，應(yīng)當(dāng)指出的是，上述優(yōu)選實(shí)施方式不應(yīng)視為對(duì)本發(fā)明的限制，本發(fā)明的保護(hù)范圍應(yīng)當(dāng)以權(quán)利要求所限定的范圍為準(zhǔn)。對(duì)于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)，還可以做出若干改進(jìn)和潤飾，這些改進(jìn)和潤飾也應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。