本發(fā)明涉及抗生素檢測技術(shù)的改進(jìn)，具體涉及強力霉素快速檢測試劑盒及其制備、使用方法，屬于免疫學(xué)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

機制與四環(huán)素相同，主要是干擾敏感菌的蛋白質(zhì)合成。它可以特異性地與細(xì)菌核糖體30S亞基在A位置結(jié)合，從而抑制氨基酰-tRNA在該位置上的聯(lián)結(jié)，阻止肽鏈的延長；強力霉素還可以改變細(xì)菌細(xì)胞膜的通透性，使細(xì)胞內(nèi)的核苷酸及其他重要成分漏出，從而抑制細(xì)菌DNA的復(fù)制。強力霉素對金黃色葡萄球菌、肺炎鏈球菌、化膿性鏈球菌、淋球菌、腦膜炎球菌、大腸桿菌、產(chǎn)氣桿菌、志賀菌屬、耶爾森菌、單核細(xì)胞李斯特菌等有較強抗菌活性，對立克次體、支原體、衣原體、放線菌等也有一定作用?？咕V與四環(huán)素、土霉素基本相同。體內(nèi)、外抗菌力均較四環(huán)素強。

強力霉素被吸收后廣泛分布于各組織和體液，分布容積約為0.7L/kg。因脂溶性較高，強力霉素對組織的穿透力較強，在胸導(dǎo)管淋巴液、腹腔積液、腸組織、眼和前列腺組織中的藥物濃度均較高，約為血藥濃度的60％～75％，膽汁中的藥物濃度可達(dá)血藥濃度的10～20倍；在乳汁中也能達(dá)到較高的藥物濃度；強力霉素也可以分布于肝臟、脾臟、骨髓、骨骼、牙本質(zhì)和牙釉質(zhì)中。強力霉素在體內(nèi)蛋白結(jié)合率為80％～95％，清除半衰期為12～22h，腎功能減退者半衰期延長不明顯。藥物主要在肝臟內(nèi)代謝滅活，通過腎小球濾過隨尿液排泄，當(dāng)腎功能損害時，強力霉素從胃腸道的排泄量增加，成為主要的代謝途徑。強力霉素不能經(jīng)透析清除。

強力霉素目前在水產(chǎn)養(yǎng)殖行業(yè)作為一種較為普遍的抗感染藥物使用，有著很好地治療作用，但在實際生產(chǎn)中往往會出現(xiàn)強力霉素過量的情況，導(dǎo)致水產(chǎn)品及養(yǎng)殖水體中存在殘留。根據(jù)農(nóng)業(yè)部2002年12月發(fā)布的《動物性食品中獸藥最高殘留限量》明確規(guī)定，動物性食品肌肉中殘留量為100μg/kg，皮脂中最大殘留量為300μg/kg，肝臟中最大殘留量為300μg/kg，腎臟中最大殘留量為600μg/kg。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明針對強力霉素殘留的現(xiàn)狀，以及其對人體的危害，設(shè)計發(fā)明提供一種能夠快速、簡便、準(zhǔn)確、現(xiàn)場檢測強力霉素的快速檢測試劑盒及其制備、使用方法。

本發(fā)明的技術(shù)方案實現(xiàn)如下

強力霉素快速檢測試劑盒，其特殊之處在于包括自下而上排列的支撐體5、用于快速吸收檢測試劑的吸水層3、由硝酸纖維素膜制成的檢測層2、帶通孔1的蓋板4；保藏號為：CCTCC NO:C201680雜交瘤細(xì)胞DC-C所分泌的、膠體金標(biāo)記的抗強力霉素單克隆抗體C(簡稱：金標(biāo)單抗C)；A液：含1-5％PEG20000、0.01-0.25％吐溫-20的0.01mol/L磷酸鹽緩沖液(PBS)；B液：含0.01-0.25％吐溫-20的0.01mol/L磷酸鹽緩沖液(PBS)；

所述金標(biāo)單抗C是由強力霉素(DC)半抗原與牛血清白蛋白(BSA)通過戊二醛法偶聯(lián)合成強力霉素-牛血清白蛋白(DC-BSA)完全抗原，將其作為免疫原而制備的抗強力霉素單克隆抗體，經(jīng)膠體金標(biāo)記后而制；

所述的膠體金標(biāo)記的單克隆抗體C的制備步驟如下：

1、以公知的膠體金的制備工藝制備膠體金溶液，制得的膠體金的顆粒大小為18-20nm；

2、將單克隆抗體C(3g/L抗體蛋白)，按200μl-3ml加入到上述的100ml膠體金溶液中，慢攪混勻；

3、向混合溶液中加入PEG20000，使其終濃度為1-5％，靜置過夜；

4、將其離心8000-10000轉(zhuǎn)/分，1-1.5小時，棄上清；

5、取離心沉淀，用含有1-5％PEG20000、0.05-0.25％吐溫-20、0.02％疊氮化鈉的0.01mol/L磷酸鹽緩沖液懸起，制成金標(biāo)單抗C；

所述磷酸鹽緩沖液的PH值為7.4，其中含有KCI 0.2g、NaCI 8.0g、KH₂PO₄ 0.2g、Na₂HPO₄12H₂O 2.9g、蒸餾水1000ml；

所述步驟2中單克隆抗體C與膠體金溶液慢攪混勻30-60min；

所述步驟1中所述膠體金溶液的制備方法為按一定的配比將氯金酸與檸檬酸三鈉混合并加熱制備成膠體金溶液；

所述步驟2中單克隆抗體C與膠體金溶液慢攪混勻30-60min。

強力霉素快速檢測試劑盒的使用方法，其特殊之處在于包括以下步驟：

1、取待測溶液5μl，點在蓋板4的通孔1中的硝酸纖維素膜上，晾干；

2、在其上加含1-5％PEG20000的0.01mol/L PBS的A液100μl滲入，進(jìn)行封閉；

3、加入100μl金標(biāo)單抗C，滲入；

4、加入含0.05-0.25％吐溫-20的0.01mol/LPBS的B液100μl滲入；

5、結(jié)果顯示：硝酸纖維素膜上出現(xiàn)紅色斑點為陽性，表示檢測到有強力霉素殘留；無紅色斑點為陰性，表示檢測不到強力霉素，或者強力霉素濃度低于2ug/ml。

本發(fā)明強力霉素快速檢測試劑盒檢測原理：

將待測樣品滴加到硝酸纖維素膜上晾干固定，加封閉液A液封閉之后滴加金標(biāo)單抗C，金標(biāo)單抗C特異性和強力霉素進(jìn)行結(jié)合，加洗液B液清洗之后，洗去未結(jié)合的金標(biāo)抗體，利用膠體金紅色顆粒顯色原理呈現(xiàn)檢測結(jié)果，在檢測層硝酸纖維素膜上呈現(xiàn)紅色斑點，表示有強力霉素殘留；無紅色斑點，表示無強力霉素或殘留量極低。

本發(fā)明具有以下優(yōu)點：

1、本發(fā)明的強力霉素快速檢測試劑盒，從實際的養(yǎng)殖需要出發(fā)，將藥物殘留的檢測搬到的養(yǎng)殖現(xiàn)場，使用時無需專門設(shè)施和操作技術(shù)，適合普通養(yǎng)殖戶養(yǎng)殖現(xiàn)場檢測，應(yīng)用簡單。2、具有檢測快速、簡便、準(zhǔn)確、靈敏等特點，并具有較高的穩(wěn)定性，在5-10min之內(nèi)便可顯示檢測結(jié)果，一旦檢出超標(biāo)可以將養(yǎng)殖動物多養(yǎng)一段時間，讓藥物代謝直至殘留低于國家標(biāo)準(zhǔn)，可以安全上市，這是最方便的一種解決藥殘問題的方法，減少了因藥物殘留對人體的傷害和養(yǎng)殖戶因藥殘超標(biāo)被退貨造成巨大的損失，并改善因藥物殘留送檢麻煩，周期長，收費高等原因造成99％以上養(yǎng)殖戶在養(yǎng)殖動物上市前是不送檢藥殘留的情況。3、在整個膠體金標(biāo)記和試劑盒使用過程中牛血清白蛋白也可起到封閉作用，但為防止非特異性結(jié)合，均以適當(dāng)濃度的、分子量為20000的PEG所代替，因免疫原種含有牛血清白蛋白，因此，用PEG代替牛血清白蛋白可杜絕因牛血清白蛋白而致的交叉反應(yīng)，進(jìn)一步保證了試劑盒的特異性。

附圖說明

圖1：本發(fā)明強力霉素快速檢測試劑盒的結(jié)構(gòu)示意圖；

圖2：DC-BSA的紫外特征圖譜；

圖3：DC的紫外特征圖譜；

圖4：BSA的紫外特征圖譜；

圖5：DC-BSA、BSA、DC三組圖譜擬合后的紫外特征圖譜；

圖6：OVA的紫外特征圖譜；

圖7：DC-OVA的紫外特征圖譜；

圖8：DC的紫外特征圖譜；

圖9：DC-OVA，OVA，DC三組圖譜擬合后的紫外特征圖譜。

雜交瘤細(xì)胞株DC－C，其保藏編號為：CCTCC NO：C201680；保藏單位全稱及簡稱：中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)；保藏單位地址：湖北省武漢市武昌珞珈山武漢大學(xué)保藏中心；保藏日期：2016年5月20日。

具體實施方式

本發(fā)明的實施例結(jié)合附圖進(jìn)一步描述如下：

實施例1

強力霉素完全抗原的制備：稱取100mg BSA加入到10mL PBS(pH 7.4)中，稱取30mg DC溶于PBS中，在DC溶液緩慢攪拌下逐滴加入BSA溶液，隨后緩慢滴加200μL的GA(濃度25％)，加入的同時要不斷攪拌，在避光及4℃條件下反應(yīng)24h，以4000rpm轉(zhuǎn)速離心5min，取上清液裝入提前處理好的透析袋中，PBS為透析液透析3d，每8h更換一次透析液，透析完全后，偶聯(lián)產(chǎn)物分裝，-20℃保存。相同的方法制備包被原DC-OVA。合成原理圖如下所示：

實施例2

紫外特征圖譜

完全抗原DC-BSA的特征吸收峰為260nm，而DC的特征吸收峰為378nm，BSA的特征吸收峰為278nm，完全抗原的紫外特征峰發(fā)生了明顯的位移，表明偶聯(lián)成功。掃描結(jié)果見附圖2-附圖5所示。

完全抗原DC-OVA的特征吸收峰為265nm，而DC的特征吸收峰為378nm,OVA的特征吸收峰為280nm，完全抗原的紫外特征峰發(fā)生了明顯的位移，表明偶聯(lián)成功。掃描結(jié)果如附圖6-附圖9所示。

實施例3

抗強力霉素的單克隆抗體的制備：本發(fā)明的分泌抗強力霉素的單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞，其制備與選擇的方法如下：

(1)用戊二醛法合成強力霉素完全抗原，包括免疫原DC-BSA，包被原DC-OVA；

(2)用免疫原DC-BSA免疫Balb/c小白鼠；

(3)將免疫小鼠的脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞的融合，培養(yǎng)得166株雜交瘤細(xì)胞；

(4)用包被原DC-OVA包板間接ELISA法篩選陽性雜交瘤細(xì)胞株；

(5)采用有限稀釋法對其中1株陽性最強的雜交瘤細(xì)胞進(jìn)行了克??；

(6)通過間接ELISA法篩選出效價最高的抗強力霉素的單抗1B7-1F9二次克隆的細(xì)胞株制備的抗體，制備金標(biāo)單抗。見表1

表1：單抗效價

實施例4

本發(fā)明的強力霉素單抗C的特異性鑒定：為了確定單克隆抗體是否能夠特異性結(jié)合強力霉素，就要對所得抗體做特異性檢測及交叉實驗，確定單抗與其他抗生素是否存在交叉現(xiàn)象。分別配置0.1μg/ml的強力霉素、土霉素、新諾明、鹽酸諾氟沙星及氟苯尼考，采用競爭ELISA的檢測方法，對各種藥物進(jìn)行交叉實驗。以DC-OVA為包被原，純化后的單抗為第一抗體，加入一抗后立即加入上述幾種藥物，每孔加100μl，以PBS作為對照，加入二抗及底物緩沖液后，測定各個孔的OD值。結(jié)果顯示強力霉素單抗C與這四種藥物均不存在交叉現(xiàn)象，強力霉素與陽性對照比較，存在差異，說明本實驗制備的單抗與強力霉素發(fā)生特異性結(jié)合，與其他抗生素不能夠特異結(jié)合。實驗結(jié)

果參見表2。

表2單抗交叉實驗(n＝6)

注：*強力霉素組與陽性相比較，其P值為0.0232＜0.05，說明存在顯著差異。

實施例5

膠體金標(biāo)記的單克隆抗體C的制備步驟如下：

1、膠體金的制備：10-20nm膠體金顆粒制備，將0.01％氯金酸溶液250ml與1％檸檬酸鈉6.65ml混合，加熱至100攝氏度，制成膠體金溶液，該溶液的pH值：用0.2M碳酸鉀調(diào)至8.2，備用；

2、金標(biāo)單抗C的制備：

抗強力霉素單抗?jié)舛葹?g/L時，100ml膠體金標(biāo)記的單抗量為1.5ml，按此比例將抗強力霉素單抗加入到膠體金溶液中，慢攪50min，加入3％PEG20000，4℃過夜；然后將其在4℃下，8000r離心60min，離心沉淀，棄上清，用含有3％PEG20000和0.25％吐溫-20的0.01mol/L磷酸鹽緩沖液(KCL 0.2g,NaCL 8.0g,KH₂PO₄ 0.2g,Na₂HPO₄12H₂O 2.9g，蒸餾水1000ml,pH 7.4)懸起，再加疊氮化鈉將濃度調(diào)至0.02％，即制成金標(biāo)單抗C。

實施例6

本發(fā)明的強力霉素快速檢測試劑盒檢測的最低殘留量為2ug/ml。高于農(nóng)業(yè)部2002年12月發(fā)布的《動物性食品中獸藥最高殘留限量》規(guī)定的皮脂中最大殘留量為300μg/kg，肝臟中最大殘留量為300μg/kg，腎臟中最大殘留量為600μg/kg，動物性食品肌肉中殘留量為100μg/kg，其中腎臟殘留檢測高出3倍，可以用于池邊快速篩選。結(jié)果見表3

表3：金標(biāo)單抗C最佳工作濃度

注：++表示斑點顏色為紫紅色，檢測結(jié)果為強陽性；+表示斑點顏色為紅色，檢測結(jié)果為陽性；—表示斑點為無色，檢測結(jié)果為陰性。

實施例7

本發(fā)明的強力霉素快速檢測試劑盒的使用方法，即強力霉素的檢測步驟：取待測樣品5μl點于硝酸纖維素膜上晾干，加A液(封閉液)100μl滲入，然后加金標(biāo)單抗C 100μl滲入，加B液(洗液)100μl滲入，5分鐘讀結(jié)果。

陽性結(jié)果：檢測層硝酸纖維素膜上呈現(xiàn)紅色斑點，表示有強力霉素殘留；

陰性結(jié)果：檢測層硝酸纖維素膜上無紅色斑點，表示檢測不到強力霉素或強力霉素濃度低于2ug/ml。