本發(fā)明涉及貝類血淋巴細(xì)胞分類方法，尤其涉及基于多元技術(shù)的貝類血淋巴細(xì)胞分類方法。

背景技術(shù)：

因貝類缺乏特異性免疫(acquired immunity或adaptive immunity)，其免疫防御功能依賴于天然免疫(innate immunity)的相關(guān)機(jī)制。這些免疫防御機(jī)制主要由貝類的血淋巴細(xì)胞來行使。近年來，隨著經(jīng)濟(jì)貝類養(yǎng)殖規(guī)模的擴(kuò)大，一些病菌性或者寄生蟲引起的貝類疾病頻繁出現(xiàn)，給貝類養(yǎng)殖業(yè)造成了重大經(jīng)濟(jì)損失，研究貝類血淋巴細(xì)胞的分類、形態(tài)、結(jié)構(gòu)以及功能，了解它們在機(jī)體免疫過程中所起的作用，對有效地緩解和解決經(jīng)濟(jì)貝類的一些病原性病害問題尤為重要。

近年來,有關(guān)貝類血淋巴細(xì)胞的分類已經(jīng)進(jìn)行了大量的研究，但由于血淋巴細(xì)胞分類方法因人而異，特別是不同種貝類的血淋巴細(xì)胞在形態(tài)上存在較大的差異，迄今為止仍無嚴(yán)格統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)。其中，以染色后細(xì)胞質(zhì)中顆粒物質(zhì)的有無作為主要的分類指標(biāo)，把貝類血淋巴細(xì)胞分為顆粒細(xì)胞(granulocyte—含有顆粒物質(zhì)，即含大量顆?；蛏倭款w粒)和透明細(xì)胞(hyalinocyte—不含顆粒物質(zhì)或者所含顆粒物質(zhì)極少，即相對于同實(shí)驗(yàn)所劃分顆粒細(xì)胞來說，這極少的顆粒物質(zhì)可忽略不計(jì))，這2種主要的細(xì)胞類群得到廣泛認(rèn)可。在貝類血淋巴細(xì)胞的類型中也有特例的出現(xiàn)，如扇貝的血淋巴細(xì)胞類型中就缺少顆粒細(xì)胞，故并不是所有的貝類血淋巴細(xì)胞都可分為顆粒細(xì)胞和透明細(xì)胞這兩類。且將雙殼類血淋巴細(xì)胞劃分為顆粒細(xì)胞和無顆粒細(xì)胞的簡單化限制了我們對血淋巴細(xì)胞功能的認(rèn)識。透明細(xì)胞在幾個(gè)貝類種中也無明確定義，有的稱之為無顆粒細(xì)胞，而且不同血淋巴細(xì)胞種類的功能不能簡單地推廣到別的種。在不同種貝類的血淋巴細(xì)胞分類中，由于不能保證所研究的細(xì)胞系處于相同的發(fā)育階段，可能出現(xiàn)用形態(tài)學(xué)手段不能相對準(zhǔn)確區(qū)分的現(xiàn)象，因此，貝類血淋巴細(xì)胞的分類不應(yīng)僅局限于上述兩類細(xì)胞，在貝類血淋巴細(xì)胞的分類研究中綜合運(yùn)用多種方法和技術(shù)很有必要。

綜上所述，亟需一種貝類血淋巴細(xì)胞的分類方法，對貝類血淋巴細(xì)胞進(jìn)行分類研究，能夠用形態(tài)學(xué)手段相對準(zhǔn)確的區(qū)分，避免了由于貝類種間的差異性和研究方法的不同，造成了貝類血淋巴細(xì)胞分類上的復(fù)雜化，難以獲得統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)。而關(guān)于這種貝類血淋巴細(xì)胞的分類方法目前還未見報(bào)道。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是針對現(xiàn)有技術(shù)中的不足，提供一種貝類血淋巴細(xì)胞的分類方法，對貝類血淋巴細(xì)胞進(jìn)行分類研究，能夠用形態(tài)學(xué)手段相對準(zhǔn)確的區(qū)分，避免了由于貝類種間的差異性和研究方法的不同，造成了貝類血淋巴細(xì)胞分類上的復(fù)雜化，難以獲得統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案是：

基于多元技術(shù)的貝類血淋巴細(xì)胞分類方法，所述方法包括以下步驟：

步驟S1：血淋巴采集和總血球計(jì)數(shù)的步驟；采用注射器從貝類閉殼肌處抽取血淋巴，將收集的血淋巴液儲存于冰中以減少細(xì)胞自發(fā)性凝集，然后使用MultisizerTM3庫爾特顆粒計(jì)數(shù)儀進(jìn)行測定，以確定血淋巴中細(xì)胞的濃度和大小分布頻率；

步驟S2：細(xì)胞光學(xué)顯微鏡分析的步驟；將步驟S1種抽取的血淋巴進(jìn)行染色處理，經(jīng)玻片用中性樹膠封片劑封片，然后置于光學(xué)顯微鏡下觀察；

步驟S3：流式細(xì)胞術(shù)分析的步驟；從血淋巴液中新鮮采集的血淋巴細(xì)胞通過BD FACSCALIBUR流式細(xì)胞分析儀分析；

步驟S4：透射電鏡技術(shù)分析的步驟；將血淋巴細(xì)胞進(jìn)行處理配制成顆粒物，并把顆粒物處理配制成切片，經(jīng)透射電子顯微鏡檢查切片；

步驟S5：掃描電鏡技術(shù)分析的步驟；將血淋巴液滴加在載玻片上讓細(xì)胞粘附，并把粘附的細(xì)胞進(jìn)行沖洗、固定、脫水、干燥處理；

步驟S6：統(tǒng)計(jì)分析的步驟；進(jìn)行數(shù)據(jù)分析之前，所有數(shù)據(jù)使用SPSS 16.0進(jìn)行Shapiro-Wilk's檢驗(yàn)檢查正態(tài)分布性，用Levene's檢驗(yàn)檢查方差齊性，百分比數(shù)據(jù)在分析前進(jìn)行反正弦轉(zhuǎn)換。

優(yōu)選地，所述步驟S1中血淋巴液的采集使用配有22G針頭的1mL注射器從貝類閉殼肌處抽取血淋巴，每個(gè)貽貝收集1mL血淋巴，為了減少個(gè)體差異，每次取6只貝的血淋巴液混合進(jìn)行分析，檢測時(shí)，將0.5mL血淋巴液加入到9.5mL II溶液中，每次檢測1000μL的混合溶液并計(jì)算其中的細(xì)胞個(gè)數(shù)，使用MultisizerTM3軟件分析數(shù)據(jù)。

優(yōu)選地，步驟S2中染色處理的步驟為：貝類抽取血淋巴后，將50μL血淋巴液滴在Super Frost Plus載玻片上，血細(xì)胞在潮濕的環(huán)境中黏著在玻片上靜置20min后，將其浸泡于戊二醛溶液中固定20min，然后用曙紅亞甲基藍(lán)II染液，進(jìn)行染色6min，接著，將玻片轉(zhuǎn)移到Giemsa染液中浸泡染色30min，再用磷酸鹽緩沖液洗滌，直至流下的液體變透明為止，后于空氣中自然風(fēng)干。

優(yōu)選地，步驟S3中流式細(xì)胞分析儀裝備一個(gè)可以激發(fā)448nm激光的空氣制冷的氬激光器，檢測之前，首先對FSC閾值進(jìn)行設(shè)定，以消除細(xì)胞碎片和其他雜質(zhì)的干擾，為了減小偶然誤差，每個(gè)指標(biāo)的檢測重復(fù)6次，取其平均值，細(xì)胞分布圖以細(xì)胞相對大小和粒度表示，并且熒光通道對應(yīng)于相應(yīng)的標(biāo)記，對于每個(gè)血細(xì)胞樣本，共獲得20000個(gè)項(xiàng)目，并且調(diào)整流量以保證總項(xiàng)目數(shù)低于300s-1，前向散射檢測器設(shè)定為E00，側(cè)向散射檢測器設(shè)定為380-420V，隨后得到血細(xì)胞群的熒光頻率分布柱狀圖，數(shù)據(jù)采用BD CellQuestTM Pro軟件分析。

優(yōu)選地，步驟S4具體為：取5ml貽貝的血淋巴細(xì)胞，4℃下在含4％多聚甲醛，2.5％戊二醛和0.3M(mol/L)蔗糖的0.1M二甲砷酸鹽緩沖液中固定10分鐘，吸出上清液，在室溫下以400g離心10分鐘，把顆粒物再懸浮然后嵌入進(jìn)3％瓊脂液中，把嵌入式細(xì)胞切成小塊，在4℃下浸入新鮮的隔夜固定液中，把細(xì)胞用二甲砷酸鹽緩沖液沖洗，在4℃下用含1％四氧化鋨的0.1M二甲砷酸鹽緩沖液固定一個(gè)小時(shí)，Osmicated樣本用相同的緩沖液和蒸餾水漂洗，在不同濃度的乙醇溶液中進(jìn)行脫水處理，轉(zhuǎn)移到丙酮溶液并在嵌入前在Spurr’s樹脂中逐漸滲透，用Leica Ultracut UCT超薄切片機(jī)制作超薄切片，置于火棉膠涂層，100目銅網(wǎng)上，切片用2％含水醋酸雙氧鈾染色15分鐘然后用雷諾檸檬酸鉛染色10分鐘，在80kV下用透射電子顯微鏡檢查切片。

優(yōu)選地，步驟S5具體為：把SuperFrost Plus顯微鏡載玻片切成小塊，取500ul含有1×106cells ml-1的血淋巴液滴加在載玻片上，并置于保濕室內(nèi)在室溫條件下靜置25min讓細(xì)胞粘附，粘附的細(xì)胞置入含4％多聚甲醛，2.5％戊二醛以及0.3M(mol/L)蔗糖的0.1M的二甲砷酸鹽緩沖液中2小時(shí)，隨后用0.1M的二甲砷酸鹽緩沖液進(jìn)行沖洗，再用含1％四氧化鋨的0.1M的二甲砷酸鹽緩沖液進(jìn)行固定，在不同濃度的乙醇溶液中進(jìn)行脫水處理，最后浸泡在丙酮中，脫水后的樣品在CO2環(huán)境中進(jìn)行干燥，置于鋁座上用BALTEC SCD 005Sputter Coater噴涂金-鈀層，用FEI/Philips XL30 Esem-FEG掃描電子顯微鏡調(diào)節(jié)于10kV觀察。

優(yōu)選地，步驟S6使用student t檢驗(yàn)和單因素方差分析進(jìn)行分析檢驗(yàn)。

8.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，步驟S2中使用到的戊二醛溶液為2％濃度，無菌海水配制而成；步驟S2中使用到的曙紅亞甲基藍(lán)II染液為0.2mL曙紅溶液和2g亞甲基藍(lán)定容和100mL 95％酒精溶液配制而成；步驟S2的Giemsa染液的制作方法為：吉姆薩粉l.0g，甘油66mL，甲醇66mL，將Giemsa粉放入研缽中，先加入少量甘油，研磨至無顆粒為止，然后再將全部甘油倒入，放56℃溫箱中2h后，加入甲醇，將配制好的染液密封保存棕色瓶內(nèi)，于0-4℃保存；步驟S2磷酸鹽緩沖液為136mmol/L NaCl,2.68mmol/L KCl,10.14mmol/L Na2HPO4,1.76mmol/L KH2PO4,pH 7.5。

優(yōu)選地，步驟S4乙醇溶液不同濃度具體為30％,50％,70％,80％,95％和100％。

優(yōu)選地，步驟S5乙醇溶液不同濃度具體為30％，50％，70％,，80％，95％和100％。

本發(fā)明優(yōu)點(diǎn)在于：

1.在現(xiàn)在技術(shù)的基礎(chǔ)上，克服不足，能夠用形態(tài)學(xué)手段相對準(zhǔn)確的區(qū)分，避免了由于貝類種間的差異性和研究方法的不同，造成了貝類血淋巴細(xì)胞分類上的復(fù)雜化，難以獲得統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)；綜合運(yùn)用庫爾特計(jì)數(shù)儀、光鏡、透射電鏡、掃描電鏡及流式細(xì)胞儀對貝類血淋巴細(xì)胞進(jìn)行分類研究，以期為貝類血淋巴細(xì)胞的分類研究開啟新的局面。

2.本發(fā)明避免了由于貝類種間的差異性和研究方法的不同，造成的貝類血淋巴細(xì)胞分類上的復(fù)雜化，以致難以獲得統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)的現(xiàn)象。

3.本發(fā)明為研究貝類血淋巴細(xì)胞的形態(tài)、結(jié)構(gòu)、功能以及它們在機(jī)體免疫過程中所起的作用提供更為科學(xué)的資料，從而能更有效地緩解和解決經(jīng)濟(jì)貝類的一些病原性病害問題。

附圖說明

附圖1是本發(fā)明的基于多元技術(shù)的貝類血淋巴細(xì)胞分類方法流程示意圖。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合附圖對本發(fā)明提供的具體實(shí)施方式作詳細(xì)說明。

請參照圖1，圖1是本發(fā)明的基于多元技術(shù)的貝類血淋巴細(xì)胞分類方法流程示意圖?；诙嘣夹g(shù)的貝類血淋巴細(xì)胞分類方法，所述方法包括以下步驟：

步驟S1：血淋巴采集和總血球計(jì)數(shù)的步驟；采用注射器從貝類閉殼肌處抽取血淋巴，將收集的血淋巴液儲存于冰中以減少細(xì)胞自發(fā)性凝集，然后使用MultisizerTM3庫爾特顆粒計(jì)數(shù)儀進(jìn)行測定，以確定血淋巴中細(xì)胞的濃度和大小分布頻率；

步驟S2：細(xì)胞光學(xué)顯微鏡分析的步驟；將步驟S1種抽取的血淋巴進(jìn)行染色處理，經(jīng)玻片用中性樹膠封片劑封片，然后置于光學(xué)顯微鏡下觀察；

步驟S3：流式細(xì)胞術(shù)分析的步驟；從血淋巴液中新鮮采集的血淋巴細(xì)胞通過BD FACSCALIBUR流式細(xì)胞分析儀分析；

步驟S4：透射電鏡技術(shù)分析的步驟；將血淋巴細(xì)胞進(jìn)行處理配制成顆粒物，并把顆粒物處理配制成切片，經(jīng)透射電子顯微鏡檢查切片；

步驟S5：掃描電鏡技術(shù)分析的步驟；將血淋巴液滴加在載玻片上讓細(xì)胞粘附，并把粘附的細(xì)胞進(jìn)行沖洗、固定、脫水、干燥處理；

步驟S6：統(tǒng)計(jì)分析的步驟；進(jìn)行數(shù)據(jù)分析之前，所有數(shù)據(jù)使用SPSS 16.0進(jìn)行Shapiro-Wilk's檢驗(yàn)檢查正態(tài)分布性，用Levene's檢驗(yàn)檢查方差齊性，百分比數(shù)據(jù)在分析前進(jìn)行反正弦轉(zhuǎn)換。

優(yōu)選地，所述步驟S1中血淋巴液的采集使用使用配有22G針頭的1mL注射器從貝類閉殼肌處抽取血淋巴。每個(gè)貽貝收集1mL血淋巴，為了減少個(gè)體差異，每次取6只貝的血淋巴液混合進(jìn)行分析。收集的血淋巴液儲存于冰中以減少細(xì)胞自發(fā)性凝集。血淋巴液使用MultisizerTM3庫爾特顆粒計(jì)數(shù)儀(Beck man Coulter公司)進(jìn)行測定，以確定血淋巴中細(xì)胞的濃度(每毫升的細(xì)胞數(shù))和大小分布頻率。檢測時(shí)，將0.5mL血淋巴液加入到9.5mLII溶液中，每次檢測1000μL的混合溶液并計(jì)算其中的細(xì)胞個(gè)數(shù)，使用MultisizerTM3軟件分析數(shù)據(jù)(Beck man Coulter,Inc.4300N.Harbor Boulevard,Box 3100 Fullerton,California 92834-3100,USA)。

優(yōu)選地，所述步驟S2中細(xì)胞光學(xué)顯微鏡分析的具體步驟是貝類抽取血淋巴后，將50μL血淋巴液滴在Super Frost Plus載玻片上(Men zel-Glaser,Germany)。血細(xì)胞在潮濕的環(huán)境中黏著在玻片上靜置20min后，將其浸泡于戊二醛溶液(2％濃度；無菌海水配制，F(xiàn)SSW)中固定20min，然后用曙紅亞甲基藍(lán)II染液(0.2mL曙紅溶液和2g亞甲基藍(lán)定容和100mL 95％酒精溶液中)進(jìn)行染色6min。接著，將玻片轉(zhuǎn)移到Giemsa染液(吉姆薩粉(Giemsa stain)l.0g，甘油(AR)66mL，甲醇(AR)66mL，將Giemsa粉放入研缽中，先加入少量甘油，研磨至無顆粒為止，然后再將全部甘油倒入，放56℃溫箱中2h后，加入甲醇，將配制好的染液密封保存棕色瓶內(nèi)，于0-4℃保存)中浸泡染色30min，再用磷酸鹽緩沖液(PBS:136mmol/L NaCl,2.68mmol/L KCl,10.14mmol/L Na2HPO4,1.76mmol/L KH2PO4,pH 7.5)洗滌，直至流下的液體變透明為止，后于空氣中自然風(fēng)干。經(jīng)過染色處理后，血淋巴細(xì)胞中的酸性顆粒物質(zhì)被染成粉紅色，堿性顆粒物質(zhì)被染成藍(lán)色。玻片用中性樹膠封片劑(Fisher Scientific,USA)封片，然后置于光學(xué)顯微鏡下觀察(Axioplan 2 Imaging,Carl Zeiss,Germany)。顯微圖像使用Color-View II CCD攝像機(jī)(Olympus/Soft Imaging System,Germany)拍照。血淋巴細(xì)胞及細(xì)胞核的直徑用圖像分析軟件(Olympus Soft Imaging Solutions GmbH,Germany)進(jìn)行測量。

優(yōu)選地，所述步驟S3中流式細(xì)胞術(shù)的具體步驟是從血淋巴液中新鮮采集的血淋巴細(xì)胞通過BD FACSCALIBUR流式細(xì)胞分析儀(BD Biosciences公司)分析，流式細(xì)胞分析儀裝備一個(gè)可以激發(fā)448nm激光的空氣制冷的氬激光器。檢測之前，首先對FSC閾值進(jìn)行設(shè)定，以消除細(xì)胞碎片和其他雜質(zhì)的干擾。為了減小偶然誤差，每個(gè)指標(biāo)的檢測重復(fù)6次，取其平均值。細(xì)胞分布圖以細(xì)胞相對大小(FSC值)和粒度(SSC值)表示，并且熒光通道對應(yīng)于相應(yīng)的標(biāo)記。對于每個(gè)血細(xì)胞樣本，共獲得20000個(gè)項(xiàng)目，并且調(diào)整流量以保證總項(xiàng)目數(shù)低于300s-1。前向散射檢測器設(shè)定為E00，側(cè)向散射檢測器設(shè)定為380-420V。隨后得到血細(xì)胞群的熒光頻率分布柱狀圖。數(shù)據(jù)采用BD CellQuestTM Pro軟件分析(BD Biosciences,USA)。

優(yōu)選地，所述步驟S4中透射電鏡技術(shù)的具體分析步驟是取5ml貽貝的血淋巴細(xì)胞，4℃下在含4％多聚甲醛，2.5％戊二醛和0.3M(mol/L)蔗糖的0.1M二甲砷酸鹽緩沖液(pH 7.2)中固定10分鐘。吸出上清液，在室溫下以400g離心10分鐘。把顆粒物再懸浮然后嵌入進(jìn)3％瓊脂液中。把嵌入式細(xì)胞切成小塊(ca.1mm3)，在4℃下浸入新鮮的隔夜固定液中。把細(xì)胞用二甲砷酸鹽緩沖液沖洗，在4℃下用含1％四氧化鋨(OsO4)的0.1M二甲砷酸鹽緩沖液(pH 7.2)固定一個(gè)小時(shí)。Osmicated樣本用相同的緩沖液和蒸餾水漂洗，在不同濃度的乙醇溶液(30％,50％,70％,80％,95％和100％)中進(jìn)行脫水處理，轉(zhuǎn)移到丙酮溶液并在嵌入前在Spurr’s樹脂中逐漸滲透。用Leica Ultracut UCT超薄切片機(jī)(Austria)制作超薄切片(60-90nm)，置于火棉膠涂層，100目銅網(wǎng)上。切片用2％含水醋酸雙氧鈾染色15分鐘然后用雷諾檸檬酸鉛染色10分鐘。在80kV下用透射電子顯微鏡(FEI/Philips Tecnai 12 BioTWIN,Netherlands)檢查切片。

優(yōu)選地，所述步驟S5中掃描電鏡技術(shù)的具體分析步驟是把SuperFrost Plus顯微鏡載玻片(Menzel-Glaser,Germany)切成小塊(ca.25mm×25mm)。取500ul含有1×106 cells ml-1的血淋巴液滴加在載玻片上，并置于保濕室內(nèi)在室溫條件下靜置25min讓細(xì)胞粘附。粘附的細(xì)胞置入含4％多聚甲醛，2.5％戊二醛以及0.3M(mol/L)蔗糖的0.1M的二甲砷酸鹽緩沖液(pH 7.2)中2小時(shí)。隨后用0.1M的二甲砷酸鹽緩沖液進(jìn)行沖洗，再用含1％四氧化鋨的0.1M的二甲砷酸鹽緩沖液進(jìn)行固定，在不同濃度的乙醇溶液(30％，50％，70％,，80％，95％和100％)中進(jìn)行脫水處理，最后浸泡在丙酮中。脫水后的樣品在CO2環(huán)境中(BAL-TEC CPD 030 Critical Point Dryer,Liechtenstein)進(jìn)行干燥，置于鋁座上用BALTEC SCD 005 Sputter Coater(Liechtenstein)噴涂金-鈀層，用FEI/Philips XL30 Esem-FEG掃描電子顯微鏡(Netherlands)調(diào)節(jié)于10kV觀察。

優(yōu)選地，所述步驟S6中統(tǒng)計(jì)分析應(yīng)在進(jìn)行數(shù)據(jù)分析之前，所有數(shù)據(jù)使用SPSS 16.0進(jìn)行Shapiro-Wilk's檢驗(yàn)檢查正態(tài)分布性，用Levene's檢驗(yàn)檢查方差齊性。百分比數(shù)據(jù)在分析前進(jìn)行反正弦轉(zhuǎn)換。核質(zhì)比(karyoplasmic ratio)，即N/C,為細(xì)胞核直徑與細(xì)胞胞質(zhì)直徑的比值。為了更好的比較不同細(xì)胞亞群之間的特點(diǎn)，使用student t檢驗(yàn)和單因素方差分析(ANOVA)進(jìn)行分析檢驗(yàn)。以P<0.05代表差異顯著，結(jié)果表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。

本發(fā)明的一種基于多元技術(shù)的貝類血淋巴細(xì)胞分類方法：

1.在現(xiàn)在技術(shù)的基礎(chǔ)上，克服不足，能夠用形態(tài)學(xué)手段相對準(zhǔn)確的區(qū)分，避免了由于貝類種間的差異性和研究方法的不同，造成了貝類血淋巴細(xì)胞分類上的復(fù)雜化，難以獲得統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)；綜合運(yùn)用庫爾特計(jì)數(shù)儀、光鏡、透射電鏡、掃描電鏡及流式細(xì)胞儀對貝類血淋巴細(xì)胞進(jìn)行分類研究，以期為貝類血淋巴細(xì)胞的分類研究開啟新的局面。

2.本發(fā)明避免了由于貝類種間的差異性和研究方法的不同，造成的貝類血淋巴細(xì)胞分類上的復(fù)雜化，以致難以獲得統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)的現(xiàn)象。

3.本發(fā)明為研究貝類血淋巴細(xì)胞的形態(tài)、結(jié)構(gòu)、功能以及它們在機(jī)體免疫過程中所起的作用提供更為科學(xué)的資料，從而能更有效地緩解和解決經(jīng)濟(jì)貝類的一些病原性病害問題。

以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員，在不脫離本發(fā)明方法的前提下，還可以做出若干改進(jìn)和補(bǔ)充，這些改進(jìn)和補(bǔ)充也應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。