本發(fā)明屬于中草藥藥物篩選領域，具體涉及一種中草藥黃嘌呤氧化酶抑制劑篩選新方法。

背景技術：

許多中草藥提取物含有黃嘌呤氧化酶(XOD)抑制劑且療效顯著，毒副作用低，安全性高。因此，從中草藥中篩選XOD抑制劑已成為當前研究熱點。

目前，中草藥XOD抑制劑篩選方法主要有紫外分光光度計法、HPLC法、質譜法等。這些方法都是通過對XOD的催化產物尿酸或超氧陰離子進行測定，因而都存在一定的缺陷：如紫外分光光度法需要大量的酶及待篩選成分；HPLC及質譜法需要復雜的樣品預處理過程；此外還有可能產生假陽性或假陰性結果。因此，迫切需要開發(fā)更為簡單、精確、靈敏的XOD抑制劑的篩選新方法。

酶催化反應的本質是電子按一定電子轉移通道進行轉移。XOD催化反應的電子轉移通道包含四個活性中心：一個Mo活性位點，兩個[2Fe–2S]簇，一個FAD輔酶因子。當XOD與底物結合，Mo接受來自黃嘌呤的兩個電子，并經[2Fe–2S]簇傳遞給FAD產生FADH₂。當有抑制劑如別嘌呤醇存在時，抑制劑可與Mo活性位點結合；而非布索坦可阻礙底物與Mo活性位點結合，此時酶催化反應電子轉移被阻抑。得益于納米功能材料的發(fā)展，這種電子轉移信號可以用電化學方法進行監(jiān)測，因而黃嘌呤氧化酶催化黃嘌呤(XAN)氧化反應過程中的電子轉移信號可用于構建中草藥黃嘌呤氧化酶抑制劑的篩選。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的原理是基于酶的催化反應本質為電子轉移，其目的是提供一種新的中草藥黃嘌呤氧化酶抑制劑篩選方法。

本發(fā)明是通過以下技術方案實現(xiàn)的：

(1)先將碳納米材料修飾到電極表面，再將黃嘌呤氧化酶修飾到碳納米材料修飾的電極表面；或將碳納米材料與黃嘌呤氧化酶一起修飾到電極表面；

(2)修飾電極干燥后在通氮除氧的緩沖溶液中，采用電化學方法測定修飾電極對黃嘌呤的響應；

(3)基于黃嘌呤的信號變化篩選中草藥黃嘌呤氧化酶抑制劑。

進一步地，具體操作步驟如下：

(1)將碳納米材料用濃硫酸與濃硝酸進行超聲處理，洗滌干燥后用水分散，再將碳納米材料修飾到電極表面，之后干燥，將黃嘌呤氧化酶用水分散，再修飾到經碳納米材料修飾后的電極表面；或將碳納米材料與黃嘌呤氧化酶配成溶液一起修飾到電極表面，之后干燥，得到修飾后的電極；

(2)將步驟(1)得到的修飾后的電極放入通氮除氧的緩沖溶液中，加入黃嘌呤，靜置吸附5分鐘，采用電化學方法測定修飾電極對黃嘌呤的響應；

(3)將修飾電極沖洗干凈后放入另一通氮除氧的緩沖溶液中，加入中草藥化學成分，靜置吸附5分鐘，再加入黃嘌呤，靜置吸附5分鐘，采用電化學方法測定修飾電極對黃嘌呤的響應；

(4)同時，分別測定(2)、(3)中不加黃嘌呤與中草藥化學成分時各實驗的電化學背景信號；

(5)加入不同量的中草藥化學成分，重復(3)、(4)操作；

(6)根據(jù)公式篩選中草藥黃嘌呤氧化酶抑制劑：計算化學成分對黃嘌呤氧化酶的抑制活性：其中ΔI₀是不加樣品的峰電流與其背景的電流差，ΔI₁是加樣品的峰電流與其背景的電流差。

其中步驟(1)所述的碳納米材料為碳納米管或石墨烯，還可用碳納米管或石墨烯與殼聚糖、聚苯胺等高分子材料的混合物代替碳納米材料。

其中步驟(2)和(3)所述的電化學方法為循環(huán)伏安法或計時電流法。

本發(fā)明的篩選機理如說明書附圖中圖1所示。XOD催化XAN氧化電子轉移機制見圖1，圖中圓圈代表XOD。首先，XAN與XOD的Mo位點結合，生成尿酸產物，Mo得到兩個電子，然后將這兩個電子通過[Fe₂-S₂]快速傳遞到FAD，F(xiàn)AD被還原成FADH₂。FADH₂的電子在特定的電位下可傳遞到電極，從而在電極上產生靈敏的電流信號。當有抑制劑存在時，抑制劑可與Mo結合或阻止XAN與Mo接近，從而使XOD電子轉移通道被阻抑，XOD對XAN的響應電流信號降低。因此，通過觀測XOD電子轉移阻抑信號可以應用于XOD抑制劑的篩選。

本發(fā)明碳納米材料的信號放大效應機理見說明書附圖中圖2。XOD的輔酶因子FAD位于酶分子內部，F(xiàn)ADH₂的電子在一般情況下很難傳遞到電極表面。但隨著納米材料的引入，其優(yōu)良的導電性使得FADH₂上的電子能夠快速到達電極表面產生強烈的電流信號。因此，本文引入納米材料來實現(xiàn)這一目的，其結果見圖2。

本發(fā)明具有如下優(yōu)越性：

這種方法完全不同于其它基于酶催化產物的篩選方法，其信號來源具有唯一性，而且不僅可提供待測物對XOD的抑制活性信息，還可以直觀觀測待測物電化學信息，二者信息關聯(lián)即可排除假陽性與假陰性篩選結果；此外，得益于納米材料的信號放大功能，獲得的酶催化電子轉移阻抑信號非常靈敏，樣品篩選用量少；最后，篩選方法簡單快速。

附圖說明

圖1為本發(fā)明中草藥XOD抑制劑的篩選原理圖。

圖2為本發(fā)明碳納米材料的信號放大效應機理圖，其中圖2A為碳納米材料修飾電極(1)、XOD+碳納米材料修飾電極(2)的循環(huán)伏安圖；圖2B為XOD+碳納米材料修飾電極(1)與XOD+碳納米材料修飾電極+XAN(2)的循環(huán)伏安圖。

圖3為篩選車前子中四個化合物抑制劑活性的結果圖，其中圖3A為毛蕊花糖苷的循環(huán)伏安圖；圖3B為異毛蕊花糖苷的循環(huán)伏安圖、圖3C為去咖啡?；锘ㄌ擒盏难h(huán)伏安圖；圖3D為bis(2-ethythexyl)-benzene-1,2-dicarboxylate(D)的循環(huán)伏安圖。

具體實施例

實施例1：

一種新的中草藥黃嘌呤氧化酶抑制劑篩選方法，包括如下步驟：

(1)將碳納米材料用濃硫酸與濃硝酸組成的混合酸超聲處理2～10h，混合酸中濃硫酸與濃硝酸的體積比為3：1，然后將碳納米材料用水洗滌至pH呈中性后過濾，干燥；精密稱取已處理好的碳納米材料10mg，用蒸餾水配成濃度為1.0mg/mL的碳納米材料溶液，超聲3h分散，并取4μL碳納米材料溶液飾到電極表面，之后干燥；

(2)將黃嘌呤氧化酶用蒸餾水分散至濃度為0.17U/μL，取2μL黃嘌呤氧化酶溶液修飾到步驟(1)中的經碳納米材料修飾后的電極表面；或將碳納米材料和濃度為0.17U/μL的黃嘌呤氧化酶溶液以等體積比混合配成溶液，取6μL該溶液一起修飾到電極表面，之后干燥；

(3)修飾電極干燥后置于5mL通氮除氧的的磷酸緩沖溶液(PBS,1/15mol/L，pH＝5.3)中，加入質量濃度為14.0μg/μL的黃嘌呤溶液10μL，靜置吸附5分鐘，采用電化學方法如循環(huán)伏安法或計時電流法測定修飾電極對黃嘌呤的響應；

(4)之后，再將修飾電極沖洗干凈后置于另一體積為5mL的通氮除氧的磷酸緩沖溶液(PBS,1/15mol/L，pH＝5.3)中，加入6μL質量濃度為3mg/mL的中草藥化學成分溶液，即中草藥化學成分的最終濃度為3.6μg/mL，靜置吸附5分鐘，再加入黃嘌呤10μL，靜置吸附5分鐘，采用電化學方法如循環(huán)伏安法或計時電流法測定修飾電極對黃嘌呤的響應；

(5)同時，分別測定(3)、(4)中不加黃嘌呤與中草藥化學成分溶液時各實驗的電化學背景信號；

(6)加入不同量(12、18、24μL)的質量濃度為3mg/mL的中草藥化學成分溶液，重復(4)、(5)操作；

(7)根據(jù)公式篩選中草藥XOD抑制劑：計算化學成分對XOD的抑制活性：其中ΔI₀是不加樣品的峰電流與其背景的電流差，ΔI₁是加樣品的峰電流與其背景的電流差。

將本方法應用于篩選車前子中四個化合物抑制劑活性，結果見說明書附圖中圖3。圖3A、B、C、D分別為XOD/DWNTs/GCE電極在毛蕊花糖苷(濃度分別為0、3.6、7.2、10.8、14.4μg/ml)、異毛蕊花糖苷(濃度分別為0、3.6、7.2、10.8、14.4μg/ml)、去咖啡?；锘ㄌ擒?濃度分別為0、1.8、9.0、18.0μg/ml)及bis(2-ethythexyl)-benzene-1,2-dicarboxylate(濃度分別為0、1.8、9.0、18.0μg/ml)存在時對XAN(28.0μg/ml)的響應。由圖3A和B可知，毛蕊花糖苷及異毛蕊花糖苷在200～500mV電位出現(xiàn)兩對氧化還原峰，這兩對氧化還原峰隨著毛蕊花糖苷、異毛蕊花糖苷濃度的增加而增加，說明毛蕊花糖苷與異毛蕊花糖苷是電活性成分，但并不對阻抑信號產生干擾。而圖3A 610mV處的峰電流隨著其濃度增加而降低，說明毛蕊花糖苷可對XOD催化反應電子轉移通道產生阻抑，對XOD具有較好的抑制作用，其IC₅₀計算值為8.4μg/ml，篩選結果與文獻接近[解放軍學報，2006，22(1)：30-32]。而異毛蕊花糖苷在610mV電流卻基本保持不變，顯然它對XOD基本沒有抑制活性。為更好說明抑制劑篩選效果，圖3C、D中每個濃度的電位均依次往左平移50mV。由圖3C和D可知，除了XOD/DWNTs/GCE電極原有信號外，并沒有新的信號出現(xiàn)。這表明去咖啡酰基毛蕊花糖苷(C)及bis(2-ethythexyl)-benzene-1,2-dicarboxylate(D)在此電位范圍內并非電活性成分。圖3C中610峰電流在低、中、高三個劑量組均無變化，而圖3D中610mV處的峰電流隨bis(2-ethythexyl)-benzene-1,2-dicarboxylate濃度增高緩慢下降，表明去咖啡?；锘ㄌ擒?C)對電子轉移通道不產生阻抑，而bis(2-ethythexyl)-benzene-1,2-dicarboxylate則對XOD具有較弱的抑制作用，因而是一種較弱的XOD抑制劑。