本發(fā)明屬于食品分析技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種檢測(cè)果蔬中赤霉素殘留的快速前處理方法。

背景技術(shù)：

赤霉素（gibberellic acid）又名赤霉素GA₃、九二○、奇寶，是一種應(yīng)用廣泛的植物激素類(lèi)農(nóng)藥。美國(guó)、日本等國(guó)規(guī)定，植物源性食品中赤霉素最高殘留限量（MRL）為0.2 mg/kg。我國(guó)還未制定該物質(zhì)的殘留限量標(biāo)準(zhǔn)。

目前，赤霉素的標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)方法主要是液相色譜法-質(zhì)譜/質(zhì)譜法（如SN/T 4257-2015 出口食品中抗倒酯、脫葉磷、坐果安、赤霉素農(nóng)藥殘留量的測(cè)定；SN/T 0350-2012 出口水果中赤霉素殘留量的測(cè)定；DB22/T 1677-2012 豆芽中赤霉素殘留量的測(cè)定）。這類(lèi)方法由于使用了先進(jìn)的儀器，檢測(cè)結(jié)果具有極高的精密度和準(zhǔn)確度，但都存在對(duì)樣本中目標(biāo)物的分離、提取、濃縮等前處理步驟繁瑣、耗時(shí)的缺點(diǎn)，不僅影響測(cè)定結(jié)果的精密度和準(zhǔn)確度，而且不利于大批量樣本的檢測(cè)。

目前，赤霉素的前處理方法主要是液液萃取法和固相萃取（Solid-Phase Extraction, SPE）法。液液萃取法由于操作繁瑣、耗時(shí)費(fèi)力、消耗大量溶劑污染環(huán)境、回收率較低等缺陷，不能滿(mǎn)足現(xiàn)代檢測(cè)工作的需要，但在實(shí)際工作中仍然被應(yīng)用。例如，“SN/T 0350-2012 出口水果中赤霉素殘留量的測(cè)定”中樣本的前處理就是以乙腈為溶劑從水果中提取赤霉素，然后用乙酸乙酯對(duì)乙腈提取液進(jìn)行液液分配凈化處理，最后用液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜法進(jìn)行檢測(cè)和確證，方法的低限為10μg/kg，回收率為70.0%-106.0%。固相萃取是近年來(lái)發(fā)展較快的一種樣品前處理技術(shù)，該技術(shù)可以有效提高測(cè)定的回收率而被廣泛應(yīng)用。用C18柱進(jìn)行赤霉素的前處理凈化在目前應(yīng)用廣泛，有研究者用液液萃取結(jié)合固相萃取分離純化蔬菜樣品中的赤霉素，得到的檢出限為0.5 mg/kg；另有研究者用C18小柱萃取番茄樣品中的赤霉素，可有效除去基質(zhì)干擾物，加標(biāo)回收率達(dá)到88.45%-95.90%。但總體而言，目前國(guó)內(nèi)外赤霉素分析檢測(cè)仍然存在前處理步驟繁瑣、耗時(shí)等缺點(diǎn)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

有鑒于此，本發(fā)明的目的在于提供一種檢測(cè)果蔬中赤霉素的前處理方法，可以加快赤霉素測(cè)定的前處理速度，進(jìn)而全面提高該農(nóng)藥分析檢測(cè)的速度，有助于推動(dòng)我國(guó)農(nóng)藥檢測(cè)方法朝快而準(zhǔn)的方向發(fā)展。

為達(dá)到上述目的，本發(fā)明提供如下技術(shù)方案：

一種檢測(cè)果蔬中赤霉素的快速前處理方法，包括以下步驟：

（1）將果蔬樣本的可食用部分打碎成勻漿；

（2）取步驟（1）所得勻漿，加入體積分?jǐn)?shù)為85%的甲醇水溶液，超聲波處理，抽濾，濾液在水浴加熱條件下用氮?dú)獯抵两?，再用體積分?jǐn)?shù)為5%的甲醇水溶液稀釋并定容；

（3）取步驟（2）所得溶液，加至已活化的C₁₈固相萃取柱中，用體積比為40: 60的甲醇-水混合溶劑洗脫，洗脫液在水浴加熱條件下用氮?dú)獯抵两桑儆眉状枷♂尣⒍ㄈ?，過(guò)濾，濾液作為供試品溶液。

優(yōu)選的，步驟（2）是取步驟（1）所得勻漿，按料液比為1g: 4.5mL加入體積分?jǐn)?shù)為85%的甲醇水溶液，在功率為128 w的條件下超聲波處理45分鐘，抽濾，濾液在45℃水浴加熱條件下用氮?dú)獯抵两桑儆皿w積分?jǐn)?shù)為5%的甲醇水溶液稀釋并定容。

優(yōu)選的，步驟（3）是取步驟（2）所得溶液，加至已活化的C₁₈固相萃取柱中，用體積比為40: 60的甲醇-水混合溶劑洗脫，洗脫液在45℃水浴加熱條件下用氮?dú)獯抵两?，再用甲醇稀釋并定容，過(guò)孔徑為0.45μm的微孔濾膜，濾液作為供試品溶液。

優(yōu)選的，C₁₈固相萃取柱經(jīng)再生處理后可以重復(fù)使用，所述再生處理方法為：取用過(guò)的C₁₈固相萃取柱，先用體積比為80:20的乙腈-四氫呋喃混合溶劑作洗脫劑反復(fù)洗滌，再用甲醇與純水交替淋洗。

本發(fā)明的有益效果在于：本發(fā)明提供了一種檢測(cè)果蔬中赤霉素的快速前處理方法，可以加快赤霉素測(cè)定的前處理速度，進(jìn)而全面提高該農(nóng)藥分析檢測(cè)的速度。采用本發(fā)明方法，果蔬樣本經(jīng)過(guò)超聲波處理后過(guò)C₁₈固相萃取柱，所得供試品溶液可以直接用于高效液相色譜或液相色譜-質(zhì)譜測(cè)定赤霉素含量，樣本前處理時(shí)間不超過(guò)60分鐘，用時(shí)短；而且，C₁₈固相萃取柱經(jīng)再生處理后可以重復(fù)使用2次，回收率保證在80%以上，大大降低了樣本前處理的成本。

具體實(shí)施方式

為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和優(yōu)點(diǎn)更加清楚，下面對(duì)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例進(jìn)行詳細(xì)的描述。

實(shí)施例1：蔬菜中赤霉素的測(cè)定（高效液相色譜法）

色譜條件：色譜柱為C₁₈柱（5 μm，4.6 mm×250 mm），流動(dòng)相為甲醇-體積分?jǐn)?shù)為0.15%的甲酸水溶液（體積比為55: 45），流速為0.6 mL/min，柱溫為40℃，進(jìn)樣量為5.0 μL，檢測(cè)波長(zhǎng)為206 nm；

供試品溶液的制備：（1）將蔬菜去蒂、籽、皮，水洗整理，用潔凈的毛巾或?yàn)V紙吸干表面水分，切小，用組織搗碎機(jī)或食品料理機(jī)打碎成勻漿；（2）稱(chēng)取步驟（1）所得勻漿10 g置100 mL藍(lán)蓋玻璃瓶中，按料液比（g: mL）=1:4.5加入體積分?jǐn)?shù)為85%的甲醇水溶液，旋緊玻璃瓶蓋后將玻璃瓶放入超聲波清洗機(jī)中，在超聲功率為128 w的條件下處理45 min，抽濾，取濾液1.0 mL置試管中，將試管放入氮吹儀，調(diào)節(jié)氮吹儀溫度為45℃，用氮?dú)獯翟嚬苤疗渲腥芤航?，再加入體積分?jǐn)?shù)為5%的甲醇水溶液定容至1.0 mL；（3）取步驟（2）所得溶液1.0 mL，加至已活化的C₁₈固相萃取柱中（活化方法為：取潔凈的C₁₈固相萃取柱，先沿柱壁慢慢加入1.0 mL甲醇，必須保持柱表面平整，不能使柱中有氣泡或者縫隙，棄去流出液，再向柱中加入1.0 mL純水，棄去流出液，即得），用甲醇-水（體積比為40: 60）3.0 mL洗脫，收集洗脫液置試管中，將試管放入氮吹儀，調(diào)節(jié)氮吹儀溫度為45℃，用氮?dú)獯翟嚬苤疗渲腥芤航?，再加入甲醇定容?.0 mL，過(guò)孔徑為0.45μm的微孔濾膜，濾液作為供試品溶液；

對(duì)照品溶液的制備：取赤霉素標(biāo)準(zhǔn)品，精密稱(chēng)定，用甲醇溶解制得對(duì)照品溶液；

測(cè)定：精密量取供試品溶液，注入液相色譜儀，記錄色譜圖，另精密量取對(duì)照品溶液注入液相色譜儀，同法測(cè)定；按外標(biāo)法以峰面積計(jì)算供試品中赤霉素的濃度。

結(jié)果：赤霉素平均保留時(shí)間為7.9703 min；標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性回歸方程為y =13068x-2640.2，相關(guān)系數(shù)r =0.9998，式中x為赤霉素的濃度（μg/mL），y為峰面積；該標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性范圍為0~100 μg/mL，檢出限為0.5 μg/mL（S/N=3）。

取生菜、青椒、黃瓜、番茄、黃豆芽5種蔬菜，按前述方法分別制備供試品溶液；每種蔬菜供試品溶液取3份，分別添加0.1 mg、0.5 mg、1.0 mg赤霉素標(biāo)準(zhǔn)品，照前述色譜條件測(cè)定赤霉素的濃度，分別計(jì)算低、中、高3個(gè)水平的加標(biāo)回收率及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD），結(jié)果如表1所示。

表1 市售蔬菜中赤霉素殘留量

實(shí)施例2：水果中赤霉素的測(cè)定（高效液相色譜法）

色譜條件：色譜柱為C₁₈柱（5 μm，4.6 mm×250 mm），流動(dòng)相為甲醇-體積分?jǐn)?shù)為0.15%的甲酸水溶液（體積比為55: 45），流速為0.6 mL/min，柱溫為40℃，進(jìn)樣量為5.0 μL，檢測(cè)波長(zhǎng)為206 nm；

供試品溶液的制備：（1）將水果用水洗凈，用潔凈的毛巾或?yàn)V紙吸干表面水分，去蒂、皮、核，切小，用組織搗碎機(jī)或食品料理機(jī)打碎成勻漿；（2）稱(chēng)取步驟（1）所得勻漿10 g置100 mL藍(lán)蓋玻璃瓶中，按料液比（g: mL）=1:4.5加入體積分?jǐn)?shù)為85%的甲醇水溶液，旋緊玻璃瓶蓋后將玻璃瓶放入超聲波清洗機(jī)中，在超聲功率為128 w的條件下處理45 min，抽濾，取濾液1.0 mL置試管中，將試管放入氮吹儀，調(diào)節(jié)氮吹儀溫度為45℃，用氮?dú)獯翟嚬苤疗渲腥芤航桑偌尤塍w積分?jǐn)?shù)為5%的甲醇水溶液定容至1.0 mL；（3）取步驟（2）所得溶液1.0 mL，加至已活化的C₁₈固相萃取柱中（活化方法為：取潔凈的C₁₈固相萃取柱，先沿柱壁慢慢加入1.0 mL甲醇，必須保持柱表面平整，不能使柱中有氣泡或者縫隙，棄去流出液，再向柱中加入1.0 mL純水，棄去流出液，即得），用甲醇-水(體積比為40: 60) 3.0 mL洗脫，收集洗脫液置試管中，將試管放入氮吹儀，調(diào)節(jié)氮吹儀溫度為45℃，用氮?dú)獯翟嚬苤疗渲腥芤航?，再加入甲醇定容?.0 mL，過(guò)孔徑為0.45μm的微孔濾膜，濾液作為供試品溶液；

對(duì)照品溶液的制備：取赤霉素標(biāo)準(zhǔn)品，精密稱(chēng)定，用甲醇溶解制得對(duì)照品溶液；

測(cè)定：精密量取供試品溶液，注入液相色譜儀，記錄色譜圖，另精密量取對(duì)照品溶液注入液相色譜儀，同法測(cè)定；按外標(biāo)法以峰面積計(jì)算供試品中赤霉素的濃度。

結(jié)果：赤霉素平均保留時(shí)間為7.9703 min；標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性回歸方程為y =13068x-2640.2，相關(guān)系數(shù)r =0.9998，式中x為赤霉素的濃度（μg/mL），y為峰面積；該標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性范圍為0~100 μg/mL，檢出限為0.5 μg/mL（S/N=3）。

取梨、蘋(píng)果、葡萄、李子、水果番茄5種水果，按前述方法分別制備供試品溶液；每種水果供試品溶液取3份，分別添加0.1 mg、0.5 mg、1.0 mg赤霉素標(biāo)準(zhǔn)品，照前述色譜條件測(cè)定赤霉素的濃度，分別計(jì)算低、中、高3個(gè)水平的加標(biāo)回收率及RSD，結(jié)果如表2所示。

表2 市售水果中赤霉素殘留量

實(shí)施例3：C₁₈固相萃取柱的再生

取用過(guò)的C₁₈固相萃取柱，用乙腈-四氫呋喃（體積比=80:20）作洗脫劑，每次取3.0 mL洗滌，連續(xù)洗滌3次，再用3.0 mL甲醇與3.0 mL純水交替淋洗2次，密封保存?zhèn)溆?。?jīng)過(guò)上述再生處理的C₁₈固相萃取柱可以重復(fù)使用2次，赤霉素測(cè)定的回收率保證在80%以上。臨用前，需將該固相萃取柱分別用1.0 mL甲醇和1.0 mL純水進(jìn)行活化。

最后說(shuō)明的是，以上實(shí)施例僅用以說(shuō)明本發(fā)明的技術(shù)方案而非限制，盡管通過(guò)參照本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例已經(jīng)對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了描述，但本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，可以在形式上和細(xì)節(jié)上對(duì)其作出各種各樣的改變，而不偏離所附權(quán)利要求書(shū)所限定的本發(fā)明的精神和范圍。