本發(fā)明屬于分析化學(xué)領(lǐng)域，具體涉及一種高效液相色譜法測(cè)定高粱紅色素中槲皮素-7-葡萄糖苷(3,5,3',4'-四羥基黃酮-7-葡萄糖苷)含量的方法。

背景技術(shù)：

高粱紅色素(Sorghum red)又稱高粱紅、高粱色素等，是從高粱殼中提取得到的一種天然色素，呈深紅棕色粉末，溶于水及乙醇水溶液，不溶于石油醚、三氯甲烷；主要成分為芹菜素(Apigenin；5,7,4'-三羥基黃酮)和槲皮素-7-葡萄糖苷(Quercetin-7-glucoside；3,5,3',4'-四羥基黃酮-7-葡萄糖苷)。高粱紅色素具有色調(diào)自然、柔和、無毒、無特殊氣味，價(jià)廉和著色性能好，可在各類食品中按生產(chǎn)需要適量使用；并具有生津止渴、消炎解熱、擴(kuò)張血管、降低血糖和血壓的功能。

槲皮素-7-葡萄糖苷分子式為C₂₁H₂₀O₁₂，結(jié)構(gòu)式為：

。

現(xiàn)有技術(shù)中，評(píng)價(jià)高粱紅色素的品質(zhì)性能主要依靠GB 1886.32-2015食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品添加劑 高粱紅中色價(jià)來評(píng)定，而這種評(píng)價(jià)方法尚有不妥之處，不能充分的反映出其中各成分的含量；因此需要對(duì)高粱紅色素中主成分進(jìn)行定量檢測(cè)，確保各成分在高粱紅色素中保持一定的含量。

目前，未見測(cè)定高粱紅色素中主成分槲皮素-7-葡萄糖苷含量方法的報(bào)道。

近年來，隨著分析技術(shù)的進(jìn)步與液相色譜儀的普及，添加劑的質(zhì)量控制大都采用高效液相色譜法，該方法有精密度高、準(zhǔn)確度高、靈敏度高、專屬性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)。因此，本實(shí)驗(yàn)擬采用高效液相色譜法定量分析高粱紅色素中槲皮素-7-葡萄糖苷的含量，為進(jìn)一步提高該產(chǎn)品的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供參考依據(jù)，有力保證其內(nèi)在質(zhì)量的穩(wěn)定性。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題在于提供一種測(cè)定高粱紅色素中槲皮素-7-葡萄糖苷含量的高效液相色譜分析方法，以填補(bǔ)現(xiàn)有技術(shù)中對(duì)高粱紅色素中槲皮素-7-葡萄糖苷定量檢測(cè)的空白，為進(jìn)一步提高高粱紅色素產(chǎn)品的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供參考依據(jù)，有力保證其內(nèi)在質(zhì)量的穩(wěn)定性。

本發(fā)明所述的測(cè)定高粱紅色素中槲皮素-7-葡萄糖苷含量的高效液相色譜分析方法，包括如下步驟：

（1）標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備：精密稱重槲皮素-7-葡萄糖苷標(biāo)準(zhǔn)品適量，加乙醇-鹽酸溶液（pH 2.5~3.5）溶解，配制為標(biāo)準(zhǔn)品溶液；

（2）樣品溶液的制備：稱取高粱紅色素（高粱殼提取物）適量，加乙醇-鹽酸溶液（pH 2.5~3.5），超聲溶解，過濾，續(xù)濾液即為樣品溶液；

（3）色譜條件為：以十八烷基硅烷鍵合硅膠(250 mm× 4.6 mm，5 um)為填充劑，以甲醇為流動(dòng)相A相，以體積比0.5 % ~ 1.5 %乙酸水溶液為流動(dòng)相B相；其體積配比為流動(dòng)相A相：流動(dòng)相B相為50~70：30~50；柱溫為25 ℃ ~ 35 ℃；流速為0.8 ml/min ~ 1.2 ml/min；檢測(cè)波長為486±5 nm；

（4）色譜峰測(cè)定：將上述步驟（1）所制得的樣品溶液注入高效液相色譜儀，按照上述步驟（3）的色譜條件，測(cè)定供試液溶液，得到高粱紅色素中槲皮素-7-葡萄糖苷特征峰的保留時(shí)間；

（5）結(jié)果計(jì)算：制定標(biāo)準(zhǔn)曲線，測(cè)定峰面積，計(jì)算出樣品中槲皮素-7-葡萄糖苷的含量。

作為本發(fā)明的優(yōu)選，所述步驟（1）和步驟（2）溶液制備方法中，加入的乙醇-鹽酸溶液的pH為3.0。

作為本發(fā)明的優(yōu)選，所述步驟（1）標(biāo)準(zhǔn)品溶液制備方法中，所述槲皮素-7-葡萄糖苷濃度范圍為10.2 ~ 408.0 μg/ml。

作為本發(fā)明的優(yōu)選，所述步驟（3）的色譜條件中，流動(dòng)相B相為1.0 %乙酸水溶液；流動(dòng)相A相：流動(dòng)相B相為60:40（體積比）；柱溫為30 ℃；流速為1.0 ml/min；檢測(cè)波長為486nm。

本發(fā)明的益處。

1、本發(fā)明所建立的高粱紅色素中槲皮素-7-葡萄糖苷高效液相色譜檢測(cè)方法，具有精密度、重現(xiàn)性良好、穩(wěn)定性可靠的特點(diǎn)，能有效地對(duì)其進(jìn)行定性鑒定和定量測(cè)定，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，該檢測(cè)方法的加標(biāo)回收率在回收率為81.3 %~102.5 %之間，精密度為0.78 % （n=6），重復(fù)性為1.8 % （n=6）。

2、本發(fā)明提供了所述方法在監(jiān)控高粱紅色素或含高粱紅色素的產(chǎn)品質(zhì)量中的用途。

附圖說明

圖1為槲皮素-7-葡萄糖苷標(biāo)準(zhǔn)品全波長紫外-可見光譜掃描圖。

圖2為槲皮素-7-葡萄糖苷標(biāo)準(zhǔn)品的PDA 3D圖。

圖3為流動(dòng)相為甲醇：1 %乙酸水溶液=60:40(V/V)時(shí)槲皮素-7-葡萄糖苷標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖。

圖4為流動(dòng)相為甲醇：1 %乙酸水溶液=60:40(V/V)時(shí)高粱殼提取物樣品色譜圖。

圖5為流動(dòng)相為甲醇：1 %乙酸水溶液=30:70(V/V)時(shí)槲皮素-7-葡萄糖苷標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖。

圖6為流動(dòng)相為乙腈：1 %乙酸水溶液=40:60(V/V)時(shí)高粱殼提取物樣品色譜圖。

圖7為槲皮素-7-葡萄糖苷的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。

具體實(shí)施方式

下面通過實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說明，但實(shí)施例并不限制本發(fā)明的保護(hù)范圍。

主要實(shí)驗(yàn)儀器：Waters e2695 高效液相色譜儀：配有Waters 2998 二極管陣列檢測(cè)器(PDA)和Empower色譜工作站。

色譜條件：色譜柱：C₁₈ (250 mm× 4.6 mm，5 um)；流動(dòng)相：甲醇-1 %乙酸溶液(50~70∶30~50，V/V)；流速：1 ml/min；檢測(cè)波長：486 nm；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣體積：10 μL；光譜掃描范圍：200~800nm。

標(biāo)準(zhǔn)品與試劑：槲皮素-7-葡萄糖苷標(biāo)準(zhǔn)品(含量98 %)；甲醇(色譜純)；無水乙醇(分析純)、冰乙酸(分析純)；鹽酸(優(yōu)級(jí)純)。

樣品：高粱紅色素、高粱殼。

實(shí)驗(yàn)中流動(dòng)相和溶液用水均為超純水。

實(shí)施例1 檢測(cè)波長的選擇。

采用二極管陣列檢測(cè)器(PDA) 200~800 nm全波長掃描槲皮素-7-葡萄糖苷標(biāo)準(zhǔn)溶液，得全波長紫外-可見光譜掃描圖和PDA 3D圖(參見圖1~2)，由圖1可知，槲皮素-7-葡萄糖苷在486 nm波長處有最大吸收，由圖2可知在486 nm處槲皮素-7-葡萄糖苷色譜圖基線穩(wěn)定，干擾少，靈敏度好；所以，選擇486 nm作為檢測(cè)波長。

實(shí)施例2 流動(dòng)相的選擇。

將不同體積比的流動(dòng)相組成進(jìn)行對(duì)比篩選試驗(yàn)，分別觀察了甲醇-水(60∶40，V/V)、甲醇-0.1 %乙酸溶液(60∶40，V/V)、甲醇-1 %乙酸溶液(60∶40，V/V)、甲醇-1 %乙酸溶液(50∶50，V/V)、甲醇-1 %乙酸溶液(30∶70，V/V)以及乙腈-1 %乙酸溶液(40∶60，V/V)等對(duì)槲皮素-7-葡萄糖苷在C₁₈柱上保留行為的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：當(dāng)選擇流動(dòng)相為甲醇-1 %乙酸溶液(60∶40，V/V)作為流動(dòng)相時(shí)，槲皮素-7-葡萄糖苷的峰形好，樣品分離度好，保留時(shí)間適中(7.2 min)，效果參見圖3~4。

實(shí)施例3 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制。

準(zhǔn)確稱取 10.20 mg槲皮素-7-葡萄糖苷標(biāo)樣至10 ml容量瓶中，加乙醇-鹽酸溶液(pH3.0)溶解并稀釋至刻度，搖勻，配成濃度為1.02 mg/ml的槲皮素-7-葡萄糖苷標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，使用時(shí)用乙醇-鹽酸溶液(pH3.0)逐級(jí)稀釋到所需濃度。

實(shí)施例4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作。

高效液相色譜條件為：色譜柱：C₁₈ (250 mm× 4.6 mm，5 um)；流動(dòng)相：甲醇-1 %乙酸溶液(60∶40，V/V)；流速：1 ml/min；柱溫：30 ℃；檢測(cè)波長：486 nm；進(jìn)樣體積：10 μL；檢測(cè)波長：486nm。

取上述配制的槲皮素-7-葡萄糖苷標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)樣，以峰面積對(duì)濃度作圖，具體參見圖7。

由圖7可知，槲皮素-7-葡萄糖苷在濃度10.2~408.0 μg/ml的范圍內(nèi)時(shí)，槲皮素-7-葡萄糖苷質(zhì)量濃度與峰面積呈良好的線性關(guān)系，線性回歸方程為：Y＝1 063.4X-564.5，R＝0.999 8。

當(dāng)信噪比S/N＝3時(shí)，測(cè)得槲皮素-7-葡萄糖苷的最低檢測(cè)限為 4 μg/ml。

實(shí)施例5 回收率試驗(yàn)。

高效液相色譜條件為：色譜柱：C₁₈ (250 mm× 4.6 mm，5 um)；流動(dòng)相：甲醇-1 %乙酸溶液(60∶40，V/V)；流速：1 ml/min；柱溫：30 ℃；檢測(cè)波長：486 nm；進(jìn)樣體積：10 μL；檢測(cè)波長：486nm。

采用加標(biāo)回收試驗(yàn)，稱取高粱紅色素樣品25 mg于25 ml容量瓶中，加入槲皮素-7-葡萄糖苷標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液(1.02 mg/ml) 0.1 ml、1 ml、5 ml，加乙醇-鹽酸溶液(pH3.0)溶解并稀釋至刻度，搖勻，進(jìn)行HPLC檢測(cè)，比較添加量和檢測(cè)量計(jì)算添加回收率，結(jié)果如下：

。

在3個(gè)不同的水平，槲皮素-7-葡萄糖苷的平均回收率在81.3 %~102.5 %之間，其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD (n=3)在1.6 %~9.2 %之間。

實(shí)施例6 重復(fù)性試驗(yàn)。

高效液相色譜條件為：色譜柱：C₁₈ (250 mm× 4.6 mm，5 um)；流動(dòng)相：甲醇-1 %乙酸溶液(60∶40，V/V)；流速：1 ml/min；柱溫：30 ℃；檢測(cè)波長：486 nm；進(jìn)樣體積：10 μL；檢測(cè)波長：486nm。

取同一批高粱紅色素，分別稱取50 mg高粱紅色素至25 ml的容量瓶中，乙醇-鹽酸溶液(pH3.0)定容，超聲溶解，0.22 μm 有機(jī)膜過濾，配置6份，按上述色譜條件測(cè)定，記錄峰面積，計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD），RSD（n=6）為1.8 %，結(jié)果本方法的重復(fù)性良好。

實(shí)施例7 精密度試驗(yàn)。

高效液相色譜條件為：色譜柱：C₁₈ (250 mm× 4.6 mm，5 um)；流動(dòng)相：甲醇-1 %乙酸溶液(60∶40，V/V)；流速：1 ml/min；柱溫：30 ℃；檢測(cè)波長：486 nm；進(jìn)樣體積：10 μL；檢測(cè)波長：486nm。

取51.0 μg/ml槲皮素-7-葡萄糖苷標(biāo)準(zhǔn)溶液，按上述色譜條件，同一份溶液重復(fù)測(cè)定6次，記錄峰面積，計(jì)算其RSD（n=6）為0.78 %，表明本方法的精密度良好。

實(shí)施例8 樣品中槲皮素-7-葡萄糖苷含量的測(cè)定。

高效液相色譜條件為：色譜柱：C₁₈ (250 mm× 4.6 mm，5 um)；流動(dòng)相：甲醇-1 %乙酸溶液(60∶40，V/V)；流速：1 ml/min；柱溫：30 ℃；檢測(cè)波長：486 nm；進(jìn)樣體積：10 μL；檢測(cè)波長：486nm。

取含槲皮素-7-葡萄糖苷高粱紅色素樣品50.42 mg高粱紅色素至25 ml的容量瓶中，用乙醇-鹽酸溶液(pH3.0)溶解并稀釋至刻度，搖勻，0.22 μm 有機(jī)膜過濾，進(jìn)行高效液相色譜分析，參見圖4。

經(jīng)測(cè)定，高粱紅色素中槲皮素-7-葡萄糖苷的含量為 0.0169g/g。

實(shí)施例9 高粱殼中槲皮素-7-葡萄糖苷含量的測(cè)定。

高效液相色譜條件為：色譜柱：C₁₈ (250 mm× 4.6 mm，5 um)；流動(dòng)相：甲醇-1 %乙酸溶液(60∶40，V/V)；流速：1 ml/min；柱溫：30 ℃；檢測(cè)波長：486 nm；進(jìn)樣體積：10 μL；檢測(cè)波長：486nm。

稱取3.1345 g粉碎的高粱殼，用濾紙包好后，置于250 ml索氏提取器中，加入170ml乙醇，在80℃的水浴上加熱2 h，提取液濃縮至體積約5 ml后，用乙醇-鹽酸溶液(pH3.0)定容25 ml，搖勻，0.22 μm 有機(jī)膜過濾，進(jìn)行高效液相色譜分析。

經(jīng)測(cè)定，高粱殼中槲皮素-7-葡萄糖苷的含量為 3.2×10^-4 g/g。