本發(fā)明涉及一種冰結(jié)構(gòu)蛋白的冰晶觀察方法。

背景技術(shù)：

冰結(jié)構(gòu)蛋白(ice structuring proteins,ISPs)，又稱為不凍蛋白、抗凍蛋白(antifreeze proteins,AFPs)，是一類由某些魚類、昆蟲、植物、真菌和細菌為抵抗外界環(huán)境應(yīng)激反應(yīng)所產(chǎn)生的多肽，具有阻止冰晶形成、修飾冰晶形態(tài)及抑制重結(jié)晶的能力，它具有一定的熱滯活性，即能夠以非依數(shù)性形式降低溶液的冰點，但對熔點的影響較小，從而使溶液的冰點與熔點之間出現(xiàn)差值。冰結(jié)構(gòu)蛋白特有的性質(zhì)保證生物在低溫條件下得以生存。2006年，我國衛(wèi)生部公布冰結(jié)構(gòu)蛋白可作為新型食品添加劑應(yīng)用于冷藏食品中；冰結(jié)構(gòu)蛋白具有吸附冰晶表面改變冰晶形態(tài)的特點，可使冰晶產(chǎn)生各種不同形狀，且大小不一，主要形態(tài)為四邊形、五邊形、六角形、菱形、橢圓形、梭形、棒狀和針狀等。

現(xiàn)有技術(shù)對冰結(jié)構(gòu)蛋白溶液冰晶形態(tài)的觀察一般采用生物低溫顯微鏡技術(shù)或改進的低溫顯微鏡技術(shù)。低溫顯微鏡是利用液態(tài)乙烷來快速冷凍蛋白溶液，儀器及其維護成本高昂，限制了低溫顯微鏡的推廣。改進的低溫顯微技術(shù)，是將其冷源系統(tǒng)采用液氮冷卻；或是在顯微鏡上加裝獨立的溫度控制冷熱臺裝置；或改進普通光學(xué)顯微鏡為控溫載玻片。利用以上技術(shù)觀察冰結(jié)構(gòu)蛋白溶液的冰晶時，儀器設(shè)備繁瑣受限，成本高。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明為了解決現(xiàn)有技術(shù)中冰結(jié)構(gòu)蛋白溶液冰晶形態(tài)的觀察只能通過生物低溫顯微鏡進行，設(shè)備繁瑣受限，成本高的問題，提出了一種冰結(jié)構(gòu)蛋白的冰晶觀察方法。

本發(fā)明冰結(jié)構(gòu)蛋白的冰晶觀察方法按以下步驟進行：

一、樣品的準備

取冰結(jié)構(gòu)蛋白粉，溶解于水或磷酸鹽緩沖溶液中，配成濃度為10～30mg/mL的冰結(jié)構(gòu)蛋白溶液，離心處理，用移液槍取30μL上清液置于血球計數(shù)板上，于-18℃冰箱冷凍20～30min；所述磷酸鹽緩沖溶液的pH為6.0～8.5，磷酸根濃度為10～150mmol/L。

二、冰晶的觀察

從冰箱中取出冷凍的血球計數(shù)板，在5～10s內(nèi)轉(zhuǎn)移至于普通光學(xué)顯微鏡下，首先在10×鏡下，調(diào)節(jié)光源，尋找目標(biāo)物，待目標(biāo)物清晰，轉(zhuǎn)40×鏡觀察，拍照；其中，由于冰結(jié)構(gòu)蛋白大多是白色略帶顏色，其溶液是無色或淺色形成，在觀察冰晶形態(tài)時，要適當(dāng)調(diào)低光源亮度。

本發(fā)明具備以下有益效果：

1、冰結(jié)構(gòu)蛋白具有吸附冰晶表面改變冰晶形態(tài)的特點，可使冰晶產(chǎn)生各種不同形狀，且大小不一，主要形態(tài)為四邊形、五邊形、六角形、菱形、橢圓形、梭形、棒狀和針狀等；本發(fā)明利用該特點并結(jié)合普通光學(xué)顯微鏡，很好地觀察到了冰結(jié)構(gòu)蛋白的冰晶形態(tài)，方法簡便，使用普通光學(xué)顯微鏡即可進行冰晶觀察，觀察效果好，解決了必須借助于專用儀器設(shè)備如低溫顯微鏡觀察冰晶的難題，克服了儀器設(shè)備昂貴，檢測方法復(fù)雜的缺點；

2、本發(fā)明方法中采用的血球計數(shù)板為優(yōu)質(zhì)厚玻璃制成，玻璃載片厚、凹槽深，利用血球計數(shù)板觀察液體的冰晶形態(tài)，便于室溫下保持冰凍液體的溫度，有利于觀察；

3、氯化鈉和蔗糖是常用的冷凍保護劑。氯化鈉和蔗糖溶液的冰晶形態(tài)特點是冰晶小、數(shù)量多，而水的冰晶非常大，這些都是常見的冰晶形態(tài)；本發(fā)明觀察時利用氯化鈉、蔗糖和水進行對照是可以驗證冰結(jié)構(gòu)蛋白冰晶的形態(tài)豐富多樣，對冰晶形態(tài)的修飾作用顯著，同時也是對本發(fā)明實用性和冰晶觀察結(jié)果的驗證；

4、冰結(jié)構(gòu)蛋白的抗凍活性特性包括修飾冰晶形態(tài)、數(shù)量及重結(jié)晶形態(tài)，利用本發(fā)明方法可以應(yīng)用普通光學(xué)顯微鏡對其抗凍活性進行鑒定，并且鑒定結(jié)果真實可靠，準確性與低溫顯微鏡相同；

5、利用本發(fā)明冰晶觀察方法可以了解液體溶液的固化過程，在此過程中冰晶的形成與生長，冰晶的再結(jié)晶凍結(jié)過程中冰晶的生長屬性和生長機理，掌握冰晶的形態(tài)與凍結(jié)過程。

附圖說明

圖1為實施例1苜蓿冰結(jié)構(gòu)蛋白溶液中呈五邊形或梭形的冰晶形態(tài)40x顯微照片；

圖2為實施例1苜蓿冰結(jié)構(gòu)蛋白溶液中呈柱形的冰晶形態(tài)40x顯微照片；

圖3為實施例1苜蓿冰結(jié)構(gòu)蛋白溶液中呈五邊形的冰晶形態(tài)40x顯微照片；

圖4為實施例1苜蓿冰結(jié)構(gòu)蛋白溶液中呈四邊形的冰晶形態(tài)40x顯微照片；

圖5為實施例1苜蓿冰結(jié)構(gòu)蛋白溶液中呈四邊形的冰晶形態(tài)的另一張40x顯微照片；

圖6為實施例1苜蓿冰結(jié)構(gòu)蛋白溶液中呈三邊形的冰晶形態(tài)40x顯微照片；

圖7為實施例1苜蓿冰結(jié)構(gòu)蛋白溶液中呈六棱錐形的冰晶形態(tài)40x顯微照片；

圖8為實施例1苜蓿冰結(jié)構(gòu)蛋白溶液中呈四邊形或五邊形的冰晶形態(tài)40x顯微照片；

圖9為實施例1苜蓿冰結(jié)構(gòu)蛋白溶液中呈六邊形的冰晶形態(tài)40x顯微照片；

圖10為實施例1苜蓿冰結(jié)構(gòu)蛋白溶液中呈四邊形或六邊形的冰晶形態(tài)40x顯微照片；

圖11為實施例1苜蓿冰結(jié)構(gòu)蛋白溶液中呈六棱錐形的冰晶形態(tài)40x顯微照片；

圖12為實施例1水中呈圓形的冰晶形態(tài)40x顯微照片；

圖13為實施例1水中呈梭形的冰晶形態(tài)40x顯微照片；

圖14為實施例1蔗糖溶液中呈圓形的冰晶形態(tài)40x顯微照片；

圖15為實施例1蔗糖溶液中呈圓形的冰晶形態(tài)的另一張40x顯微照片；

圖16為實施例1NaCl溶液中呈圓形的冰晶形態(tài)40x顯微照片；

圖17為實施例1NaCl溶液中呈梭形的冰晶形態(tài)40x顯微照片；

圖18為實施例1NaCl溶液中呈梭形的冰晶形態(tài)的另一張40x顯微照片；

圖19為實施例1寒地冬小麥冰結(jié)構(gòu)蛋白溶液中呈水滴形的冰晶形態(tài)40x顯微照片；

圖20為實施例1寒地冬小麥冰結(jié)構(gòu)蛋白溶液中呈梭形或水滴形的冰晶形態(tài)40x顯微照片；

圖21為實施例1寒地冬小麥冰結(jié)構(gòu)蛋白溶液中呈梭形的冰晶形態(tài)40x顯微照片；

圖22為實施例1寒地冬小麥冰結(jié)構(gòu)蛋白溶液中呈圓形的冰晶形態(tài)40x顯微照片；

圖23為實施例1寒地冬小麥冰結(jié)構(gòu)蛋白溶液中呈棒狀的冰晶形態(tài)40x顯微照片。

具體實施方式：

本發(fā)明技術(shù)方案不局限于以下所列舉具體實施方式，還包括各具體實施方式間的任意合理組合。

具體實施方式一：本實施方式冰結(jié)構(gòu)蛋白的冰晶觀察方法按以下步驟進行：

一、樣品的準備

取冰結(jié)構(gòu)蛋白粉，溶解于水或磷酸鹽緩沖溶液中，配成濃度為10～30mg/mL的冰結(jié)構(gòu)蛋白溶液，離心處理，用移液槍取30μL上清液置于血球計數(shù)板上，于-18℃冰箱冷凍20～30min；

二、冰晶的觀察

從冰箱中取出冷凍的血球計數(shù)板，在5～10s內(nèi)轉(zhuǎn)移至于普通光學(xué)顯微鏡下，首先在10×鏡下，調(diào)節(jié)光源，尋找目標(biāo)物，待目標(biāo)物清晰，轉(zhuǎn)40×鏡觀察，拍照；其中，由于冰結(jié)構(gòu)蛋白大多是白色略帶顏色，其溶液是無色或淺色形成，在觀察冰晶形態(tài)時，要適當(dāng)調(diào)低光源亮度。

本實施方式具備以下有益效果：

1、冰結(jié)構(gòu)蛋白具有吸附冰晶表面改變冰晶形態(tài)的特點，可使冰晶產(chǎn)生各種不同形狀，且大小不一，主要形態(tài)為四邊形、五邊形、六角形、菱形、橢圓形、梭形、棒狀和針狀等；本實施方式利用該特點并結(jié)合普通光學(xué)顯微鏡，很好地觀察到了冰結(jié)構(gòu)蛋白的冰晶形態(tài)，方法簡便，使用普通光學(xué)顯微鏡即可進行冰晶觀察，觀察效果好，解決了必須借助于專用儀器設(shè)備如低溫顯微鏡觀察冰晶的難題，克服了儀器設(shè)備昂貴，檢測方法復(fù)雜的缺點；

2、本實施方式方法中采用的血球計數(shù)板為優(yōu)質(zhì)厚玻璃制成，玻璃載片厚、凹槽深，利用血球計數(shù)板觀察液體的冰晶形態(tài)，便于室溫下保持冰凍液體的溫度，有利于觀察；

3、氯化鈉和蔗糖是常用的冷凍保護劑。氯化鈉和蔗糖溶液的冰晶形態(tài)特點是冰晶小、數(shù)量多，而水的冰晶非常大，這些都是常見的冰晶形態(tài)；本實施方式觀察時利用氯化鈉、蔗糖和水進行對照是可以驗證冰結(jié)構(gòu)蛋白冰晶的形態(tài)豐富多樣，對冰晶形態(tài)的修飾作用顯著，同時也是對本實施方式實用性和冰晶觀察結(jié)果的驗證；

4、冰結(jié)構(gòu)蛋白的抗凍活性特性包括修飾冰晶形態(tài)、數(shù)量及重結(jié)晶形態(tài)，利用本實施方式方法可以應(yīng)用普通光學(xué)顯微鏡對其抗凍活性進行鑒定，并且鑒定結(jié)果真實可靠，準確性與低溫顯微鏡相同；

5、利用本實施方式冰晶觀察方法可以了解液體溶液的固化過程，在此過程中冰晶的形成與生長，冰晶的再結(jié)晶凍結(jié)過程中冰晶的生長屬性和生長機理，掌握冰晶的形態(tài)與凍結(jié)過程。

具體實施方式二：本實施方式與具體實施方式一不同的是：步驟一所述磷酸鹽緩沖溶液的pH為6.0～8.5，磷酸根濃度為10～150mmol/L。其他步驟和參數(shù)與具體實施方式一相同。

具體實施方式三：本實施方式與具體實施方式一或二不同的是：步驟一所述磷酸鹽緩沖溶液的pH為6.0～8.5，磷酸根濃度為40mmol/L。其他步驟和參數(shù)與具體實施方式一或二相同。

具體實施方式四：本實施方式與具體實施方式一至三之一不同的是：步驟一所述離心處理時，離心機的轉(zhuǎn)速為4000～6000r/min。其他步驟和參數(shù)與具體實施方式一至三之一相同。

具體實施方式五：本實施方式與具體實施方式一至四之一不同的是：步驟一所述離心處理時，離心時間為10～15min。其他步驟和參數(shù)與具體實施方式一至四之一相同。

具體實施方式六：本實施方式與具體實施方式一至五之一不同的是：步驟一所述取冰結(jié)構(gòu)蛋白粉，溶解于磷酸鹽緩沖溶液中，配成濃度為30mg/mL的冰結(jié)構(gòu)蛋白溶液，離心處理，用移液槍取30μL上清液置于血球計數(shù)板上，于-18℃冰箱冷凍20min。其他步驟和參數(shù)與具體實施方式一至五之一相同。

實施例1

本實施例苜蓿冰結(jié)構(gòu)蛋白的冰晶觀察方法按以下步驟進行：

一、樣品的準備

取苜蓿冰結(jié)構(gòu)蛋白粉，溶解于水或磷酸鹽緩沖溶液中，配成濃度為30mg/mL的冰結(jié)構(gòu)蛋白溶液，于4000r/min下離心10min，用移液槍取30μL上清液置于血球計數(shù)板上，于-18℃冰箱冷凍20min；所述磷酸鹽緩沖溶液的pH為8.0，磷酸根濃度為40mmol/L；

二、冰晶的觀察

從冰箱中取出冷凍的血球計數(shù)板，在10s內(nèi)轉(zhuǎn)移至于普通光學(xué)顯微鏡下，首先在10×鏡下，調(diào)節(jié)光源，尋找目標(biāo)物，待目標(biāo)物清晰，轉(zhuǎn)40×鏡觀察，拍照；其中，由于冰結(jié)構(gòu)蛋白大多是白色略帶顏色，其溶液是無色或淺色形成，在觀察冰晶形態(tài)時，要適當(dāng)調(diào)低光源亮度。

取水、30mg/mL的NaCl溶液、30mg/mL的蔗糖溶液和30mg/mL的寒地冬小麥冰結(jié)構(gòu)蛋白溶液作為對照，將水、30mg/mL的NaCl溶液、30mg/mL的蔗糖溶液和30mg/mL的寒地冬小麥冰結(jié)構(gòu)蛋白溶液分別置于-18℃冰箱冷凍20min；然后置于40×光學(xué)顯微鏡下觀察并拍照；

本實施例制備的苜蓿冰結(jié)構(gòu)蛋白溶液的冰晶形態(tài)40x顯微照片如圖1～11所示；其中，圖1為實施例1苜蓿冰結(jié)構(gòu)蛋白溶液中呈五邊形或梭形的冰晶形態(tài)40x顯微照片；圖2為實施例1苜蓿冰結(jié)構(gòu)蛋白溶液中呈柱形的冰晶形態(tài)40x顯微照片；圖3為實施例1苜蓿冰結(jié)構(gòu)蛋白溶液中呈五邊形的冰晶形態(tài)40x顯微照片；圖4為實施例1苜蓿冰結(jié)構(gòu)蛋白溶液中呈四邊形的冰晶形態(tài)40x顯微照片；圖5為實施例1苜蓿冰結(jié)構(gòu)蛋白溶液中呈四邊形的冰晶形態(tài)的另一張40x顯微照片；圖6為實施例1苜蓿冰結(jié)構(gòu)蛋白溶液中呈三邊形的冰晶形態(tài)40x顯微照片；圖7為實施例1苜蓿冰結(jié)構(gòu)蛋白溶液中呈六棱錐形的冰晶形態(tài)40x顯微照片；圖8為實施例1苜蓿冰結(jié)構(gòu)蛋白溶液中呈四邊形或五邊形的冰晶形態(tài)40x顯微照片；圖9為實施例1苜蓿冰結(jié)構(gòu)蛋白溶液中呈六邊形的冰晶形態(tài)40x顯微照片；圖10為實施例1苜蓿冰結(jié)構(gòu)蛋白溶液中呈四邊形或六邊形的冰晶形態(tài)40x顯微照片；圖11為實施例1苜蓿冰結(jié)構(gòu)蛋白溶液中呈六棱錐形的冰晶形態(tài)40x顯微照片；由圖1～11可知，苜蓿蛋白溶液的冰晶體積對比水的冰晶體積要小但是比蔗糖溶液冰晶體積大，但冰晶形態(tài)豐富，部分是與NaCl冰晶相似的柱形冰晶；部分呈梭形、四邊形、五邊形的冰晶形態(tài)、六邊形冰晶和立體的六棱錐形的冰晶；

本實施例獲得的水的冰晶形態(tài)40x顯微照片如圖12～13所示；其中，圖12為實施例1水中呈圓形的冰晶形態(tài)40x顯微照片；圖13為實施例1水中呈梭形的冰晶形態(tài)40x顯微照片；由圖12～13可知，水的冰晶形態(tài)是較大的圓形，排列緊密；

本實施例獲得的蔗糖溶液的冰晶形態(tài)40x顯微照片如圖14～15所示；其中，圖14為實施例1蔗糖溶液中呈圓形的冰晶形態(tài)40x顯微照片；圖15為實施例1蔗糖溶液中呈圓形的冰晶形態(tài)的另一張40x顯微照片；由圖14～15可知，蔗糖溶液冰晶的體積對比水的冰晶體積要很多小，且形態(tài)單一，和水的冰晶形態(tài)相似，多為圓形；

本實施例獲得的NaCl溶液的冰晶形態(tài)40x顯微照片如圖16～18所示；其中，圖16為實施例1NaCl溶液中呈圓形的冰晶形態(tài)40x顯微照片；圖17為實施例1NaCl溶液中呈梭形的冰晶形態(tài)40x顯微照片；圖18為實施例1NaCl溶液中呈梭形的冰晶形態(tài)的另一張40x顯微照片；由圖16～18可知，NaCl溶液的冰晶體積較小，數(shù)量較多，但形態(tài)較為單一；

本實施例獲得的寒地冬小麥冰結(jié)構(gòu)蛋白溶的冰晶形態(tài)40x顯微照片如圖19～23所示；其中，圖19為實施例1寒地冬小麥冰結(jié)構(gòu)蛋白溶液中呈水滴形的冰晶形態(tài)40x顯微照片；圖20為實施例1寒地冬小麥冰結(jié)構(gòu)蛋白溶液中呈梭形或水滴形的冰晶形態(tài)40x顯微照片；圖21為實施例1寒地冬小麥冰結(jié)構(gòu)蛋白溶液中呈梭形的冰晶形態(tài)40x顯微照片；圖22為實施例1寒地冬小麥冰結(jié)構(gòu)蛋白溶液中呈圓形的冰晶形態(tài)40x顯微照片；圖23為實施例1寒地冬小麥冰結(jié)構(gòu)蛋白溶液中呈棒狀的冰晶形態(tài)40x顯微照片。由圖19～23可知，寒地冬小麥冰結(jié)構(gòu)蛋白溶液的冰晶形態(tài)大多呈水滴形和圓形，分布均勻，也出現(xiàn)多邊形，短棒形或針形。