技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明整體涉及醫(yī)療裝置，并且具體涉及基于電化學(xué)的分析測(cè)試條和在其中使用的酶試劑。

相關(guān)領(lǐng)域的描述

醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中特別關(guān)注對(duì)流體樣本中的分析物或流體樣本的特性的測(cè)定(例如，檢測(cè)和/或濃度測(cè)量)。例如，可期望測(cè)定體液諸如尿液、血液、血漿或間質(zhì)液的樣本中的葡萄糖、酮體、膽固醇、脂蛋白、三甘油酯、對(duì)乙酰氨基酚、血細(xì)胞比容和/或HbA1c的濃度?？墒褂没诶缫曈X、光度或電化學(xué)技術(shù)的分析測(cè)試條來實(shí)現(xiàn)此類測(cè)定。常規(guī)的基于電化學(xué)的分析測(cè)試條在例如美國(guó)專利5,708,247和6,284,125中有所描述，所述專利中的每個(gè)專利據(jù)此全文以引用方式并入本文。

附圖說明

并入本文中并且構(gòu)成本說明書的一部分的附圖示出了本發(fā)明的目前優(yōu)選實(shí)施例，并且與上面給出的一般描述和下面給出的詳細(xì)描述一起用于說明本發(fā)明的特征，其中：

圖1為根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例的基于電化學(xué)的分析測(cè)試條的簡(jiǎn)化分解透視圖；

圖2是沿其縱向軸線截取的圖1的基于電化學(xué)的分析測(cè)試條的一部分的簡(jiǎn)化橫截面?zhèn)纫晥D(未按比例繪制)；

圖3為根據(jù)本發(fā)明實(shí)施方案的酶試劑的線性性能圖；

圖4為根據(jù)本發(fā)明實(shí)施方案的酶試劑的尿酸敏感度的圖；并且

圖5為根據(jù)本發(fā)明實(shí)施方案的另一種酶試劑的線性性能圖。

例示性實(shí)施方案的具體實(shí)施方式

應(yīng)結(jié)合附圖來閱讀下面的具體實(shí)施方式，其中不同附圖中相同元件的編號(hào)相同。各附圖未必按比例繪制，僅出于說明的目的示出示例性實(shí)施方案，并不旨在限制本發(fā)明的范圍。具體實(shí)施方式以舉例的方式而不是限制性方式示出本發(fā)明的原理。此具體實(shí)施方式將清楚地使得本領(lǐng)域的技術(shù)人員能夠形成和使用本發(fā)明，并且描述了本發(fā)明的多個(gè)實(shí)施方案、改型、變型、替代方案和用途，包括目前據(jù)信是實(shí)施本發(fā)明的最佳模式。

如本文所用，針對(duì)任何數(shù)值或范圍的術(shù)語“約”或“大約”指示允許部件或多個(gè)部件的集合執(zhí)行如本文所述的指定用途的適當(dāng)公差。

本發(fā)明公開了一種根據(jù)本發(fā)明實(shí)施方案的用于測(cè)定體液樣本中的分析物(諸如葡萄糖)的基于電化學(xué)的分析測(cè)試條，該基于電化學(xué)的分析測(cè)試條包括電絕緣基底層、設(shè)置在電絕緣基底層上并且包括至少一個(gè)電極的導(dǎo)電層、設(shè)置在該至少一個(gè)電極上的酶試劑層、圖案化隔層和頂層。此外，酶試劑層包括至少一種基于萘醌的調(diào)節(jié)劑和FAD-GDH酶?；谳刘恼{(diào)節(jié)劑可為以下形式：

其中R為有機(jī)取代基。

例如，R可為–S-(CH₂)_n-X，其中n為1-6，通常為2-3，并且X為-SO₃H或-COOH。此類基于萘醌的調(diào)節(jié)劑可為例如1,2-萘二酮-4-(3-巰基-1-丙磺酸)和1,2-萘二酮-4-(3-巰基丙酸)。

酶試劑層還可包含表面活性劑、增稠劑，以及任選的干燥的緩沖至pH為7的磷酸鹽水溶液?；谳刘恼{(diào)節(jié)劑可在涂覆至基于電化學(xué)的分析測(cè)試條期間以大約0.1mM至大約200mM、大約0.175mM、大約175mM或大約40mM范圍內(nèi)的濃度存在。具體地，1,2-萘二酮-4-(3-巰基-1-丙磺酸)可在涂覆至基于電化學(xué)的分析測(cè)試條期間以大約0.175mM或大約175mM的濃度存在。另選地，1,2-萘二酮-4-(3-巰基丙酸)可在涂覆至基于電化學(xué)的測(cè)試條期間以大約40mM的濃度存在。

可使用絲網(wǎng)印刷技術(shù)或噴墨印刷技術(shù)施用酶試劑層。酶試劑層的厚度可在大約0.1微米至大約15微米、大約0.1微米至大約5微米或大約5微米至大約15微米的范圍內(nèi)。通常，使用絲網(wǎng)印刷技術(shù)涂覆酶試劑層，并且厚度在大約5微米至大約15微米的范圍內(nèi)，或者使用噴墨技術(shù)涂覆酶試劑層，并且具有在大約0.1微米至大約5.0微米范圍內(nèi)的厚度。

體液樣本可為全血樣本，并且分析物可為葡萄糖。

根據(jù)本發(fā)明實(shí)施方案的基于電化學(xué)的分析測(cè)試條是有利的，因?yàn)橹辽僖环N基于萘醌的調(diào)節(jié)劑(例如，1,2-萘二酮-4-(3-巰基-1-丙磺酸)和1,2-萘二酮-4-(3-巰基丙酸)中的至少一種)和FAD-GDH酶的組合形成生化有效(例如，調(diào)節(jié)劑為雙電子受體，產(chǎn)生不通過自由基途徑進(jìn)行的酶反應(yīng)，并且酶反應(yīng)(對(duì)一些基于萘醌的調(diào)節(jié)劑來說)的一級(jí)速率常數(shù)大于常規(guī)FAD-GDH調(diào)節(jié)劑鐵氰化鉀的一級(jí)速率常數(shù))并且不受來自尿酸、對(duì)乙酰氨基酚、谷胱甘肽和抗壞血酸的干擾影響的酶試劑層。

在根據(jù)本發(fā)明的基于電化學(xué)的分析測(cè)試條中使用的酶試劑包含至少一種基于萘醌的調(diào)節(jié)劑，諸如例如(i)1,2-萘二酮-4-(3-巰基-1-丙磺酸)和(ii)1,2-萘二酮-4-(3-巰基丙酸)中的至少一種；以及黃素腺嘌呤二核苷酸依賴性葡萄糖脫氫酶，本文縮寫為FAD-GDH酶。此類酶試劑的有利之處在于它們形成生化有效(即，調(diào)節(jié)劑為雙電子受體并且酶反應(yīng)不通過自由基途徑進(jìn)行)并且不受來自尿酸、對(duì)乙酰氨基酚、谷胱甘肽和抗壞血酸的干擾影響的酶試劑層。此外，該酶試劑可在使用常規(guī)技術(shù)諸如噴墨印刷和絲網(wǎng)印刷制造基于電化學(xué)的分析測(cè)試條期間施加。

酶試劑可包含緩沖至pH為7的磷酸鹽水溶液、表面活性劑和增稠劑。酶試劑可包含消泡劑。

基于萘醌的調(diào)節(jié)劑可以大約20mM至大約200mM、大約175mM或大約40mM的濃度存在。具體地，1,2-萘二酮-4-(3-巰基-1-丙磺酸)可以大約175mM的濃度存在。另選地，1,2-萘二酮-4-(3-巰基丙酸)可以大約40mM的濃度存在。

圖1為根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方案的基于電化學(xué)的分析測(cè)試條100的簡(jiǎn)化分解透視圖。圖2為沿圖1透視圖的縱向軸線截取的基于電化學(xué)的分析測(cè)試條100的一部分的簡(jiǎn)化橫截面?zhèn)纫晥D(未按比例繪制)。圖3為根據(jù)本發(fā)明實(shí)施方案的酶試劑的線性性能圖。圖4為根據(jù)本發(fā)明實(shí)施方案的酶試劑的尿酸敏感度的圖。圖5為根據(jù)本發(fā)明另一個(gè)實(shí)施方案的酶試劑的線性性能圖。

參考圖1至圖5，用于測(cè)定體液樣本(例如，全血樣本)中的分析物(諸如葡萄糖)的基于電化學(xué)的分析測(cè)試條100包括電絕緣基底層102、圖案化導(dǎo)電層104、圖案化絕緣層106、酶試劑層108、圖案化隔層110，以及由親水性亞層114和頂帶116組成的頂層112。

在圖1和圖2的實(shí)施方案中，至少圖案化隔層和頂層限定基于電化學(xué)的分析測(cè)試條100內(nèi)的樣本接收室118(具體參見圖2)。

電絕緣基底層102可為本領(lǐng)域的技術(shù)人員已知的任何合適的電絕緣基底層，包括例如尼龍基底層、聚碳酸酯基底層、聚酰亞胺基底層、聚氯乙烯基底層、聚乙烯基底層、聚丙烯基底層、糖化聚酯(PETG)基底層或聚酯基底層。電絕緣基底層可具有任何合適的尺寸，包括例如約5mm的寬度尺寸、約27mm的長(zhǎng)度尺寸和約0.5mm的厚度尺寸。

電絕緣基底層102向基于電化學(xué)的分析測(cè)試條100提供結(jié)構(gòu)，以便于處理，并且還用作涂覆(例如，印刷或沉積)后續(xù)層(例如，圖案化導(dǎo)電層和通過根據(jù)本發(fā)明和本文所述酶試劑的噴墨印刷或絲網(wǎng)印刷形成的酶試劑)的基底。

圖案化導(dǎo)電層104設(shè)置在電絕緣基底層102上，并且包括第一電極104a、第二電極104b和第三電極104c。第一電極104a、第二電極104b和第三電極104c可例如分別被構(gòu)造為反電極/參考電極、第一工作電極和第二工作電極。因此，第二電極和第三電極在本文中也被稱為工作電極104b和工作電極104c，并且第一電極也被稱為反電極104a。雖然僅用于說明的目的，基于電化學(xué)的分析測(cè)試條100被描述為包括總共三個(gè)電極，但包括本發(fā)明的實(shí)施方案的基于電化學(xué)的分析測(cè)試條的實(shí)施方案可包括任何合適數(shù)量的電極。

基于電化學(xué)的分析測(cè)試條100的包括第一電極104a、第二電極104b和第三電極104c的圖案化導(dǎo)電層104可由包括例如基于導(dǎo)電碳的材料的任何合適的導(dǎo)電材料形成，該基于導(dǎo)電碳的材料包括碳墨。應(yīng)當(dāng)指出的是，根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方案的基于電化學(xué)的分析測(cè)試條中所采用的圖案化導(dǎo)電層可采取任何合適的形狀，并且可由任何合適的材料形成，該材料包括例如金屬材料和導(dǎo)電碳材料。

具體地參考圖1和圖2，設(shè)置第一電極104a、第二電極104b和第三電極104c以及酶試劑層108，使得基于電化學(xué)的分析測(cè)試條100被構(gòu)造用于對(duì)已填充的樣本接收室118的體液樣本(諸如全血樣本)中的分析物(諸如葡萄糖)進(jìn)行電化學(xué)測(cè)定。此類全血填充的方向在圖2中由標(biāo)記為“S”的箭頭示出。

酶試劑層108設(shè)置在圖案化導(dǎo)電層104的至少一部分上(參見圖1和圖2)。酶試劑層108包括至少一種基于萘醌的調(diào)節(jié)劑以及FAD-GDH酶。如本文所用的術(shù)語“基于萘醌的調(diào)節(jié)劑”是指以下形式的調(diào)節(jié)劑：

其中R為任何合適的有機(jī)取代基。

適用于本發(fā)明實(shí)施方案的基于萘醌的調(diào)節(jié)劑的尤其有利的示例為1,2-萘二酮-4-(3-巰基-1-丙磺酸)[在本文中也稱為化合物A]和1,2-萘二酮-4-(3-巰基丙酸)[在本文中也稱為化合物B]。然而，一旦獲悉本發(fā)明，本領(lǐng)域的技術(shù)人員便可采用常規(guī)試驗(yàn)選擇合適的有機(jī)取代基(即，合適的“R”基團(tuán))以形成具有有利的反應(yīng)動(dòng)力學(xué)、合適的水溶性以及不受干擾效應(yīng)影響的其它基于萘醌的調(diào)節(jié)劑。在此方面，合適的R基團(tuán)可為例如充分親水的，以賦予調(diào)節(jié)劑以合適的水溶性。

化合物A的分子式為C₁₃H₁₂S₂O₅，分子量為312.36，并具有以下結(jié)構(gòu)：

化合物A為橙色的無定形固體，可在室溫下溶于堿性和中性磷酸鹽緩沖液?；衔顰具有以下有利的電化學(xué)特性：

相對(duì)于Ag/AgCl(0.1M KCl)的E₀＝0.086V

k_cat＝900s^-1

其中E₀為相對(duì)于Ag/AgCl的形式氧化還原電勢(shì)(相比于鐵氰化物的0.25V)，并且k_cat為調(diào)節(jié)劑(即，化合物A)和酶輔助因子FAD之間均勻電子傳遞的速率常數(shù)。應(yīng)當(dāng)注意，鐵氰化物的E₀為0.25V，并且鐵氰化物的k_cat為230s^-1。化合物A的E₀有利地低于鐵氰化物的E₀(并因此不易受干擾物的影響)并且其k_cat有利地高于鐵氰化物的k_cat。此外，化合物A在40攝氏度下存放26天后表現(xiàn)出對(duì)葡萄糖的敏感度沒有下降。

化合物A以如下步驟合成。將1,2-萘醌-4-磺酸鈉鹽(10mmol)加入蒸餾水(100ml)中并攪拌，直到形成澄清的溶液。立即加入3-巰基-1-丙磺酸單鈉鹽(10mmol)，生成深棕色溶液。靜置溶液，12小時(shí)之后，將澄清的棕色溶液蒸發(fā)至干燥以得到深黃色固體。用氯仿洗滌深黃色固體并在真空下干燥以得到作為橙色固體的1,2-萘二酮-4-(3-巰基-1-丙磺酸)(1.48g，47％)。質(zhì)譜分析確認(rèn)了該成分。然而，一旦獲悉本公開，本領(lǐng)域的技術(shù)人員便可開發(fā)用于合成化合物A的其它方法。

化合物B的分子式為C₁₃H₁₀S₂O₄，分子量為262.28，并具有以下結(jié)構(gòu)：

化合物B為橙色無定形固體，可在室溫下溶于堿性和中性磷酸鹽緩沖液?；衔顰具有以下有利的電化學(xué)特性：

相對(duì)于Ag/AgCl(0.1M KCl)的E₀＝0.016V

k_cat＝100s^-1

其中E₀為相對(duì)于Ag/AgCl的形式氧化還原電勢(shì)(相比于鐵氰化物的0.25V)，并且k_cat為調(diào)節(jié)劑(即，化合物A)和酶輔助因子FAD之間均勻電子傳遞的速率常數(shù)。應(yīng)當(dāng)注意，鐵氰化物的E₀為0.25V，并且鐵氰化物的k_cat為230s^-1?；衔顱的E₀有利地低于鐵氰化物的E₀(并因此不易受干擾物的影響)，并且k_cat低于鐵氰化物的k_cat，但仍為合適的。此外，化合物B在40攝氏度下存放26天后表現(xiàn)出對(duì)葡萄糖的敏感度沒有降低。

化合物B以如下步驟合成。將1,2-萘醌(10mmol)加入甲醇(50ml)中，并于冰中攪拌5分鐘。加入3-巰基丙酸(10mmol)，并且5分鐘內(nèi)溶液變得澄清，并將其蒸發(fā)至干燥。使用乙酸乙酯作為洗脫液于硅膠中純化深棕色固體，得到1,2-萘二酮-4-(3-巰基丙酸)(1.19g，51％)。質(zhì)譜分析確認(rèn)了該組成。然而，一旦獲悉本公開，本領(lǐng)域的技術(shù)人員便可開發(fā)用于合成化合物B的其它方法。

根據(jù)本發(fā)明的包括化合物B的酶試劑的示例性但為非限制性的示例包括以下組分：

10ml的緩沖至pH為7的0.1M磷酸鹽水溶液，已向其加入下列組分：

1％(w/v)Pluronic 103，一種以伯羥基基團(tuán)封端的雙官能嵌段共聚物表面活性劑

2.5％(w/v)羥乙基纖維素，一種增稠劑；

最終濃度為40mM的化合物B

0.05g FAD-GDH

該酶試劑在本文中也稱為“化合物B酶試劑”。

包括化合物A的根據(jù)本發(fā)明的酶試劑的另一個(gè)示例性但為非限制性的示例如下：

100mL的緩沖至pH為7的0.01M磷酸鹽水溶液，已向其加入以下組分：

1％(w/v)二氧化硅

1％(w/v)Pluronic 103

5滴Dow Corning Antifoam 1500(可從VWR International,United Kingdom商購(gòu)獲得)

5％羥乙基纖維素。

進(jìn)行軌道式混合之后，加入以下組分：

最終濃度為175mM的化合物A

0.33g FAD-GDH，由Amano Enzyme China Ltd供應(yīng)

該酶試劑在本文中也稱為“化合物A酶試劑”。

具體地參考圖3和圖4，采用化合物B酶試劑的分析測(cè)試條通過在制備期間使用噴墨技術(shù)施加酶試劑進(jìn)行制備。此類噴墨技術(shù)通常產(chǎn)生厚度在大約0.1微米至5微米范圍內(nèi)的最終干酶層。測(cè)試所得分析測(cè)試條的結(jié)果示出于圖3和圖4中，所述圖示出有利的線性關(guān)系，并且不含來自根據(jù)本發(fā)明實(shí)施方案的分析測(cè)試條的尿酸的干擾。

圖3的數(shù)據(jù)是使用加入某些物質(zhì)的靜脈全血采集到的，所述靜脈全血來自3個(gè)具有正常血細(xì)胞比容(即，在的38％至42％范圍內(nèi))的代表性供體。圖4的數(shù)據(jù)比較了該測(cè)試條和可商購(gòu)獲得的基于電化學(xué)的分析測(cè)試條的性能，并使用YSI血漿葡萄糖濃度為65mg/dL的單個(gè)供體血液進(jìn)行。向血液中加入尿酸，至22mg/dL的最終濃度。與YSI血漿葡萄糖水平的偏差值是按照相關(guān)測(cè)試儀葡萄糖信號(hào)的增加計(jì)算并繪制的，所述信號(hào)的增加是相對(duì)于未添加尿酸的對(duì)照組而言的。圖4示出采用化合物B酶試劑的分析測(cè)試條沒有干擾效應(yīng)。此處未詳述的進(jìn)一步研究顯示出相似不含對(duì)乙酰氨基酚、谷胱甘肽和抗壞血酸的干擾。

具體地參考圖5，采用化合物A酶試劑的分析測(cè)試條通過在制備期間使用絲網(wǎng)印刷技術(shù)涂覆酶試劑進(jìn)行制備。此類絲網(wǎng)印刷技術(shù)通常產(chǎn)生厚度在大約5微米至15微米范圍內(nèi)的最終干酶層。測(cè)試所得分析測(cè)試條的結(jié)果在圖5中示出，該圖示出根據(jù)本發(fā)明另一個(gè)實(shí)施方案的分析測(cè)試條的有利線性關(guān)系。圖5的數(shù)據(jù)是使用加入某些物質(zhì)的靜脈全血采集到的，所述靜脈全血來自3個(gè)具有正常血細(xì)胞比容(即，在38％至42％范圍內(nèi))的代表性供體。

一旦獲悉本公開，本領(lǐng)域的技術(shù)人員便將認(rèn)識(shí)到，可配制包含化合物A和/或化合物B和FAD-GDH的多種合適酶試劑。此類合適的酶試劑可包含例如檸檬酸三鈉、檸檬酸、聚乙烯醇、羥乙基纖維素、消泡劑、熱解法二氧化硅(具有或不具有疏水表面改性)、PVPVA和水。一般來講，關(guān)于試劑層和基于電化學(xué)的分析測(cè)試條的更多細(xì)節(jié)在美國(guó)專利6,241,862和6,733,655中，這些專利的內(nèi)容全部以引用方式并入本文中。

參考圖1和圖2，圖案化絕緣層106可由包括商購(gòu)獲得的可絲網(wǎng)印刷的介電油墨的任何合適的電絕緣電介質(zhì)材料形成。

圖案化隔層110可由例如從Apollo Adhesives,Tamworth,Staffordshire,UK商購(gòu)獲得的可絲網(wǎng)印刷的壓敏粘合劑形成。在圖1和圖2的實(shí)施方案中，圖案化隔層110限定樣本接收室118的外壁。圖案化隔層110的厚度可為例如大約110微米，可為非導(dǎo)電的，并且可由具有頂側(cè)丙烯酸類壓敏粘合劑和底側(cè)丙烯酸類壓敏粘合劑的聚酯材料形成。

例如，頂層112可為具有親水特性的透光膜，該親水特性促進(jìn)基于電化學(xué)的分析測(cè)試條100被流體樣本(例如，全血樣本)潤(rùn)濕和填充。此類透光膜可從例如Minneapolis,Minnesota U.S.A.的3M和Coveme(San Lazzaro di Savena,Italy)商購(gòu)獲得。頂層112可為例如涂覆有表面活性劑的聚酯膜，該表面活性劑提供小于10度的親水性接觸角。頂層112也可為涂覆有表面活性劑或其它表面處理的聚丙烯膜。在此類情況下，表面活性劑涂層用作圖案化親水性亞層114。頂層112可具有例如約100μm的厚度。

可制造基于電化學(xué)的分析測(cè)試條100，例如通過以圖案化導(dǎo)電層104、圖案化絕緣層106、酶試劑層108、圖案化隔層110和頂層112的順序排列形成?？墒褂帽绢I(lǐng)域的技術(shù)人員已知的任何合適的技術(shù)來實(shí)現(xiàn)此類順序排列形成，所述技術(shù)包括例如絲網(wǎng)印刷、噴墨印刷、照相平版印刷、照相凹版印刷、化學(xué)氣相沉積和條帶層合技術(shù)。然而，根據(jù)本發(fā)明實(shí)施方案的酶試劑尤其有用，因?yàn)榭蓪⑺鼈兣渲瞥蛇m用于成本相對(duì)較低并且原本也是常見的噴墨印刷技術(shù)和絲網(wǎng)印刷技術(shù)的含水組合物。例如，可采用此類酶試劑，以在高達(dá)至少700mg/dL的葡萄糖濃度的全血樣本中，產(chǎn)生具有電化學(xué)生成的電流和葡萄糖濃度之間的線性響應(yīng)的酶試劑層。

雖然本文已示出和描述了本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案，但對(duì)本領(lǐng)域的技術(shù)人員顯而易見的是，此類實(shí)施方案僅作為舉例提供。在不脫離本發(fā)明的情況下，本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以設(shè)想出各種變型、更改和替代形式。應(yīng)當(dāng)理解，本文所述的本發(fā)明實(shí)施方案的多種另選形式可用于實(shí)施本發(fā)明。以下權(quán)利要求書旨在限定本發(fā)明的范圍，并覆蓋落入這些權(quán)利要求的范圍內(nèi)的裝置和物質(zhì)的組成及其等同物。