本發(fā)明涉及改進(jìn)在分析方法期間對(duì)應(yīng)于被分析物的存在的信號(hào)的檢測(cè)，尤其是當(dāng)該分析方法需要在液相的存在下獲得信號(hào)時(shí)。

發(fā)明背景

分析方法使得可以檢測(cè)在試樣中一種或若干種被分析物的潛在存在。通常在固體支持體上完成分析方法。在分析方法中，多重分析方法允許同時(shí)檢測(cè)在同一試樣中的若干種被分析物的潛在存在。可以在包含斑點(diǎn)的固體支持體上或成套珠上完成多重分析方法。

傳統(tǒng)上，分析方法包括：在包含待檢測(cè)的被分析物的專門捕捉配體的固體支持體的至少一個(gè)斑點(diǎn)或珠的存在下安放待分析的試樣的步驟，添加待分析并偶聯(lián)到直接或間接標(biāo)記物的被分析物的專門檢測(cè)配體的步驟，可能的通過添加隨后偶聯(lián)到直接或間接標(biāo)記物的報(bào)道物的顯影步驟，和信號(hào)檢測(cè)步驟(也稱作信號(hào)獲得步驟)。在過氧物酶類型的間接標(biāo)記物的情況下，酶的底物的添加允許導(dǎo)致化學(xué)發(fā)光化合物產(chǎn)生的酶促反應(yīng)。隨后，通過化學(xué)發(fā)光檢測(cè)信號(hào)。

原則上，為了連續(xù)地允許制備化學(xué)發(fā)光化合物，通過化學(xué)發(fā)光的信號(hào)的檢測(cè)要求在酶的底物的存在下即在液相的存在下獲得信號(hào)。事實(shí)上，如果在獲得信號(hào)之前進(jìn)行洗滌步驟，則消除了殘余的底物并且酶促反應(yīng)停止。然而通過化學(xué)發(fā)光化合物發(fā)射的信號(hào)被逐漸熄滅。因此，酶的底物必須存在于與固相接觸的液相中，以允許穩(wěn)定和可重現(xiàn)的足夠信號(hào)發(fā)射。

然而，在液相的存在下在微量培養(yǎng)板的孔的斑點(diǎn)處，信號(hào)的獲得導(dǎo)致光干涉。此光干涉具有若干來源：一方面，從斑點(diǎn)向孔的頂部發(fā)射的光子可以與包含化學(xué)發(fā)光化合物的溶液的化合物相互作用，并且在全部方向上漫射；另一方面，光子也可以被孔的壁和被液體/空氣界面處的介質(zhì)變化反射，更具體地，在由孔的壁與包含化學(xué)發(fā)光化合物的溶液的相互作用形成的彎月面處。

此光干涉可以產(chǎn)生相對(duì)于真實(shí)斑點(diǎn)稍微移位的被稱作“孿生斑點(diǎn)(twin spots)”的斑點(diǎn)、在孔的周緣上可見的光環(huán)、或當(dāng)在斑點(diǎn)處發(fā)射的信號(hào)強(qiáng)時(shí)甚至是光弧。此光干涉因此引起成問題的背景噪聲，其可以是假陰性或假陽性結(jié)果的源頭。例如，在孔周圍的光環(huán)可以使背景噪聲的閾值偏置，那么弱信號(hào)被淹沒在背景噪聲中。光干涉也可以阻礙通過斑點(diǎn)周圍的環(huán)形測(cè)量進(jìn)行的對(duì)斑點(diǎn)不存在缺陷的校驗(yàn)。

文獻(xiàn)US 4,318,707描述了用于檢測(cè)試樣中的被分析物的方法，包括在偶聯(lián)到配體/反配體對(duì)的第一成員的吸收劑粒子和第二被標(biāo)記的成員的存在下安放試樣，結(jié)合到偶聯(lián)到吸收劑粒子的第一成員的第二被標(biāo)記的成員的量與被分析物的量有關(guān)。在此文獻(xiàn)中，因此將吸收劑粒子偶聯(lián)到配體/反配體對(duì)的第一成員，并且使得當(dāng)該對(duì)的兩個(gè)成員結(jié)合時(shí)，可以熄滅所述對(duì)的第二被標(biāo)記的成員的信號(hào)。

文獻(xiàn)US 8,163,562描述了一種試驗(yàn)，使得可以減少?gòu)膬?yōu)選為細(xì)胞的細(xì)胞區(qū)劃(compartment)浸泡在其中的溶液的熒光導(dǎo)致的不想要的光。此不想要的熒光尤其來自在試驗(yàn)中使用的探針或化學(xué)化合物。待檢測(cè)的信號(hào)來自就位在膜區(qū)劃中的光子產(chǎn)生劑。所以，在與膜區(qū)劃的外表面接觸的水溶液中使用對(duì)膜來說不可滲透的并且不專門結(jié)合到膜的光子減少劑。

因此，為了確保獲得的結(jié)果同時(shí)避免假陽性或假陰性結(jié)果，對(duì)于使得可以在一個(gè)或多個(gè)斑點(diǎn)上的、在其間在一個(gè)或多個(gè)斑點(diǎn)處的信號(hào)的獲得在液相的存在下發(fā)生的分析方法的情況下改進(jìn)對(duì)應(yīng)于被分析物的存在的信號(hào)的檢測(cè)的方案，存在著需要。

發(fā)明詳述

出人意料地，在斑點(diǎn)分析方法，發(fā)明人已經(jīng)證明了使用吸收劑粒子例如碳粒子可以使得消除平常在液相的存在下獲得信號(hào)后發(fā)生的不想要的光干涉中的一些或全部，卻不干擾、或較少干擾被檢測(cè)的對(duì)應(yīng)于在斑點(diǎn)處的被分析物的存在的信號(hào)(例如，在發(fā)光中)的強(qiáng)度，并使得可以檢測(cè)由在一個(gè)或多個(gè)斑點(diǎn)處作為對(duì)照存在的熒光團(tuán)發(fā)射的熒光(如果可用)。根據(jù)本發(fā)明的吸收劑粒子的使用因此使得可以確保在分析方法的結(jié)束時(shí)獲得的結(jié)果，即，保證在所述方法的結(jié)束時(shí)獲得的所述結(jié)果的可靠性，尤其是通過避免產(chǎn)生假的陽性結(jié)果(也稱作“假陽性”)和/或假的陰性結(jié)果(也稱作“假陰性”)。

“假陽性”是反映在試樣中被檢測(cè)的一種或多種被分析物的存在的陽性結(jié)果，而所述一種或多種被分析物在試樣中并不存在并且不應(yīng)當(dāng)被檢測(cè)到。

“假陰性”是反映在試樣中被檢測(cè)的一種或多種被分析物的不存在的陰性結(jié)果，而所述一種或多種被分析物在試樣中是存在的并且應(yīng)當(dāng)被檢測(cè)到。

被檢測(cè)的對(duì)應(yīng)于在斑點(diǎn)處的被分析物的存在的信號(hào)使得可以檢測(cè)被分析物在試樣中的存在和/或量化在所述試樣中的所述被分析物。

被檢測(cè)的對(duì)應(yīng)于在斑點(diǎn)處的被分析物的存在的信號(hào)是電磁輻射，尤其是光發(fā)射。

被檢測(cè)的對(duì)應(yīng)于在斑點(diǎn)處的被分析物的存在的信號(hào)優(yōu)選是通過發(fā)光例如通過化學(xué)發(fā)光檢測(cè)的信號(hào)，和/或通過熒光檢測(cè)的信號(hào)。

當(dāng)被檢測(cè)的對(duì)應(yīng)于在斑點(diǎn)處的被分析物的存在的信號(hào)是通過發(fā)光優(yōu)選通過化學(xué)發(fā)光檢測(cè)的信號(hào)時(shí)，根據(jù)本發(fā)明的吸收劑粒子使得可以改進(jìn)被檢測(cè)的信號(hào)/背景噪聲比率。

在固體支持體的一個(gè)或多個(gè)斑點(diǎn)中存在的熒光團(tuán)可以起到對(duì)在分析方法結(jié)束時(shí)一個(gè)或多個(gè)斑點(diǎn)的品質(zhì)(尤其是它們的存在、位置和/或完整性)進(jìn)行對(duì)照和/或改進(jìn)一種或多種被分析物的檢測(cè)的靈敏度的作用等，其是通過在分析方法結(jié)束時(shí)限定來自一個(gè)或多個(gè)斑點(diǎn)的實(shí)際位置的對(duì)應(yīng)于一種或多種被分析物的信號(hào)的讀取格柵完成的。在固體支持體的一個(gè)或多個(gè)斑點(diǎn)中使用熒光團(tuán)因此也使得可以確保斑點(diǎn)分析方法的結(jié)果。

此外，根據(jù)本發(fā)明的吸收劑粒子使得可以對(duì)在固體支持體的區(qū)劃的一個(gè)或多個(gè)斑點(diǎn)的存在下所述吸收劑粒子的安放進(jìn)行對(duì)照，并且，當(dāng)將所述吸收劑粒子以吸收劑組合物的形式添加時(shí)，使得可以對(duì)在固體支持體的區(qū)劃的一個(gè)或多個(gè)斑點(diǎn)的存在下包含在所述吸收劑組合物中的任何化合物的安放進(jìn)行對(duì)照。

根據(jù)本發(fā)明的吸收劑粒子因此使得可以改進(jìn)(并且因此確保)在分析方法期間對(duì)應(yīng)于被分析物的存在的信號(hào)的檢測(cè)，其是通過部分地或全部地隱藏和/或吸收在液相的存在下獲得待檢測(cè)的信號(hào)期間的不想要的光干涉。信號(hào)檢測(cè)的改進(jìn)可以通過測(cè)量“被檢測(cè)的信號(hào)/背景噪聲”比率來評(píng)估。

此外，在根據(jù)本發(fā)明的分析方法中使用吸收劑粒子具有以下優(yōu)點(diǎn)：能夠使用其一個(gè)或多個(gè)區(qū)劃的一個(gè)或多個(gè)壁包含透明材料或由透明材料組成的固體支持體，此類型的支持體與包含不透明材料或由不透明材料組成的那些相比較不昂貴。

本發(fā)明的第一目的是提供一種吸收劑組合物，其能夠用于在一個(gè)或多個(gè)斑點(diǎn)上的分析方法中，以改進(jìn)對(duì)應(yīng)于被分析物的存在的信號(hào)的檢測(cè)。

本發(fā)明的第二目的是提供一種分析方法，優(yōu)選多重分析方法，使得可以改進(jìn)對(duì)應(yīng)于被分析物的存在的信號(hào)的檢測(cè)，所述方法包括以下步驟：

a)提供固體支持體，所述固體支持體包含至少一個(gè)區(qū)劃，所述區(qū)劃包含用于檢測(cè)被分析物的至少一個(gè)斑點(diǎn)，

b)在固體支持體的所述區(qū)劃的一個(gè)或多個(gè)斑點(diǎn)的存在下安放待分析的試樣，

c)在所述區(qū)劃的所述一個(gè)或多個(gè)斑點(diǎn)的存在下安放被分析物的至少一種檢測(cè)配體，所述被分析物的檢測(cè)配體與直接或間接檢測(cè)標(biāo)記物偶聯(lián)，

d)當(dāng)所述檢測(cè)標(biāo)記物是間接檢測(cè)標(biāo)記物時(shí)，在所述區(qū)劃的所述一個(gè)或多個(gè)斑點(diǎn)的存在下安放與所述檢測(cè)配體偶聯(lián)的所述間接檢測(cè)標(biāo)記物的報(bào)道物，

e)當(dāng)在步驟d)中使用的報(bào)道物與間接標(biāo)記物偶聯(lián)時(shí)，在所述區(qū)劃的一個(gè)或多個(gè)斑點(diǎn)的存在下安放與所述報(bào)道物偶聯(lián)的所述間接檢測(cè)標(biāo)記物的報(bào)道物，

f)在所述區(qū)劃的一個(gè)或多個(gè)斑點(diǎn)的存在下安放吸收劑粒子，所述吸收劑粒子被包含在與所述區(qū)劃的一個(gè)或多個(gè)斑點(diǎn)接觸的液相中，以及

g)在包含所述吸收劑粒子的液相的存在下，檢測(cè)對(duì)應(yīng)于在所述區(qū)劃的一個(gè)或多個(gè)斑點(diǎn)處被分析物的存在的信號(hào)。

本發(fā)明的第三目的涉及吸收劑粒子在一個(gè)或多個(gè)斑點(diǎn)上的分析方法中改進(jìn)對(duì)應(yīng)于被分析物的存在的信號(hào)的檢測(cè)的用途，所述信號(hào)的檢測(cè)上的改進(jìn)例如特征在于背景噪聲的強(qiáng)度的減少。

本發(fā)明的第四目的涉及用于進(jìn)行分析方法的試劑盒，其使得可以改進(jìn)對(duì)應(yīng)于被分析物的存在的信號(hào)的檢測(cè)。

試樣

待分析的試樣優(yōu)選是生物試樣。

生物試樣可以是生物流體，如血液的試樣、血液衍生物(如血漿或血清)、尿液、腦脊髓液、唾液，或組織試樣，如由活組織檢查獲得的組織、細(xì)胞或細(xì)胞組、植物提取物，或它們的組合。

血液衍生物指的是任何從血液樣品獲得的產(chǎn)物，尤其是流體。

待分析的試樣也可以是培養(yǎng)基和/或培養(yǎng)物上清液。

在被分析之前，試樣可以經(jīng)歷一個(gè)或若干個(gè)前處理步驟，如稀釋、離心、熱處理、細(xì)胞溶解(例如通過一種或若干種離液劑、一種或若干種還原劑和/或通過加熱)、萃取、PCR(聚合酶鏈反應(yīng))、添加未被標(biāo)記的檢測(cè)配體、或它們的組合。對(duì)于執(zhí)行中和試驗(yàn)來說，添加未被標(biāo)記的檢測(cè)配體尤其有用，中和試驗(yàn)本身是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的試驗(yàn)。

試樣也可以是至少兩種樣品的混合物，所述試樣可以是相同性質(zhì)或不同性質(zhì)的。

不同性質(zhì)的試樣的混合物的實(shí)例是血漿和血清的混合物、血液和血漿的混合物、血清和血漿的混合物、或血液、血清和血漿的混合物。

一種優(yōu)選的根據(jù)本發(fā)明的試樣是血液和/或血液衍生物的試樣或試樣混合物。

被分析物

在試樣中待檢測(cè)的被分析物可以是人們希望在試樣中檢測(cè)和/或量化任何類型的天然的或合成的化合物。

被分析物可以例如是例如蛋白、肽、糖蛋白、碳水化合物、脂質(zhì)、細(xì)胞、細(xì)胞器、病毒或核酸。

細(xì)胞可以是動(dòng)物細(xì)胞、植物細(xì)胞、細(xì)菌細(xì)胞、原生動(dòng)物、后生動(dòng)物細(xì)胞、酵母細(xì)胞、真菌細(xì)胞或原生動(dòng)物。

核酸指代通過磷酸二酯鍵連接的核苷的聚合物，如脫氧核糖核酸(DNA)、核糖核酸(RNA)或它們的類似物，如硫代膦酸酯或硫代酯，以單鏈或雙鏈的形式。

被分析物或多種被分析物的至少一種例如選自由以下各項(xiàng)組成的組：抗原、抗體、抗體片段、半抗原、激素、激素受體、酶或核酸。

在此，“抗原”指的是天然的或合成的分子，其被免疫系統(tǒng)的抗體或細(xì)胞所識(shí)別并且能夠引起免疫應(yīng)答?？乖膶?shí)例是蛋白質(zhì)、肽、糖蛋白、碳水化合物或脂質(zhì)。

“半抗原”在此指的是能夠被免疫系統(tǒng)所識(shí)別的具有低分子量的分子，但是其僅當(dāng)它偶聯(lián)到載體分子時(shí)才是免疫原性的。

在本申請(qǐng)中，“載體分子”尤其指的是蛋白質(zhì)或碳水化合物載體分子。載體分子可以是多肽(尤其是蛋白質(zhì)或肽)，其可以是或可以不是天然的(例如，重組的蛋白質(zhì)或合成的肽)，官能化的聚合物(如葡聚糖、多糖或聚賴氨酸)、混合的共聚物(尤其是不同氨基酸的共聚物，例如賴氨酸-酪氨酸共聚物)或抗體(尤其是單克隆抗體或多克隆抗體)，例如免疫球蛋白(也稱作Ig)。載體分子的一個(gè)實(shí)例是BSA(牛血清白蛋白)。

被分析物或多種被分析物中的至少一種優(yōu)選是使得可以診斷受試者中可以是或可以不是病理性的病況或者診斷發(fā)展可以是或可以不是病理性的病況的風(fēng)險(xiǎn)的化合物。非病理性的病況的實(shí)例是妊娠。

受試者可以是人類、非人類動(dòng)物或植物。非人類動(dòng)物優(yōu)選是哺乳動(dòng)物，如貓、狗、猴、兔、小鼠或大鼠。

術(shù)語“人類”被廣泛使用，并且尤其指代任何年齡的男人或女人，如嬰兒、兒童、青少年、成人或老人。

當(dāng)被分析物或多種被分析物中的至少一種是抗原時(shí)，它優(yōu)選是使得可以診斷傳染的抗原，例如由病毒、細(xì)菌、真菌或寄生蟲引起的傳染。

當(dāng)被分析物或多種被分析物中的至少一種是抗體時(shí)，它優(yōu)選是使得可以診斷傳染的抗體，例如由病毒、細(xì)菌、真菌或寄生蟲引起的傳染。

典型地，這可以包括以下各項(xiàng)的一種或若干種抗原和/或一種或若干種抗體：

-病毒，如HIV(人類免疫缺損病毒)，尤其是HIV-1或HIV-2，HBV(乙型肝炎病毒)，HCV(丙型肝炎病毒)，HPV(人乳頭瘤病毒)，HTLV(人類嗜T淋巴細(xì)胞病毒)，尤其HTLV-I或HTLV-II，

-寄生蟲，如可以在人類或非人類動(dòng)物內(nèi)引起以下各項(xiàng)的寄生蟲：弓形體病(尤其是弓形蟲(Toxoplasma gondii))，瘧疾(尤其是瘧原蟲屬(Plasmodium genus)的寄生蟲，例如惡性瘧原蟲(Plasmodium falciparum)，間日瘧原蟲(Plasmodium vivax)，卵形瘧原蟲(Plasmodium ovale)，三日瘧原蟲(Plasmodium malariae)或諾氏瘧原蟲(Plasmodium knowlesi))或查加斯(Chagas)病(尤其是克魯斯錐蟲(Trypanosoma cruzi))，或

-細(xì)菌，如能夠在人類或非人類動(dòng)物內(nèi)引起以下各項(xiàng)的細(xì)菌：梅毒(蒼白密螺旋體(Treponema pallidum))或萊姆(Lyme)病(尤其是來自包柔氏螺旋體屬(Borrelia genus)的細(xì)菌)。

“寄生蟲”在此指的是充當(dāng)相對(duì)于身體的寄生蟲的并且引起寄生蟲病的后生動(dòng)物或原生動(dòng)物。在本發(fā)明的含義內(nèi)的寄生蟲因此不是病毒、細(xì)菌或真菌。

被分析物或多種被分析物中的至少一種也可以是用于疾病的標(biāo)記物，如心血管病的標(biāo)記物或糖尿病標(biāo)記物，疾病如肝炎的進(jìn)展的標(biāo)記物，由病毒、細(xì)菌、真菌或寄生蟲引起的傳染的進(jìn)展的標(biāo)記物，對(duì)治療例如對(duì)抗病毒治療、抗生素治療或癌癥治療的耐性的標(biāo)記物。

可以在多重分析方法期間，在試樣中同時(shí)檢測(cè)若干種(例如，二、三、四、五、六、七、八、九、十、十一、十二、十三、十四、十五、十六或多于十六種)本申請(qǐng)中所述的被分析物。這可以使得可以在相同的試樣中診斷受試者中一種或若干種傳染或疾病、傳染或疾病的進(jìn)展、病況(病理性的或不是病理性的)、發(fā)展病況(病理性的或不是病理性的)的風(fēng)險(xiǎn)或?qū)χ委煹哪托缘臉?biāo)記物。

在多重分析方法期間檢測(cè)的被分析物可以是相同性質(zhì)的(例如僅為抗體或僅為抗原)或不同性質(zhì)的(例如，至少一種抗原和至少一種抗體)。

捕捉配體

捕捉配體是在斑點(diǎn)處固定在固體支持體上的化合物。

至少一種捕捉配體專門針對(duì)在試樣中的待檢測(cè)的被分析物。

捕捉配體可以是抗體、抗原、肽、碳水化合物、脂質(zhì)或核酸。

捕捉配體優(yōu)選是抗體或抗原。

當(dāng)捕捉配體是抗體時(shí)，它例如包括單克隆抗體或多克隆抗體。

檢測(cè)配體

檢測(cè)配體意在揭示它專門針對(duì)的化合物的存在。

檢測(cè)配體可以是抗體、抗原、肽、碳水化合物、脂質(zhì)或核酸。

檢測(cè)配體優(yōu)選是抗體或抗原。

當(dāng)檢測(cè)配體是抗體時(shí)，它例如包括單克隆抗體或多克隆抗體。

檢測(cè)配體優(yōu)選是被標(biāo)記的檢測(cè)配體，即，向其共價(jià)或非共價(jià)附接了檢測(cè)標(biāo)記物的檢測(cè)配體。

當(dāng)檢測(cè)配體是未被標(biāo)記的時(shí)，可以通過使用所述檢測(cè)配體的專門的被標(biāo)記的抗體，獲得它的檢測(cè)。

至少一種檢測(cè)配體專門針對(duì)在試樣中的待檢測(cè)的被分析物。

檢測(cè)配體與所用的捕捉配體或所用的多種捕捉配體中的一種可以是同樣的，區(qū)別在于檢測(cè)標(biāo)記物的任何存在，并且/或者在與被捕捉配體或多種捕捉配體中的一種結(jié)合的區(qū)域相同的區(qū)域連結(jié)到它專門針對(duì)的化合物。在這種情況下，如果捕捉配體和所述檢測(cè)配體是抗體，則其涉及“同種三明治(allogenic sandwich)”。

捕捉配體和檢測(cè)配體或多種檢測(cè)配體中的一種可以針對(duì)它們所專門針對(duì)的化合物處的分開的區(qū)域，以避免捕捉配體和檢測(cè)配體關(guān)于它們所專門針對(duì)的化合物由于位阻導(dǎo)致的競(jìng)爭(zhēng)。在這種情況下，如果所述檢測(cè)配體和所述捕捉配體是抗體，那么它涉及“異源三明治(allogenic sandwich)”。

在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，專門針對(duì)同一化合物的檢測(cè)配體和捕捉配體不結(jié)合到所述化合物上的同一位置。更優(yōu)選地，所述檢測(cè)配體結(jié)合到遠(yuǎn)離與所述捕捉配體的連結(jié)區(qū)域的所述化合物的區(qū)域。

在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，檢測(cè)配體與捕捉配體是同樣的，區(qū)別在于檢測(cè)標(biāo)記物的任何存在，并且/或者在與被所述捕捉配體結(jié)合的區(qū)域相同的區(qū)域結(jié)合到它專門針對(duì)的化合物，尤其是當(dāng)它專門針對(duì)的化合物是具有至少兩個(gè)同樣的結(jié)合區(qū)域的配合物的形式時(shí)。

檢測(cè)標(biāo)記物

檢測(cè)標(biāo)記物可以是直接標(biāo)記物或間接標(biāo)記物。

直接標(biāo)記物是其信號(hào)可以被直接檢測(cè)(即不需要在前添加報(bào)道物)的標(biāo)記物。

直接標(biāo)記物例如選自由以下各項(xiàng)組成的組：熒光團(tuán)、發(fā)光化合物、和熒光或發(fā)光納米粒子。

“發(fā)光”化合物可以是電致發(fā)光化合物、熱致發(fā)光化合物或化學(xué)發(fā)光化合物。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，發(fā)光化合物是化學(xué)發(fā)光化合物。

可以用作直接標(biāo)記物的一種實(shí)例發(fā)光化合物(更具體地，熱致發(fā)光化合物)由二氧化硅納米粒子組成，所述二氧化硅納米粒子包含(例如摻雜有)二氧雜環(huán)丁烷化合物的分子，尤其是1，2-二氧雜環(huán)丁烷化合物，或二氧雜環(huán)丁烷化合物的衍生物，例如，1，2-二氧雜環(huán)丁烷的衍生物。

間接標(biāo)記物是這樣的標(biāo)記物：對(duì)于其來說，信號(hào)的檢測(cè)需要：在前添加報(bào)道物(也稱作第一報(bào)道物)，以及，如果所述報(bào)道物它本身偶聯(lián)到間接檢測(cè)標(biāo)記物(例如，酶)，添加偶聯(lián)到所述第一報(bào)道物的間接檢測(cè)標(biāo)記物的第二報(bào)道物(例如，該酶的底物)。

間接標(biāo)記物例如選自由以下各項(xiàng)組成的組：酶、配體-受體對(duì)的配體、配體-受體對(duì)的受體、半抗原、抗原和抗體。

配體-受體對(duì)的配體或受體是例如生物素、生物素的類似物、抗生物素蛋白、鏈霉抗生物素蛋白、中性抗生物素蛋白或地高辛配基。

報(bào)道物是間接標(biāo)記物的底物或是專門結(jié)合到間接標(biāo)記物的分子，所述分子它自己是直接或間接標(biāo)記物或它自己偶聯(lián)到直接或間接標(biāo)記物。

底物是例如酶的底物。

專門結(jié)合到間接標(biāo)記物的分子是，例如，配體-受體對(duì)的配體或受體，如生物素、生物素的類似物、抗生物素蛋白、鏈霉抗生物素蛋白、中性抗生物素蛋白或地高辛配基。

酶的報(bào)道物是例如所述酶的底物。

使得可以產(chǎn)生發(fā)光化合物的分子的報(bào)道物是例如底物、酶或催化劑。

生物素的報(bào)道物是，例如，抗生物素蛋白、鏈霉抗生物素蛋白或中性抗生物素蛋白，優(yōu)選與直接標(biāo)記物或間接標(biāo)記物如酶偶聯(lián)。

根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選的間接標(biāo)記物是生物素和酶，優(yōu)選通過與底物的反應(yīng)產(chǎn)生發(fā)光化合物的酶。

實(shí)例酶是過氧物酶，例如辣根過氧物酶(HRP)、熒光素酶或堿式磷酸酶。

一種優(yōu)選的根據(jù)本發(fā)明的生物素報(bào)道物是與過氧物酶、優(yōu)選辣根過氧物酶偶聯(lián)的鏈霉抗生物素蛋白。

作為實(shí)例，如果偶聯(lián)到被分析物的檢測(cè)配體的間接檢測(cè)標(biāo)記物的報(bào)道物(稱為第一報(bào)道物)偶聯(lián)到過氧物酶，在后續(xù)步驟中必須添加此過氧物酶的報(bào)道物(也稱作第二報(bào)道物)，即，此酶的底物，如魯米諾、異魯米諾和/或魯米諾或異魯米諾的衍生物。在這種情況下，第二報(bào)道物是底物。

固體支持體

用于進(jìn)行根據(jù)本發(fā)明的分析方法的一種或多種支持體是固體支持體。

固體支持體可以由任何適合于進(jìn)行分析方法的材料制成。

固體支持體是例如具有聚合物的或聚合物的混合物的基底的支持體。適合的根據(jù)本發(fā)明的固體支持體是例如由聚苯乙烯、聚丙烯、聚(甲基)丙烯酸酯、聚丁二烯或它們的組合制成的支持體。

一種優(yōu)選的固體支持體由聚苯乙烯和/或聚丙烯制成。

另一類型的適合的根據(jù)本發(fā)明的固體支持體是例如無機(jī)固體支持體，如玻璃。

支持體可以例如是板、微量培養(yǎng)板、載片或膜形式的。

固體支持體包含至少一個(gè)區(qū)劃，其也稱作分析區(qū)。固體支持體的一個(gè)或多個(gè)區(qū)劃限定了固體支持體的定向。固體支持體的頂部(也稱作所述固體支持體上表面)位于一個(gè)或多個(gè)區(qū)劃的側(cè)面上，并且因此在一個(gè)或多個(gè)斑點(diǎn)的側(cè)面上。固體支持體的底部(也稱作所述固體支持體的下表面)是相反的面。

根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)特別的實(shí)施方案，固體支持體包含單一的區(qū)劃。所述單一的區(qū)劃可以是包含底部和一個(gè)或若干個(gè)壁的區(qū)劃或由底部和一個(gè)或若干個(gè)壁組成的區(qū)劃。

備選地，所述單一的區(qū)劃可以不具有壁并且那么與固體支持體它自己是可比的。那么區(qū)劃的底部可以由所述固體支持體的上面構(gòu)成。

這樣的包含單一區(qū)劃(其可以包含或可以不包含一個(gè)或若干個(gè)孔)固體支持體的一個(gè)實(shí)例包括載片或膜。

根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)特別的實(shí)施方案，可以是例如微量培養(yǎng)板的固體支持體包含至少兩個(gè)區(qū)劃。

當(dāng)固體支持體包含至少兩個(gè)區(qū)劃時(shí)，它們是相互隔離的，使得它們不相互溝通，即，使得在實(shí)施分析方法期間使用的各種組合物(尤其是溶液)不能在分析方法期間從一個(gè)區(qū)劃流通到另一個(gè)。

因此，添加到一個(gè)區(qū)劃中的溶液將不進(jìn)入其他的區(qū)劃。例如，一個(gè)或多個(gè)區(qū)劃包含或由以下組成：底部和一個(gè)或若干個(gè)壁，所述一個(gè)或多個(gè)壁將一個(gè)或多個(gè)區(qū)劃相互隔離開，使得它們不相互溝通。

固體支持體優(yōu)選為微量培養(yǎng)板。在這種情況下，一種實(shí)例區(qū)劃是孔。微量培養(yǎng)板典型是具有96孔或384孔的微量培養(yǎng)板。

在一個(gè)特別的實(shí)施方案中，當(dāng)固體支持體包含至少兩個(gè)區(qū)劃時(shí)，可以使它們進(jìn)一步相互隔離開，使得在一個(gè)區(qū)劃處發(fā)射的信號(hào)完全或部分不在另一個(gè)區(qū)劃中被檢測(cè)到。為此，一個(gè)或多個(gè)區(qū)劃的一個(gè)或多個(gè)壁可以包含不透明材料或由不透明材料組成。

“不透明材料”尤其指的是不允許或基本上不允許要被檢測(cè)的對(duì)應(yīng)于被分析物的存在的信號(hào)通過的材料?！盎旧喜辉试S要被檢測(cè)的信號(hào)通過”意指不透明材料允許不大于20％、優(yōu)選不大于15％、更優(yōu)選不大于10％、再更優(yōu)選不大于5％、且甚至更優(yōu)選不大于2％、不大于1％或不大于0.5％的要被檢測(cè)的信號(hào)通過。不透明材料的一個(gè)實(shí)例是黑色材料。

在另一個(gè)特別的實(shí)施方案中，當(dāng)固體支持體包含至少兩個(gè)區(qū)劃時(shí)，一個(gè)或多個(gè)區(qū)劃的一個(gè)或多個(gè)壁包含透明材料或由透明材料組成。

在另一個(gè)特別的實(shí)施方案中，當(dāng)固體支持體包含至少兩個(gè)區(qū)劃時(shí)，一個(gè)或多個(gè)區(qū)劃可以包含至少一個(gè)由透明材料組成的壁和至少一個(gè)由不透明材料組成的壁。

“透明材料”尤其指的是允許至少80％的要被檢測(cè)的對(duì)應(yīng)于被分析物的存在的信號(hào)通過的材料，優(yōu)選至少85％的要被檢測(cè)的信號(hào)，更優(yōu)選至少90％的要被檢測(cè)的信號(hào)，更優(yōu)選至少95％的要被檢測(cè)的信號(hào)。

在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，固體支持體的一個(gè)或多個(gè)區(qū)劃的底部包含透明材料或由透明材料組成，以允許通過區(qū)劃的底部檢測(cè)要被檢測(cè)的對(duì)應(yīng)于被分析物的存在的信號(hào)。

不透明材料的實(shí)例是有色玻璃、有色聚苯乙烯、有色聚乙烯、有色聚丙烯或它們的組合。

透明材料的實(shí)例是玻璃、聚苯乙烯、聚甲基戊烯、聚碳酸酯、丙烯腈丁二烯苯乙烯、聚甲基丙烯酸甲酯或它們的組合。

典型地，每個(gè)待分析的試樣使用固體支持體的至少一個(gè)(例如一個(gè)或兩個(gè))區(qū)劃。

在其中固體支持體(例如載片或膜)包含單一區(qū)劃的本發(fā)明的一個(gè)特別的實(shí)施方案中，每個(gè)待分析的試樣使用至少一個(gè)(例如一個(gè)或兩個(gè))固體支持體。

用于分析試樣的固體支持體的區(qū)劃包含至少一個(gè)斑點(diǎn)、至少兩個(gè)斑點(diǎn)、至少三個(gè)斑點(diǎn)，例如三個(gè)斑點(diǎn)、四個(gè)斑點(diǎn)或五個(gè)斑點(diǎn)，或至少六個(gè)斑點(diǎn)，優(yōu)選六個(gè)斑點(diǎn)、七個(gè)斑點(diǎn)、八個(gè)斑點(diǎn)，更優(yōu)選至少九個(gè)斑點(diǎn)，例如九個(gè)斑點(diǎn)、十個(gè)斑點(diǎn)、十一個(gè)斑點(diǎn)、十二個(gè)斑點(diǎn)、十三個(gè)斑點(diǎn)、十四個(gè)斑點(diǎn)、十五個(gè)斑點(diǎn)、十六個(gè)斑點(diǎn)或多于十六個(gè)斑點(diǎn)。

“斑點(diǎn)”在此指的是位于固體支持體的區(qū)劃的底表面上的區(qū)域，該區(qū)域包含至少一種感興趣的化合物。感興趣的一種或多種化合物因此可以通過非共價(jià)物理化學(xué)相互作用(例如弱鍵類型，且尤其是離子的、范德華、氫和/或疏水的)或通過共價(jià)鍵固定到區(qū)劃的底表面。

斑點(diǎn)除了一種或多種感興趣的化合物之外可以含有至少一種聚合物，尤其是至少一種包括親水基團(tuán)的聚合物，例如至少一種水凝膠。

在本申請(qǐng)的含義內(nèi)，“至少”指的是一或若干，若干尤其意味著二、三、四、五、六、七、八、九、十、十一、十二、十三、十四、十五、十六或多于十六。

斑點(diǎn)對(duì)應(yīng)于孔限定的區(qū)域，通常是小的，例如包含0.0078mm²至5.309mm²之間、優(yōu)選0.196mm²至3.142mm²、更優(yōu)選包含0.503mm²至2.011mm²。

斑點(diǎn)具有平圓形的或大約平圓形的(例如卵形的)形狀，尤其是當(dāng)固體支持體是微量培養(yǎng)板或載片時(shí)。

備選地，斑點(diǎn)可以具有正方或矩形的形狀(尤其是條帶)，例如當(dāng)固體支持體是膜時(shí)，或任何其他形狀。

使用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的技術(shù)(參見例如文獻(xiàn)US 7,470,547、US 6,576,295、US 5,916,524或US 5,743,960)，獲得斑點(diǎn)。

例如，通過將至少一滴含有確定量的一種或多種所述感興趣的化合物的溶液沉積在區(qū)劃的表面上的特殊位置中，獲得斑點(diǎn)。

當(dāng)斑點(diǎn)包含至少一種聚合物(例如至少一種水凝膠)時(shí)，可以通過將至少一滴含有確定量的一種或多種所述感興趣的化合物的溶液沉積在其上已經(jīng)預(yù)先沉積了所述聚合物的區(qū)劃的表面上的特殊位置中，獲得所述斑點(diǎn)。

也可以通過一種或多種所述感興趣的化合物在區(qū)劃的表面上的特殊位置中的原位合成，獲得斑點(diǎn)。在這種情況下，一種或多種所述感興趣的化合物有資格作為探針。這可以涉及核酸或肽(見例如文獻(xiàn)US 5,143,854)。

感興趣的化合物可以例如是捕捉配體、偶聯(lián)到間接標(biāo)記物的載體分子、間接標(biāo)記物、或熒光團(tuán)。

在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，區(qū)劃的至少一個(gè)斑點(diǎn)包含專門針對(duì)待檢測(cè)的被分析物的至少一種捕捉配體。

在一個(gè)有利的實(shí)施方案中，區(qū)劃的至少一個(gè)斑點(diǎn)，優(yōu)選區(qū)劃的全部斑點(diǎn)，包含至少兩種感興趣的化合物，這些感興趣的化合物中的一種是熒光團(tuán)。所述熒光團(tuán)尤其用于在分析方法尤其是多重分析方法結(jié)束時(shí)對(duì)斑點(diǎn)的存在、位置和/或完整性進(jìn)行對(duì)照。例如，區(qū)劃的至少一個(gè)斑點(diǎn)包含至少一種專門針對(duì)被分析物的檢測(cè)配體和至少一種熒光團(tuán)。

在一個(gè)有利的實(shí)施方案中，固體支持體的每個(gè)區(qū)劃包含相同的斑點(diǎn)數(shù)量。此外，固體支持體的每個(gè)區(qū)劃包含相同的斑點(diǎn)數(shù)量和相同的斑點(diǎn)組成。

在另一個(gè)有利的實(shí)施方案中，支持體可以包含一個(gè)或若干個(gè)區(qū)劃，其沒有斑點(diǎn)，或具有不同的斑點(diǎn)數(shù)量和/或斑點(diǎn)組成。支持體可以例如包含至少兩個(gè)分開的區(qū)劃的組(或類型)，分開的組的每個(gè)具有不同的斑點(diǎn)數(shù)量和/或斑點(diǎn)組成。

相對(duì)于每種待檢測(cè)的被分析物，區(qū)劃通常包含至少一個(gè)斑點(diǎn)，每種被分析物例如能夠?qū)?yīng)于待檢測(cè)的傳染或疾病、傳染或疾病的進(jìn)展、受試者的病況(病理性的或不是病理性的)、發(fā)展病況(病理性的或不是病理性的)的風(fēng)險(xiǎn)或?qū)χ委煹哪托缘臉?biāo)記物。區(qū)劃的若干斑點(diǎn)也可以意在分析相同的被分析物。區(qū)劃因此包含至少一個(gè)意在檢測(cè)被分析物的斑點(diǎn)，優(yōu)選至少兩個(gè)意在檢測(cè)被分析物的斑點(diǎn)。

同一斑點(diǎn)可以包含若干不同的捕捉配體(例如，若干抗體和/或抗原)，它們例如針對(duì)相同的待檢測(cè)的病理、傳染或疾病是專門的(尤其針對(duì)相同的病毒、相同的細(xì)菌、相同的真菌或相同的寄生蟲是專門的)，或者針對(duì)相同的傳染或疾病的進(jìn)展、相同的受試者的病況(病理性的或不是病理性的)、相同的發(fā)展病況(病理性的或不是病理性的)的風(fēng)險(xiǎn)或相同的對(duì)治療的耐性的標(biāo)記物是專門的。

在一個(gè)有利的實(shí)施方案中，區(qū)劃包含至少一個(gè)對(duì)照斑點(diǎn)，使得可以驗(yàn)證分析方法尤其是多重分析方法的至少一個(gè)步驟。

信號(hào)的檢測(cè)

信號(hào)的檢測(cè)取決于所用的標(biāo)記物的類型。

被檢測(cè)的信號(hào)是電磁輻射。

電磁輻射可以是光，例如紫外輻射、可見光或紅外輻射。紫外輻射是波長(zhǎng)為10至380nm的電磁輻射?？梢姽馐前?80nm至780nm的波長(zhǎng)的電磁輻射。紅外輻射是包含780nm至1mm的波長(zhǎng)的電磁輻射。

在此，表述“信號(hào)的檢測(cè)”和“信號(hào)的獲得”是同義的。

“信號(hào)的檢測(cè)”尤其指的是對(duì)應(yīng)于被分析物的存在的信號(hào)的檢測(cè)或?qū)?yīng)于方法的對(duì)照的信號(hào)的檢測(cè)。

本領(lǐng)域技術(shù)人員知道如何基于所用的一種或多種檢測(cè)標(biāo)記物檢測(cè)在斑點(diǎn)處的信號(hào)。例如，使用捕捉固體支持體的底部的圖像的照相機(jī)檢測(cè)信號(hào)。

信號(hào)的檢測(cè)通常包括測(cè)量信號(hào)的強(qiáng)度，例如以RLU(相對(duì)光單位)表示的強(qiáng)度。

可以通過在由光能激發(fā)后的熒光直接讀取由熒光團(tuán)型的直接標(biāo)記物發(fā)射的信號(hào)。

事實(shí)上，熒光團(tuán)，也稱作熒色物或熒光分子，是能夠在用光能激發(fā)之后發(fā)射熒光的臨床物質(zhì)。

在本發(fā)明的上下文中，所用的吸收劑粒子在信號(hào)的檢測(cè)期間必須存在，并且信號(hào)的檢測(cè)在液相的存在下完成。

通過使用根據(jù)本發(fā)明的吸收劑粒子，通過檢測(cè)在斑點(diǎn)處發(fā)射的對(duì)應(yīng)于被分析物的存在的信號(hào)，可以降低背景噪聲，且尤其可以改進(jìn)“被檢測(cè)的信號(hào)/背景噪聲”比率，優(yōu)選通過捕捉固體支持體的底部的圖像檢測(cè)所述信號(hào)。

在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，在根據(jù)本發(fā)明的分析方法中被檢測(cè)的信號(hào)是由化學(xué)發(fā)光化合物通過化學(xué)發(fā)光發(fā)射的信號(hào)。

化學(xué)發(fā)光是導(dǎo)致光的產(chǎn)生的化學(xué)反應(yīng)。一種此類型的反應(yīng)是魯米諾(3-氨基苯二甲酰肼，也稱作5-氨基-2，3-二氫-酞嗪-1，4-二酮，原式為C₈H₇N₃O₂)、異魯米諾和/或魯米諾或異魯米諾的衍生物通過氧化劑(例如充氧水或任何氫氧化物)的氧化-還原。在化學(xué)發(fā)光反應(yīng)期間，發(fā)現(xiàn)由反應(yīng)產(chǎn)生的分子處于激發(fā)態(tài)：這是化學(xué)發(fā)光化合物。導(dǎo)致光的發(fā)射的是化學(xué)發(fā)光化合物向基態(tài)的返回。

在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，通過化學(xué)發(fā)光檢測(cè)的信號(hào)是通過過氧物酶與它的底物(例如魯米諾、異魯米諾(也稱作4-氨基苯二甲酰肼)和/或魯米諾或異魯米諾的衍生物)的反應(yīng)發(fā)射的。此反應(yīng)也需要氧化劑的存在，并且如果可用，需要電子介體的存在。

魯米諾或異魯米諾的衍生物優(yōu)選分別是通過所有可能的一種或多種修改(例如，化學(xué)的和/或酶的)從魯米諾或異魯米諾獲得的分子。魯米諾或異魯米諾的衍生物例如是過氧物酶的底物，所述過氧物酶與魯米諾或異魯米諾的所述衍生物的反應(yīng)使得可以產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光化合物。

異魯米諾的衍生物可以是例如氨基乙基異魯米諾(或AEI)、氨基乙基乙基異魯米諾(或AEEI)、氨基丁基異魯米諾(或ABI)、氨基丁基乙基異魯米諾(或ABEI)、氨基戊基乙基異魯米諾(或APEI)、氨基己基異魯米諾(或AHI)、氨基己基乙基異魯米諾(或AHEI)、氨基辛基甲基異魯米諾(或AOMI)或氨基辛基乙基異魯米諾(或AOEI)，如在出版物Dodeigne C.et al(2000)，Talanta 51，415-439，“作為診斷工具的化學(xué)發(fā)光.回顧(Chemiluminescence as diagnostic too/.A review)”中所述。

根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)特別實(shí)施方案，經(jīng)由與選自下列各項(xiàng)的底物進(jìn)行的酶反應(yīng)或化學(xué)反應(yīng)發(fā)射通過化學(xué)發(fā)光檢測(cè)的信號(hào)：吖啶、腔腸素(coelenterazine)、二氧雜環(huán)丁烷或過氧草酸化合物，或它們的衍生物中的一種，并且特別是在出版物Dodeigne C.et al(2000)，Talanta 51，415-439，“作為診斷工具的化學(xué)發(fā)光.回顧(Chemiluminescence as diagnostic too/.A review)”中所述的化合物。

電子介體是，例如，3-(10’酚噻嗪基)丙烷1-磺酸鈉、對(duì)-碘苯酚、對(duì)-碘苯基硼酸、4-(吩噻嗪-10-基)丁烷-1-磺酸、或它們的組合。

氧化劑例如是過氧化物，例如過氧化氫，或過硼酸鈉。

在375nm至580nm包含的波長(zhǎng)，例如425nm，讀取從過氧物酶與魯米諾、異魯米諾和/或魯米諾或異魯米諾的衍生物的反應(yīng)所得的信號(hào)。

檢測(cè)到的信號(hào)優(yōu)選以RLU(相對(duì)光單位)表示。過氧物酶可以與檢測(cè)配體(例如被分析的專門檢測(cè)配體)或與間接檢測(cè)標(biāo)記物的報(bào)道物(如鏈霉抗生物素蛋白)偶聯(lián)。

通常，使用包含至少兩個(gè)溶液的試劑盒完成化學(xué)發(fā)光反應(yīng)。

第一溶液包含用于過氧物酶的底物，例如魯米諾、異魯米諾和/或魯米諾或異魯米諾的衍生物，和電子中介體；第二溶液包含氧化劑。作為實(shí)例，可以使用以下試劑盒：″Immun-star western C″(Bio-Rad，United States)，″ELISTAR ETA C Ultra ELISA″(Cyanagen，Italy)，″Supersignal West Pico″(Thermo Scientific，United States)，″Chemiluminescent Sensitive Plus HRP″(Surmodics，United States)。

用作對(duì)照的熒光團(tuán)

在一個(gè)有利的實(shí)施方案中，固體支持體的至少一個(gè)區(qū)劃的一個(gè)或多個(gè)斑點(diǎn)包含用作對(duì)照的熒光團(tuán)。

用作對(duì)照的熒光團(tuán)優(yōu)選不干擾或非常小地干擾對(duì)應(yīng)于被分析物的存在的信號(hào)，例如，由化學(xué)發(fā)光化合物發(fā)射的信號(hào)。

作為實(shí)例，當(dāng)對(duì)應(yīng)于被分析物的存在的信號(hào)是從魯米諾、異魯米諾和/或魯米諾或異魯米諾獲得的化學(xué)發(fā)光化合物時(shí)，用作對(duì)照的熒光團(tuán)優(yōu)選不發(fā)射425nm左右、尤其是400nm至550nm、優(yōu)選375nm至550nm、更優(yōu)選350nm至580nm的光。它可以例如發(fā)射僅在小于(或小于或等于)400nm、390nm、380nm、375nm、370nm、360nm或350nm的波長(zhǎng)或僅在大于(或大于或等于)550nm、560nm、570nm、580nm、590nm或600nm的波長(zhǎng)的光。

用作對(duì)照的熒光團(tuán)，例如，選自由以下各項(xiàng)組成的組：香豆素、若丹明、carbopyronine、噁嗪、苯并吡喃鎓、藻紅蛋白和它們的衍生物。所述熒光團(tuán)任選地偶聯(lián)到載體分子，例如蛋白質(zhì)如BSA。

用作對(duì)照的熒光團(tuán)，例如，選自由以下各項(xiàng)組成的組：香豆素、若丹明、carbopyronine、噁嗪、B-藻紅蛋白、苯并吡喃鎓的衍生物、和它們的衍生物。

一種用作對(duì)照的熒光團(tuán)優(yōu)選地選自由以下各項(xiàng)組成的組：carbopyronine、carbopyronine的衍生物、噁嗪、噁嗪衍生物、苯并吡喃鎓衍生物、和藻紅蛋白。

一種再更優(yōu)選的用于作為對(duì)照的熒光團(tuán)選自由以下各項(xiàng)組成的組：carbopyronine、苯并吡喃鎓衍生物、和藻紅蛋白。

備選地，一種優(yōu)選的用于作為對(duì)照的熒光團(tuán)可以選自由以下各項(xiàng)組成的組：carbopyronine衍生物、苯并吡喃鎓衍生物、和藻紅蛋白。

一種優(yōu)選的可以用在斑點(diǎn)中作為對(duì)照的熒光團(tuán)是例如包括以下基礎(chǔ)結(jié)構(gòu)的carbopyronine：

實(shí)例包括由Atto-Tec售賣的Atto 633carbopyronine和它的衍生物，尤其是Atto 633的胺衍生物。

優(yōu)選的可以在斑點(diǎn)中用作對(duì)照的熒光團(tuán)的另一個(gè)實(shí)例是由公司Dyomics以名稱“Dye 634”售賣的熒光團(tuán)(處于其偶聯(lián)到載體分子例如BSA的形式)，其式如下：

這是苯并吡喃鎓衍生物。

Dye 634熒光團(tuán)可以以其胺形式(Dye 634-胺)在斑點(diǎn)中用作對(duì)照。那時(shí)可以與載體分子且尤其是BSA偶聯(lián)地或不偶聯(lián)地使用它。

優(yōu)選的可以在斑點(diǎn)中用作對(duì)照的源自苯并吡喃鎓的熒光團(tuán)的還另一個(gè)實(shí)例是Dye 630的胺衍生物，Dye 630具有下式：

可以與載體分子且尤其是BSA偶聯(lián)地或不偶聯(lián)地使用Dye 630的胺衍生物。

吸收劑粒子

在此，“吸收劑粒子”指的是在完全或部分覆蓋人們尋求(部分地或完全地)減少的信號(hào)(即光干涉的起源的信號(hào))的發(fā)射波長(zhǎng)范圍的波長(zhǎng)范圍中的光的粒子。

當(dāng)在分析方法中使用發(fā)光化合物例如化學(xué)發(fā)光化合物檢測(cè)被分析物的存在時(shí)，根據(jù)本發(fā)明的吸收劑粒子優(yōu)選吸收在完全覆蓋所述發(fā)光化合物的發(fā)射波長(zhǎng)范圍的波長(zhǎng)范圍中的光。

典型地，對(duì)于使用過氧物酶在魯米諾、異魯米諾和/或魯米諾或異魯米諾的衍生物上的反應(yīng)的顯影體系來說，根據(jù)本發(fā)明的吸收劑粒子優(yōu)選吸收包含375nm至580nm的波長(zhǎng)范圍。

當(dāng)在分析方法中使用熒光團(tuán)以檢測(cè)試樣中被分析物的存在，并且任選地，量化試樣中的被分析物時(shí)，所用的吸收劑粒子使得可以檢測(cè)由所述熒光團(tuán)發(fā)射的信號(hào)。因此，所用的吸收劑粒子可以吸收在所述熒光團(tuán)的激發(fā)和/或發(fā)射波長(zhǎng)范圍內(nèi)所含的波長(zhǎng)的光的全部或部分，只要在所用的分析方法中由所述熒光團(tuán)發(fā)射的信號(hào)保持可檢測(cè)的和/或可量化的即可。此外，優(yōu)選地，吸收劑粒子不漫射對(duì)應(yīng)于所述熒光團(tuán)的激發(fā)和/或發(fā)射波長(zhǎng)范圍的光。

在一個(gè)特別的實(shí)施方案中，當(dāng)在分析方法中使用熒光團(tuán)以檢測(cè)試樣中被分析物的存在和/或量化試樣中的被分析物時(shí)，所用的吸收劑粒子不吸收在對(duì)應(yīng)于所述熒光團(tuán)的激發(fā)和/或發(fā)射波長(zhǎng)范圍的波長(zhǎng)范圍中的光，并且優(yōu)選不漫射對(duì)應(yīng)于所述熒光團(tuán)的激發(fā)和/或發(fā)射波長(zhǎng)范圍的光。

在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，由吸收劑粒子造成的潛在的漫射不妨礙孔的底部的信號(hào)水平的增加，尤其是吸收比它們漫射更多的光。吸收和漫射是可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的技術(shù)測(cè)量的。

在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，吸收劑粒子不發(fā)紅色熒光，即，當(dāng)它們被任何光激發(fā)時(shí)，尤其是在堿性介質(zhì)中時(shí)，它們不發(fā)射620至780nm包含的波長(zhǎng)處的光。

在一個(gè)特別的實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的吸收劑粒子不在657nm處吸收，尤其是不在620和780nm之間、在610和800nm之間，在600和900nm之間或在580和950nm之間吸收，并且它們自己不發(fā)熒光。

優(yōu)選地，在本發(fā)明的上下文中使用的吸收劑粒子不發(fā)熒光。

出人意料地，根據(jù)本發(fā)明的吸收劑粒子吸收在光干涉的源頭處的信號(hào)，而不干擾或很少干擾要檢測(cè)的信號(hào)，例如，不干擾或很少干擾作為局域地在斑點(diǎn)處由過氧物酶與魯米諾、異魯米諾和/或魯米諾或異魯米諾的衍生物的反應(yīng)的結(jié)果的化學(xué)發(fā)光化合物發(fā)射的光。

在此，表述“化合物X不干擾或很少干擾信號(hào)”意指在化合物X的存在下，信號(hào)的強(qiáng)度相對(duì)于在不存在所述化合物X的情況下測(cè)量的強(qiáng)度降低不大于20％、優(yōu)選不大于15％、再更優(yōu)選不大于10％。

此外，根據(jù)本發(fā)明的吸收劑粒子不導(dǎo)致與化學(xué)發(fā)光化合物的能量轉(zhuǎn)移，所述能量轉(zhuǎn)移如在熒光素的情況下可以被觀察到，所述熒光素可以進(jìn)入激活態(tài)并且發(fā)射比由過氧物酶與它的底物(例如，魯米諾、異魯米諾和/或魯米諾或異魯米諾的衍生物)的反應(yīng)產(chǎn)生的化學(xué)發(fā)光化合物的發(fā)射波長(zhǎng)更高的波長(zhǎng)。

吸收劑粒子優(yōu)選具有小于50μm，優(yōu)選小于40μm，例如小于30μm或小于20μm，更優(yōu)選小于10μm，更優(yōu)選小于6μm，更優(yōu)選小于2μm，更優(yōu)選小于1μm，再更優(yōu)選小于0.5μm的直徑。例如，吸收劑粒子具有小于0.45μm的直徑。

吸收劑粒子的平均直徑優(yōu)選被包含在0.005μm至50μm，0.005μm至40μm，0.005μm至30μm，0.005μm至20μm，0.005μm至10μm，0.005μm至6μm，0.01μm至2μm，優(yōu)選0.01μm至1μm，更優(yōu)選0.05μm至0.5μm，再更優(yōu)選0.05μm至0.1μm。吸收劑粒子的平均直徑為例如0.050μm或0.070μm。

表述“粒子的直徑”和“粒子的大小”在此是同義的。

可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的任何適當(dāng)?shù)姆椒y(cè)量吸收劑粒子的直徑，例如，使用粒子分析儀，例如Nanotrac NPA150型的粒子分析儀。

在此，“平均直徑”指的是吸收劑粒子的直徑的平均值，每個(gè)直徑由與考慮的吸收劑粒子具有相同體積的等效球的直徑來定義。

在一個(gè)有利的實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的吸收劑粒子還使得可以檢測(cè)由熒光團(tuán)發(fā)射的信號(hào)，所述熒光團(tuán)作為對(duì)照存在于一個(gè)或多個(gè)斑點(diǎn)中。例如使用如在下文的“用于選擇還允許在作為對(duì)照的一個(gè)或多個(gè)斑點(diǎn)的存在下檢測(cè)由熒光團(tuán)發(fā)射的信號(hào)的吸收劑粒子的方法”的段落中限定的吸收劑粒子選擇方法獲得或能夠獲得這樣的吸收劑粒子。

在例如由碳粒子和彩色粒子組成的組中選擇根據(jù)本發(fā)明的吸收劑粒子。

根據(jù)本發(fā)明的吸收劑粒子可以由不同的(至少兩種)粒子類型(或組)的混合物組成，所述粒子類型由它們的吸收光譜和/或它們的平均直徑區(qū)分。

因此，可以例如以彩色粒子的混合物(優(yōu)選不同的彩色粒子的混合物)的形式供給彩色粒子，所述彩色粒子的混合物的吸收光譜優(yōu)選完全與對(duì)應(yīng)于要被檢測(cè)的被分析物的信號(hào)(例如魯米諾、異魯米諾和/或它們的衍生物之一的信號(hào))的發(fā)射波長(zhǎng)范圍交疊?？梢詫煞N或多于兩種(例如，三種)不同顏色的粒子類型混合。

優(yōu)選地，在彩色粒子的混合物中使用的彩色粒子不包含黑色粒子。

根據(jù)本發(fā)明的吸收劑粒子是例如黃色粒子和品紅色粒子的混合物。

可以選擇以混合物的形式提供的粒子，使得所述混合物吸收全部可見光。

碳粒子優(yōu)選為炭黑粒子。

炭黑是碳的無定形和單質(zhì)形式。

黃色粒子是例如以包含丁酰胺、2-[2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)二氮烯基]-N-(2-甲氧基苯基)-3-氧代-、單(4-磺基苯基)的衍生物和鈉鹽的組合物的形式供給的。

品紅色粒子是例如以包含水、苯磺酸、(5，7，12，14-四氫-2，9-二甲基-7，14-二氧代喹啉并[2，3-b]吖啶基)和鈉鹽的組合物的形式供給的。

品紅色粒子和黃色粒子的混合物例如包含1∶1重量比的黃色和品紅色粒子。

因此，出人意料地，根據(jù)本發(fā)明的吸收劑粒子使得可以部分地或完全地減少來自化學(xué)發(fā)光化合物的光干涉，而不干擾或很少干擾通過化學(xué)發(fā)光的要檢測(cè)的信號(hào)，和如果可用，由作為對(duì)照在斑點(diǎn)處存在的熒光團(tuán)發(fā)射的熒光。

有利地，根據(jù)本發(fā)明的吸收劑粒子的存在對(duì)于肉眼是可見的(尤其表現(xiàn)為碟形，具有比固體支持體的材料更深或更淺的均勻的亮度)，這因此使得可以對(duì)吸收劑粒子在固體支持體的區(qū)劃的一個(gè)或多個(gè)斑點(diǎn)的存在下的安放進(jìn)行對(duì)照，并且，當(dāng)將所述吸收劑粒子以吸收劑組合物的形式添加時(shí)，對(duì)在所述吸收劑組合物中包含的任何化合物在固體支持體的區(qū)劃的一個(gè)或多個(gè)斑點(diǎn)的存在下的安放進(jìn)行對(duì)照。

本領(lǐng)域技術(shù)人員可以容易地確定在多重分析方法中在斑點(diǎn)上要用于獲得想要的改進(jìn)的信號(hào)檢測(cè)的吸收劑粒子的最佳量，例如，通過試驗(yàn)所述吸收劑粒子的若干濃度。

在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，吸收劑粒子是碳粒子，尤其是炭黑粒子。

在本發(fā)明的上下文中使用的碳粒子優(yōu)選具有小于50μm，優(yōu)選小于40μm，小于30μm或小于20μm，更優(yōu)選小于10μm或小于6μm的直徑。根據(jù)一個(gè)特別的實(shí)施方案，所述碳粒子具有小于2μm，優(yōu)選小于1μm，更優(yōu)選小于0.5μm的直徑。例如，在本發(fā)明的上下文中使用的碳粒子具有小于0.45μm的直徑。

在本發(fā)明的上下文中使用的碳粒子的平均直徑優(yōu)選被包含在0.005μm至50μm，0.005μm至40μm，0.005μm至30μm，0.005μm至20μm，0.005μm至10μm或0.005μm至6μm。根據(jù)一個(gè)特別的實(shí)施方案，所述碳粒子的平均直徑被包含在0.005μm至2μm，優(yōu)選0.01μm至1μm，更優(yōu)選0.05μm至0.5μm，再更優(yōu)選0.05μm至0.1μm。碳粒子的平均直徑是例如0.05μm或0.07μm。

可以使用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的任何方法獲得碳粒子，例如，如在文獻(xiàn)US 7,655,209或EP 0,481,034中所述的。

在一個(gè)有利的實(shí)施方案中，官能團(tuán)附接到碳粒子的表面。這些官能團(tuán)例如使得可以獲得穩(wěn)定且均勻的分散，而不使用聚合物或表面活性劑。能夠使用的官能團(tuán)是例如在文獻(xiàn)EP 0,481,034中描述的那些。

用于選擇還允許在作為對(duì)照的一個(gè)或多個(gè)斑點(diǎn)的存在下檢測(cè)由熒光團(tuán)發(fā)射的信號(hào)的吸收劑粒子的方法

本發(fā)明也涉及一種用于選擇還允許檢測(cè)由在固體支持體的一個(gè)或多個(gè)斑點(diǎn)中存在的熒光團(tuán)發(fā)射的信號(hào)的吸收劑粒子的方法，所述方法包括以下步驟：

a)與固體支持體的區(qū)劃的一個(gè)或多個(gè)斑點(diǎn)接觸地安放包含待測(cè)試的吸收劑粒子或待測(cè)試的吸收劑粒子的混合物的液相，所述區(qū)劃的斑點(diǎn)中的至少一個(gè)包含熒光團(tuán)，

b)在包含所述待測(cè)試的吸收劑粒子或所述待測(cè)試的吸收劑粒子的混合物的所述液相的存在下，檢測(cè)由所述熒光團(tuán)發(fā)射的信號(hào)，以及，

c)選擇吸收劑粒子或吸收劑粒子的混合物，在所述吸收劑粒子或吸收劑粒子的混合物的存在下在步驟b)中檢測(cè)的信號(hào)使得可以將包含所述熒光團(tuán)的一個(gè)或多個(gè)斑點(diǎn)定域化(localize)。

待測(cè)試的或被包含在待測(cè)試的混合物中的吸收劑粒子是這樣的粒子：其吸收在與人們尋求減少(部分地或全部地)的信號(hào)即在光干涉的源頭處的信號(hào)的發(fā)射波長(zhǎng)范圍部分或完全交疊的波長(zhǎng)范圍中的光。

對(duì)于待測(cè)試的吸收劑粒子中的每一種或待測(cè)試的吸收劑粒子的混合物中的每一種進(jìn)行步驟a)。

在步驟a)中，可以將待測(cè)試的吸收劑粒子或待測(cè)試的吸收劑粒子的混合物添加在若干個(gè)區(qū)劃中，例如，以不同的濃度，以測(cè)試所述吸收劑粒子的不同濃度或所述吸收劑粒子的混合物的不同濃度。

對(duì)于待測(cè)試的吸收劑粒子的每種或待測(cè)試的吸收劑粒子的不同混合物的每種，使用不同的區(qū)劃。

具有吸收劑粒子的基本組分(base)的吸收劑組合物

在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，以吸收劑組合物的形式供給如上在“吸收劑粒子”段落中定義的吸收劑粒子。

本發(fā)明因此也涉及吸收劑組合物，其包含如上定義的使得可以改進(jìn)(并因此確保)在斑點(diǎn)上的多重分析方法的信號(hào)的檢測(cè)的吸收劑粒子。

在此，根據(jù)本發(fā)明的包含吸收劑粒子的吸收劑組合物稱為分散體。

“分散體”是指固體粒子在液體中的混合物，所述固體粒子具有被包含在0.005μm至50μm，0.005μm至40μm，0.005μm至30μm，0.005μm至20μm，0.005μm至10μm，0.005μm至6μm，0.01μm至2μm，優(yōu)選0.01μm至1μm的平均直徑。

根據(jù)本發(fā)明的吸收劑組合物可以包含1％至80％的吸收劑粒子，優(yōu)選2％至60％的吸收劑粒子，更優(yōu)選5％至50％的吸收劑粒子，更優(yōu)選7％至40％的吸收劑粒子，再更優(yōu)選10％至30％的吸收劑粒子，百分比由吸收劑組合物總重量中的重量表示。例如，吸收劑組合物可以包含10％至20％的吸收劑粒子，更優(yōu)選12％至18％的吸收劑粒子，百分比由吸收劑組合物總重量中的重量表示。例如，吸收劑組合物包含15％的吸收劑粒子，百分比由吸收劑組合物總重量中的重量表示。

在一個(gè)有利的實(shí)施方案中，吸收劑組合物包含吸收劑粒子和至少一種選自由以下各項(xiàng)組成的組的化合物：載體、粘合劑和添加劑。

在吸收劑組合物中使用的載體可以是溶劑，例如水。

在吸收劑組合物中使用的溶劑可以例如是，甲基乙基酮(MEK)、乙酸酯、二醇醚、醇或它們的組合。

粘合劑尤其使得可以調(diào)節(jié)吸收劑組合物的粘度。

粘合劑的實(shí)例是酚醛樹脂和/或共聚物。

添加劑是例如殺生物劑和/或抗泡劑。

一種優(yōu)選的根據(jù)本發(fā)明的吸收劑組合物包含以下各項(xiàng)或由以下各項(xiàng)組成：吸收劑粒子、水、任選地鈉鹽和任選地殺生物劑，所述吸收劑粒子能夠與一種或若干種官能團(tuán)偶聯(lián)。一種再更優(yōu)選的根據(jù)本發(fā)明的吸收劑組合物包含以下各項(xiàng)或由以下各項(xiàng)組成：碳粒子(優(yōu)選炭黑粒子)、水、任選地鈉鹽和任選地殺生物劑，所述碳粒子能夠偶聯(lián)到一種或若干種官能團(tuán)，例如4-羧基苯基-、羥基-和/或4-磺基苯基-基團(tuán)。

有利地，吸收劑粒子在吸收劑組合物中很少沉降，從而具有隨時(shí)間保持穩(wěn)定的粒子的均勻的分散體，而不需混合所述組合物。

吸收劑組合物優(yōu)選具有比較低的粘度，使得它可以容易地被吸液。

吸收劑組合物優(yōu)選具有被包含在0.5cP至3cP，更優(yōu)選1cP至2.5cP的粘度。吸收劑組合物例如具有2.1cP的粘度。

粘度可以經(jīng)由本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的任何適當(dāng)?shù)姆椒y(cè)量，例如，使用旋轉(zhuǎn)粘度計(jì)，例如Brookfield型的。

吸收劑組合物的pH優(yōu)選被包含在7至12，優(yōu)選8至10，例如9.7。

表面張力優(yōu)選被包含在60達(dá)因/cm至80達(dá)因/cm，優(yōu)選65達(dá)因/cm至75達(dá)因/cm，例如70達(dá)因/cm。

表面張力可以經(jīng)由本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的任何適當(dāng)?shù)姆椒y(cè)量，例如，使用Kruss型的張力儀。

在一種有利的實(shí)施方案中，吸收劑組合物不包含聚合物或表面活性劑。

吸收劑組合物可以包含以下各項(xiàng)或由以下各項(xiàng)組成：Cabot(美國(guó))的352K產(chǎn)品、400產(chǎn)品、200產(chǎn)品，Solution Dispersions(美國(guó))的5109產(chǎn)品、6152產(chǎn)品、6353產(chǎn)品或它們的組合。

吸收劑組合物也可以包含以下各項(xiàng)或由以下各項(xiàng)組成：以Cabot(美國(guó))的270產(chǎn)品的形式供給的黃色吸收劑粒子和以Cabot(美國(guó))的260M產(chǎn)品的形式供給的品紅色吸收劑粒子。

吸收劑組合物可以包含上述特征中的一項(xiàng)、或若干項(xiàng)、或全部。

一種優(yōu)選的根據(jù)本發(fā)明的吸收劑組合物具有以下特征中的至少一項(xiàng)，優(yōu)選以下特征中的至少兩項(xiàng)、至少三項(xiàng)或至少四項(xiàng)，例如至少五項(xiàng)、至少六項(xiàng)，或全部：

-它包含直徑小于0.5μm，例如小于0.45μm的吸收劑粒子，

-它包含平均直徑被包含在0.06μm至0.1μm，例如平均直徑為0.070μm的吸收劑粒子，

-它包含在其表面上附接官能團(tuán)的吸收劑粒子，

-它包含12％至18％的吸收劑粒子，例如15％的吸收劑粒子，百分比由吸收劑組合物總重量中的重量表示。

-它具有被包含在65達(dá)因/cm至75達(dá)因/cm，例如70達(dá)因/cm的表面張力，

-它具有被包含在8至10，例如9.5的pH，和/或

-它具有被包含在1cP至2.5cP的粘度，例如2.1cP的粘度。

根據(jù)本發(fā)明的吸收劑組合物也可以在使用前被稀釋，尤其是在水或任何其他與所用的信號(hào)的檢測(cè)相容并且尤其是與導(dǎo)致發(fā)光化合物的產(chǎn)生的酶促反應(yīng)相容的溶劑(例如在本申請(qǐng)中描述的溶劑)中。例如，根據(jù)本發(fā)明的吸收劑組合物可以被稀釋10至2000倍，優(yōu)選100至1000倍，例如100倍，200倍，500倍或1000倍。

吸收劑組合物也可以包含以下物質(zhì)或由以下物質(zhì)組成：如上所述的黃色粒子和品紅色粒子的混合物。

有利地，吸收劑組合物包含吸收劑粒子和至少一種涉及發(fā)光化合物尤其是化學(xué)發(fā)光化合物的產(chǎn)生的化合物。

一種優(yōu)選的根據(jù)本發(fā)明的吸收劑組合物因此包含以下各項(xiàng)或由以下各項(xiàng)組成：吸收劑粒子、至少一種涉及化學(xué)發(fā)光化合物的產(chǎn)生的化合物、水、任選地鈉鹽和任選地殺生物劑，所述吸收劑粒子可以偶聯(lián)到一種或若干種官能團(tuán)。一種再更優(yōu)選的根據(jù)本發(fā)明的吸收劑組合物包含以下各項(xiàng)或由以下各項(xiàng)組成：碳粒子(優(yōu)選炭黑粒子)、至少一種涉及化學(xué)發(fā)光化合物的產(chǎn)生的化合物、水、任選地鈉鹽和任選地殺生物劑，所述碳粒子能夠偶聯(lián)到一種或若干種官能團(tuán)，例如4-羧基苯基-、羥基-和/或4-磺基苯基-基團(tuán)。

出人意料地，這樣的具有吸收劑粒子的基本組分和至少一種涉及化學(xué)發(fā)光化合物的產(chǎn)生的化合物的組合物是隨時(shí)間穩(wěn)定的。

表述“隨時(shí)間穩(wěn)定的”意指：在相同的分析方法的實(shí)施期間，在D0上使用吸收劑組合物檢測(cè)的信號(hào)與在將所述吸收劑組合物在4℃和/或37℃保存至少一個(gè)月、優(yōu)選在4℃至少3個(gè)月、例如在4℃3個(gè)月、6個(gè)月、一年或兩年之后使用所述吸收劑組合物檢測(cè)的信號(hào)基本上是同樣的。

表述“基本上是同樣的”意指：檢測(cè)的信號(hào)變化不大于40％，優(yōu)選不大于30％，更優(yōu)選不大于20％。

因此，吸收劑組合物可以與在分析方法的上下文中使用的、尤其是在一個(gè)或多個(gè)顯影步驟期間使用的一種或若干種組合物和/或一種或若干種化合物混合。

在一種有利的實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的吸收劑組合物還包含至少一種選自由以下各項(xiàng)組成的組的化合物：魯米諾、異魯米諾、魯米諾或異魯米諾的衍生物、電子介體和氧化劑。

魯米諾、異魯米諾、魯米諾或異魯米諾的衍生物、過氧物酶、電子介體和氧化劑尤其是如上文定義的。

一種優(yōu)選的吸收劑組合物包含吸收劑粒子例如碳的粒子、至少一種選自魯米諾、異魯米諾、魯米諾或異魯米諾的衍生物中的化合物、和任選地電子介體。

另一種優(yōu)選的吸收劑組合物包含吸收劑粒子例如碳的粒子、和至少一種氧化劑如過氧化物。

根據(jù)本發(fā)明的吸收劑組合物有利地包含至少一種溶劑。

在吸收劑組合物中使用的溶劑優(yōu)選與導(dǎo)致發(fā)光化合物的產(chǎn)生的酶促反應(yīng)(如過氧物酶與魯米諾、異魯米諾和/或魯米諾或異魯米諾的衍生物的反應(yīng))相容。

一種優(yōu)選的能夠在吸收劑組合物中使用的溶劑是水。

優(yōu)選的吸收劑組合物的另一個(gè)實(shí)例包含吸收劑粒子例如碳的粒子，并且不包含魯米諾、異魯米諾、魯米諾或異魯米諾的衍生物、電子介體或氧化劑。例如，這樣的吸收劑組合物包含以下各項(xiàng)或由以下各項(xiàng)組成：碳粒子和溶劑例如水。

用于在一個(gè)或多個(gè)斑點(diǎn)上實(shí)施分析方法的試劑盒

本發(fā)明也涉及用于實(shí)施分析方法(尤其是使用包含至少一個(gè)斑點(diǎn)的固體支持體的分析方法)的試劑盒，所述試劑盒包括至少兩種組合物：

-第一組合物，所述第一組合物包含至少一種選自由以下各項(xiàng)組成的組的化合物：魯米諾、異魯米諾、和魯米諾或異魯米諾的衍生物，且任選地包含至少一種電子介體，

-第二組合物，所述第二組合物包含至少一種選自由以下各項(xiàng)組成的組的化合物：氧化劑和電子介體，所述第二組合物優(yōu)選包含至少一種氧化劑，和任選地至少一種電子介體，

其特征在于第一組合物和/或第二組合物包含吸收劑粒子，和/或所述試劑盒包含含有吸收劑粒子的第三組合物。

吸收劑粒子和固體支持體尤其是如上文定義的。

本發(fā)明尤其涉及用于實(shí)施分析方法(尤其是使用包含至少一個(gè)斑點(diǎn)的固體支持體的分析方法)的試劑盒，所述試劑盒包含：

-第一吸收劑組合物，所述第一吸收劑組合物包含吸收劑粒子和至少一種選自由以下各項(xiàng)組成的組的化合物：魯米諾、異魯米諾、和魯米諾或異魯米諾的衍生物，且任選地包含至少一種電子介體，和

-第二組合物，所述第二組合物包含至少一種選自由以下各項(xiàng)組成的組的化合物：氧化劑和電子介體，所述第二組合物優(yōu)選包含至少一種氧化劑，和任選地至少一種電子介體。

本發(fā)明尤其涉及用于實(shí)施分析方法(尤其是使用包含至少一個(gè)斑點(diǎn)的固體支持體的分析方法)的試劑盒，所述試劑盒包含：

-第一組合物，所述第一組合物包含至少一種選自由以下各項(xiàng)組成的組的化合物：魯米諾、異魯米諾、和魯米諾或異魯米諾的衍生物，且任選地包含至少一種電子介體，和

-第二吸收劑組合物，所述第二吸收劑組合物包含吸收劑粒子和至少一種選自由以下各項(xiàng)組成的組的化合物：氧化劑和電子介體，所述第二吸收劑組合物優(yōu)選包含至少一種氧化劑，和任選地至少一種電子介體。

本發(fā)明尤其涉及用于實(shí)施分析方法(尤其是使用包含至少一個(gè)斑點(diǎn)的固體支持體的分析方法)的試劑盒，所述試劑盒包含：

-第一組合物，所述第一組合物包含至少一種選自由以下各項(xiàng)組成的組的化合物：魯米諾、異魯米諾、和魯米諾或異魯米諾的衍生物，且任選地包含至少一種電子介體，

-第二組合物，所述第二組合物包含至少一種選自由以下各項(xiàng)組成的組的化合物：氧化劑和電子介體，所述第二組合物優(yōu)選包含至少一種氧化劑，和任選地至少一種電子介體，和

-第三吸收劑組合物，所述第三吸收劑組合物包含吸收劑粒子。分析方法有利地是多重分析方法。

信號(hào)的檢測(cè)的改進(jìn)

如上定義的吸收劑粒子的用途或如上定義的包含它們的吸收劑組合物的使用時(shí)的可以改進(jìn)(并因此確保)在一個(gè)或多個(gè)斑點(diǎn)上的分析方法(優(yōu)選在斑點(diǎn)上的多重分析方法)中的信號(hào)的檢測(cè)，尤其是當(dāng)在液相的存在下進(jìn)行信號(hào)的檢測(cè)時(shí)。

“改進(jìn)信號(hào)的檢測(cè)”尤其意指減少背景噪聲，且更具體地意指：在吸收劑粒子或包含它們的吸收劑組合物的存在下，相對(duì)于在它們不存在的情況下獲得的“被檢測(cè)的信號(hào)/背景噪聲”比率，改進(jìn)“被檢測(cè)的信號(hào)/背景噪聲”比率。

用于評(píng)估“被檢測(cè)的信號(hào)/背景噪聲”比率的改進(jìn)的“被檢測(cè)的信號(hào)”是例如：在待檢測(cè)的被分析物在試樣中的存在下在給定斑點(diǎn)處(即，所述斑點(diǎn)所在的位置上)測(cè)量的或在已知量的待分析的被分析物的存在下在給定斑點(diǎn)處(即，所述斑點(diǎn)所在的位置上)測(cè)量的信號(hào)的強(qiáng)度。

優(yōu)選地，用于評(píng)估“被檢測(cè)的信號(hào)/背景噪聲”比率的改進(jìn)的“被檢測(cè)的信號(hào)”是：在當(dāng)不存在吸收劑粒子時(shí)被分析物以引起光干涉(如光弧和/或?qū)\生斑點(diǎn)和/或光網(wǎng))的量存在的情況下在給定斑點(diǎn)處(即，所述斑點(diǎn)所在的位置上)測(cè)量的信號(hào)的強(qiáng)度。

在斑點(diǎn)處測(cè)量的信號(hào)的強(qiáng)度通常以RLU(相對(duì)光單位)表示。

本領(lǐng)域技術(shù)人員知道如何基于所用的一種或多種檢測(cè)標(biāo)記物在斑點(diǎn)處(即，所述斑點(diǎn)所在的位置上)檢測(cè)信號(hào)，尤其是使用照相機(jī)，其有利地位于固體支持體下方。

“背景噪聲”是在不包含斑點(diǎn)的固體支持體的區(qū)劃的背景的區(qū)域處測(cè)量的光強(qiáng)度。

背景噪聲強(qiáng)度通常以RLU(相對(duì)光單位)表示。

當(dāng)“被檢測(cè)的信號(hào)/背景噪聲”比率增加(例如通過增加被檢測(cè)的信號(hào)和減少背景噪聲，或通過減少被檢測(cè)的信號(hào)并進(jìn)一步減少背景噪聲)時(shí)，在“被檢測(cè)的信號(hào)/背景噪聲”比率上存在改進(jìn)。

根據(jù)本發(fā)明的吸收劑粒子的使用使得：在吸收劑粒子的存在下相比于不存在吸收劑粒子，優(yōu)選將“被檢測(cè)的信號(hào)/背景噪聲”比率增加至少5％，優(yōu)選至少10％，更優(yōu)選至少15％，更優(yōu)選至少20％，再更優(yōu)選至少25％，例如至少30％，或至少40％。

本發(fā)明特別適合用于基于化學(xué)發(fā)光顯影的在一個(gè)或多個(gè)斑點(diǎn)上的分析方法，尤其是在斑點(diǎn)上的多重分析方法。事實(shí)上，對(duì)于通過化學(xué)發(fā)光發(fā)射的信號(hào)來說，為了允許通過將信號(hào)放大檢測(cè)捕捉配體-被分析物-檢測(cè)配體相互作用，對(duì)于酶促反應(yīng)來說必須在信號(hào)的檢測(cè)期間持續(xù)，并且因此對(duì)于酶的底物來說，在檢測(cè)信號(hào)的時(shí)候要存在于斑點(diǎn)處的液相中。

在本發(fā)明的上下文中，吸收劑粒子，例如以吸收劑組合物的形式供給的吸收劑粒子，必須在檢測(cè)信號(hào)時(shí)存在。

可以在加入對(duì)于化學(xué)發(fā)光反應(yīng)來說必須的化合物中的一種或若干種之前、之時(shí)或之后，加入吸收劑粒子。在所有情況下，吸收劑粒子在獲得信號(hào)的時(shí)候必須存在。

對(duì)于化學(xué)發(fā)光反應(yīng)來說必須的化合物通常是酶(例如，過氧物酶)，酶的底物(例如，魯米諾、異魯米諾和/或魯米諾或異魯米諾的衍生物)，任選地至少一種其他化合物如氧化劑(例如，過氧化物)和/或電子介體(例如，3-(10’吩噻嗪)丙烷1-磺酸鈉)。

用于改進(jìn)信號(hào)的檢測(cè)的方法

本發(fā)明特別涉及使得可以改進(jìn)(并因此確保)對(duì)應(yīng)于被分析物的存在的信號(hào)的檢測(cè)的分析方法，尤其是多重分析方法，所述方法包括以下步驟或由以下步驟組成：

a)提供固體支持體，所述固體支持體包含至少一個(gè)區(qū)劃，所述區(qū)劃包含用于檢測(cè)被分析物的至少一個(gè)斑點(diǎn)，

b)在所述區(qū)劃的一個(gè)或多個(gè)斑點(diǎn)的存在下安放待分析的試樣，

c)在所述區(qū)劃的所述一個(gè)或多個(gè)斑點(diǎn)的存在下安放被分析物的至少一種檢測(cè)配體，所述被分析物的檢測(cè)配體與直接或間接檢測(cè)標(biāo)記物偶聯(lián)，

d)當(dāng)所述檢測(cè)標(biāo)記物是間接檢測(cè)標(biāo)記物時(shí)，在所述區(qū)劃的所述一個(gè)或多個(gè)斑點(diǎn)的存在下安放與所述檢測(cè)配體偶聯(lián)的所述間接檢測(cè)標(biāo)記物的報(bào)道物，

e)當(dāng)在步驟d)中使用的報(bào)道物與間接標(biāo)記物偶聯(lián)時(shí)，在所述區(qū)劃的一個(gè)或多個(gè)斑點(diǎn)的存在下安放與所述報(bào)道物偶聯(lián)的所述間接檢測(cè)標(biāo)記物的報(bào)道物，

f)在所述區(qū)劃的所述一個(gè)或多個(gè)斑點(diǎn)的存在下安放吸收劑粒子，所述吸收劑粒子被包含在與所述區(qū)劃的所述一個(gè)或多個(gè)斑點(diǎn)接觸的液相中，以及

g)在包含所述吸收劑粒子的所述液相的存在下，檢測(cè)在所述區(qū)劃的所述一個(gè)或多個(gè)斑點(diǎn)處對(duì)應(yīng)于被分析物的存在的信號(hào)。

根據(jù)本發(fā)明的方法優(yōu)選首先包括步驟a)；隨后步驟b)和c)，其可以按此順序完成，或步驟c)在步驟b)之前，或步驟b)和c)同時(shí)；隨后步驟d)；隨后步驟e)和f)，其可以按此順序完成，或步驟f)在步驟e)之前，或步驟e)和f)同時(shí)；隨后步驟g)。

在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，步驟f)與步驟e)同時(shí)進(jìn)行。

在步驟f)和步驟g)之間(無論步驟e)在步驟f)之前、之后或同時(shí)完成)不進(jìn)行洗滌步驟，使得在檢測(cè)信號(hào)的時(shí)候吸收劑粒子存在。

當(dāng)步驟c)在步驟b)之前完成時(shí)，在步驟c)和b)之間沒有洗滌步驟。

表述“在區(qū)劃的一個(gè)或若干個(gè)斑點(diǎn)的存在下安放化合物X”尤其意指：將化合物X加入到包含所述一個(gè)或多個(gè)斑點(diǎn)的區(qū)劃中，所述區(qū)劃優(yōu)選意在分析試樣，且所述化合物X優(yōu)選以包含它的組合物如溶液、分散體或懸浮液的形式被供給。

當(dāng)在區(qū)劃的一個(gè)或多個(gè)斑點(diǎn)的存在下在同一步驟期間和/或當(dāng)同時(shí)進(jìn)行步驟b)到f)中的至少兩個(gè)時(shí)要安放至少兩種化合物時(shí)，可以單獨(dú)地在所述一個(gè)或多個(gè)斑點(diǎn)的存在下安放所述化合物，即，以單獨(dú)的組合物的形式(尤其是以單獨(dú)的溶液、分散體或懸浮液的形式)供給所述化合物；備選地，可以在區(qū)劃的一個(gè)或多個(gè)斑點(diǎn)的存在下以一種或若干種混合物的形式安放所述化合物或化合物中的一些。

在至少一個(gè)區(qū)劃的斑點(diǎn)的存在下安放不同的化合物達(dá)一定的時(shí)間長(zhǎng)度，例如1秒至2小時(shí)，優(yōu)選1分鐘至1小時(shí)，更優(yōu)選5分鐘至50分鐘，再更優(yōu)選10分鐘至40分鐘。

本領(lǐng)域技術(shù)人員知道如何確定對(duì)于每個(gè)溫育步驟來說適當(dāng)?shù)臏囟?。溫育的溫度可以例如?℃，被包含在19℃至24℃、37℃或40℃的溫度。

在步驟b)、c)、d)和e)期間施用的不同的組分是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的。它們例如使得可以形成抗原-抗體配合物和標(biāo)記物-報(bào)道物配合物。

方法還包括一個(gè)或若干個(gè)洗滌步驟，所述洗滌步驟使得可以消除未結(jié)合到斑點(diǎn)的的化合物或結(jié)合到各種直接或間接結(jié)合到斑點(diǎn)的化合物的化合物。

典型地，洗滌步驟由至少一個(gè)用于在每個(gè)所用的區(qū)劃中分配(例如，400μl的體積)洗滌和吸出洗滌溶液的循環(huán)組成，優(yōu)選至少兩個(gè)循環(huán)，更優(yōu)選3至6個(gè)循環(huán)。

對(duì)于每個(gè)包含至少一個(gè)意在檢測(cè)被分析物的斑點(diǎn)的固體支持體的在其中分析試樣的區(qū)劃，尤其進(jìn)行步驟b)至g)。

步驟a)包括提供包含至少一個(gè)區(qū)劃的固體支持體，所述區(qū)劃包含至少一個(gè)用于檢測(cè)被分析物的斑點(diǎn)，優(yōu)選至少兩個(gè)用于檢測(cè)被分析物的斑點(diǎn)。

步驟a)尤其意指使用所述固體支持體實(shí)施分析方法，即使用所述固體支持體。

固體支持體尤其是如在上文在“固體支持體”段落中定義的。

在一種有利的實(shí)施方案中，固體支持體包含至少一個(gè)區(qū)劃，所述區(qū)劃中至少一個(gè)斑點(diǎn)包含作為用于一個(gè)或多個(gè)斑點(diǎn)的對(duì)照的熒光團(tuán)；優(yōu)選地，固體支持體包含至少一個(gè)區(qū)劃，所述區(qū)劃中斑點(diǎn)包含作為用于斑點(diǎn)的對(duì)照的熒光團(tuán)。

在步驟b)中，在固體支持體的區(qū)劃的一個(gè)或多個(gè)斑點(diǎn)的存在下安放待分析的試樣。

待分析的試樣和要被檢測(cè)的一種或多種被分析物尤其是如在上文在“試樣”和“被分析物”段落中定義的。

在步驟c)中，在所述區(qū)劃的所述一個(gè)或多個(gè)斑點(diǎn)的存在下安放被分析物的至少一種檢測(cè)配體，所述被分析物的檢測(cè)配體與直接或間接檢測(cè)標(biāo)記物偶聯(lián)。

被分析物的檢測(cè)配體尤其是如上文定義的。

在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，被分析物的檢測(cè)配體與間接檢測(cè)標(biāo)記物偶聯(lián)，所述間接檢測(cè)標(biāo)記物優(yōu)選選自由以下各項(xiàng)組成的組：生物素、抗生物素蛋白、鏈霉抗生物素蛋白和中性抗生物素蛋白。

當(dāng)檢測(cè)標(biāo)記物是間接檢測(cè)標(biāo)記物時(shí)，方法包括步驟d)，該步驟包括以下內(nèi)容或由以下內(nèi)容組成：在所述區(qū)劃的一個(gè)或多個(gè)斑點(diǎn)的存在下安放與所述檢測(cè)配體偶聯(lián)的間接檢測(cè)標(biāo)記物的報(bào)道物(也稱作第一報(bào)道物)，所述報(bào)道物隨后與直接或間接標(biāo)記物偶聯(lián)，優(yōu)選與間接標(biāo)記物偶聯(lián)。

在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，與被分析物的檢測(cè)配體偶聯(lián)的間接檢測(cè)標(biāo)記物的報(bào)道物選自由以下各項(xiàng)組成的組：生物素、抗生物素蛋白、鏈霉抗生物素蛋白和中性抗生物素蛋白。

例如，被分析物的檢測(cè)配體偶聯(lián)到生物素，且生物素的報(bào)道物是偶聯(lián)到直接或間接檢測(cè)標(biāo)記物(優(yōu)選間接檢測(cè)標(biāo)記物)的鏈霉抗生物素蛋白。

當(dāng)在步驟d)中使用的報(bào)道物(即，第一報(bào)道物)與間接標(biāo)記物偶聯(lián)時(shí)，方法還包括步驟e)，該步驟包括在所述區(qū)劃的一個(gè)或多個(gè)斑點(diǎn)的存在下安置與所述報(bào)道物偶聯(lián)的所述間接檢測(cè)標(biāo)記物的報(bào)道物(即，第二報(bào)道物)。

例如，被分析物的檢測(cè)配體與生物素偶聯(lián)，且生物素的報(bào)道物是與到酶偶聯(lián)的鏈霉抗生物素蛋白。那么酶的報(bào)道物(即，第二報(bào)道物)是所述酶的底物。

在步驟f)中，在所述區(qū)劃的一個(gè)或多個(gè)斑點(diǎn)的存在下安放吸收劑粒子。

吸收劑粒子尤其是如上文在“吸收劑粒子”段落中定義的。

尤其是，吸收劑粒子優(yōu)選為碳粒子，例如炭黑的粒子，或彩色粒子的混合物，例如黃色彩色粒子和品紅色彩色粒子的混合物。

吸收劑粒子可以以如上文在“吸收劑組合物″”段落中定義的吸收劑組合物的形式被供給。

在一種有利的實(shí)施方案中，以包含選自由以下各項(xiàng)組成的組的至少一種化合物的吸收劑組合物的形式供給吸收劑粒子：魯米諾、異魯米諾、魯米諾或異魯米諾的衍生物、電子介體和氧化劑。

當(dāng)吸收劑組合物還包含選自由以下各項(xiàng)組成的組的至少一種化合物時(shí)，步驟e)和f)因此同時(shí)進(jìn)行：魯米諾、異魯米諾、魯米諾或異魯米諾的衍生物、電子介體和氧化劑。

在步驟f)結(jié)束時(shí)，吸收劑粒子被包含在與所述區(qū)劃的一個(gè)或多個(gè)斑點(diǎn)接觸的液相中。

在此，“與所述區(qū)劃的一個(gè)或多個(gè)斑點(diǎn)接觸的液相”意指液體組合物存在于所述區(qū)劃中，所述組合物例如能夠是溶液、分散體或懸浮液。

在步驟f)中的液相可以包含以下物質(zhì)或由以下物質(zhì)組成：根據(jù)本發(fā)明的吸收劑組合物，尤其取決于步驟f)是否在步驟e)之前進(jìn)行。

在步驟f)中的液相可以包含根據(jù)本發(fā)明的吸收劑組合物或由根據(jù)本發(fā)明的吸收劑組合物組成，尤其是取決于步驟f)是否在步驟e)之前進(jìn)行。當(dāng)步驟f)與步驟e)同時(shí)或在其之后進(jìn)行時(shí)，步驟e)中的液相可以包含吸收劑組合物。

步驟g)包括檢測(cè)在所述區(qū)劃的一個(gè)或多個(gè)斑點(diǎn)處對(duì)應(yīng)于被分析物的存在的信號(hào)，所述信號(hào)的檢測(cè)在包含所述吸收劑粒子的液相的存在下完成。

在步驟g)中的液相可以與步驟f)中的液相是同樣的，尤其是當(dāng)步驟f)在步驟e)之后進(jìn)行時(shí)。

在步驟g)中的液相可以與步驟f)中的液相是不同的，尤其是當(dāng)步驟f)在步驟e)之前進(jìn)行時(shí)。

當(dāng)吸收劑粒子以吸收劑組合物的形式被供應(yīng)時(shí)，步驟g)中的液相包含所述吸收劑組合物或由所述吸收劑組合物組成。

當(dāng)在分析方法中使用若干種不同的檢測(cè)標(biāo)記物來檢測(cè)一種或多種被分析物時(shí)，步驟g)包括檢測(cè)與存在的所用的檢測(cè)標(biāo)記物同樣多的不同的信號(hào)。

對(duì)應(yīng)于被分析物的存在的在步驟g)中檢測(cè)的信號(hào)是例如由發(fā)光化合物(優(yōu)選化學(xué)發(fā)光化合物)發(fā)射的信號(hào)，和/或由熒光團(tuán)發(fā)射的信號(hào)。

在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，對(duì)應(yīng)于被分析物的存在的在步驟g)中檢測(cè)的信號(hào)是由發(fā)光化合物(優(yōu)選化學(xué)發(fā)光化合物)發(fā)射的信號(hào)，和任選地由熒光團(tuán)發(fā)射的信號(hào)。

在一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方案中，對(duì)應(yīng)于被分析物的存在的在步驟g)中檢測(cè)的信號(hào)不是由熒光團(tuán)發(fā)射的信號(hào)。

優(yōu)選地，對(duì)應(yīng)于被分析物的存在的在步驟g)中檢測(cè)的信號(hào)是由化學(xué)發(fā)光化合物發(fā)射的信號(hào)。

因此，步驟g)至少包括檢測(cè)對(duì)應(yīng)于被分析物的存在的在所述區(qū)劃的一個(gè)或多個(gè)斑點(diǎn)處發(fā)射的信號(hào)，該對(duì)應(yīng)于被分析物的存在的信號(hào)優(yōu)選是由化學(xué)發(fā)光化合物發(fā)射的。

在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，在步驟g)中檢測(cè)的對(duì)應(yīng)于被分析物的存在的信號(hào)因此是由化學(xué)發(fā)光化合物發(fā)射的。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，步驟g)因此包括，在包含所述吸收劑粒子的液相的存在下，檢測(cè)通過化學(xué)發(fā)光產(chǎn)生的在所述區(qū)劃的一個(gè)或多個(gè)斑點(diǎn)處的對(duì)應(yīng)于被分析物的存在的信號(hào)。

此外，步驟g)可以有利地包括檢測(cè)在固體支持體的至少一個(gè)區(qū)劃的一個(gè)、若干個(gè)或一個(gè)或多個(gè)斑點(diǎn)處作為對(duì)照存在的熒光團(tuán)發(fā)射的信號(hào)。

本領(lǐng)域即使人員知道如何測(cè)量發(fā)射的信號(hào)，例如，經(jīng)由發(fā)光化合物或經(jīng)由熒光團(tuán)，基于所述發(fā)光化合物或所述熒光團(tuán)的屬性。

優(yōu)選在步驟g)中通過固體支持體的底部檢測(cè)信號(hào)。

信號(hào)的檢測(cè)優(yōu)選包含在一個(gè)或多個(gè)斑點(diǎn)處發(fā)射的信號(hào)的強(qiáng)度的測(cè)量，所述測(cè)量?jī)?yōu)選通過固體支持體的底部，即在固體支持體的下表面處完成。

尤其使用捕捉固體支持體的底部的圖像的照相機(jī)來完成信號(hào)的檢測(cè)。測(cè)得的信號(hào)因此是朝向所述固體支持體的下表面穿過固體支持體的。

照相機(jī)可以例如朝向固體支持體的底部定向，或可以使用光學(xué)系統(tǒng)(其可以例如包含以下各項(xiàng)或由以下各項(xiàng)組成：一個(gè)或若干個(gè)鏡子、棱鏡和/或一個(gè)或若干個(gè)透鏡)捕捉固體支持體的底部的圖像。

由熒光團(tuán)發(fā)射的信號(hào)的強(qiáng)度的測(cè)量需要用對(duì)應(yīng)于熒光團(tuán)的激發(fā)光譜的光照明一個(gè)或多個(gè)區(qū)劃，優(yōu)選固體支持體的底部。

根據(jù)本發(fā)明的方法因此使得可以改進(jìn)在一個(gè)或多個(gè)斑點(diǎn)上的分析方法中對(duì)應(yīng)于被分析物的存在的信號(hào)的檢測(cè)，尤其是當(dāng)在液相的存在下完成信號(hào)檢測(cè)時(shí)。

信號(hào)檢測(cè)的改進(jìn)包含以下各項(xiàng)或由以下各項(xiàng)組成：減少背景噪聲，優(yōu)選增加“被檢測(cè)的信號(hào)/背景噪聲”比率。

“被檢測(cè)的信號(hào)/背景噪聲”比率尤其是如上文定義的。

一種優(yōu)選的使得可以改進(jìn)在分析方法尤其是多重分析方法中對(duì)應(yīng)于被分析物的存在的信號(hào)的檢測(cè)的方法是如上文定義的包括以下步驟的方法：

a)提供包含至少一個(gè)區(qū)劃的固體支持體，所述區(qū)劃包含用于檢測(cè)被分析物的至少一個(gè)斑點(diǎn)，所述斑點(diǎn)包含所述被分析物的捕捉配體，和優(yōu)選地?zé)晒鈭F(tuán)，

b)在所述區(qū)劃的一個(gè)或多個(gè)斑點(diǎn)的存在下安放待分析的試樣，

c)在所述區(qū)劃的一個(gè)或多個(gè)斑點(diǎn)的存在下安放被分析物的至少一種檢測(cè)配體，所述被分析物的檢測(cè)配體與間接檢測(cè)標(biāo)記物(優(yōu)選生物素)偶聯(lián)，

d)在所述區(qū)劃的一個(gè)或多個(gè)斑點(diǎn)的存在下安放與所述檢測(cè)配體偶聯(lián)的間接檢測(cè)標(biāo)記物的報(bào)道物(優(yōu)選鏈霉抗生物素蛋白)，

e)當(dāng)在步驟d)中使用的報(bào)道物與過氧物酶偶聯(lián)時(shí)，在所述區(qū)劃的一個(gè)或多個(gè)斑點(diǎn)的存在下，安放所述酶的底物，例如魯米諾、異魯米諾和/或魯米諾或異魯米諾的衍生物，

e1)當(dāng)在步驟d)中使用的報(bào)道物與過氧物酶偶聯(lián)時(shí)，在所述區(qū)劃的一個(gè)或多個(gè)斑點(diǎn)的存在下，安放至少一種氧化劑例如過氧化物，和任選地至少一種電子介體例如3-(10’酚噻嗪基)丙烷1-磺酸鈉，所述步驟e1)能夠在步驟e)之前，步驟e)之后或與步驟e)同時(shí)完成，

f)在所述區(qū)劃的一個(gè)或多個(gè)斑點(diǎn)的存在下安放吸收劑粒子，優(yōu)選碳粒子或黃色彩色粒子和品紅色彩色粒子的混合物，所述吸收劑粒子被包含在與所述區(qū)劃的一個(gè)或多個(gè)斑點(diǎn)接觸的液相中，步驟f)可以在步驟e)之前或之后，步驟e1)之前或之后，或與步驟e)和/或步驟e1)同時(shí)完成，以及

g)在包含所述吸收劑粒子的液相的存在下，檢測(cè)對(duì)應(yīng)于在所述區(qū)劃的一個(gè)或多個(gè)斑點(diǎn)處被分析物的存在的信號(hào)。

可以使用如上定義的試劑盒實(shí)施根據(jù)本發(fā)明的方法。

吸收劑粒子用于改進(jìn)信號(hào)檢測(cè)的用途

本發(fā)明特別涉及吸收劑粒子用于改進(jìn)(并因此確保)在包含至少一個(gè)斑點(diǎn)的固體支持體上的分析方法中(尤其是多重分析方法中)對(duì)應(yīng)于被分析物的存在的信號(hào)檢測(cè)的用途。

固體支持體尤其是如上文在“固體支持體”段落中定義的。

固體支持體尤其包含至少一個(gè)區(qū)劃，所述區(qū)劃包含用于被分析物的檢測(cè)的至少一個(gè)斑點(diǎn)，優(yōu)選用于被分析物的檢測(cè)的至少兩個(gè)斑點(diǎn)。

吸收劑粒子尤其是如上文在“吸收劑粒子”段落中定義的。尤其是，吸收劑粒子優(yōu)選為碳粒子，例如炭黑的粒子，或彩色粒子的混合物，例如黃色彩色粒子和品紅色彩色粒子的混合物。

本發(fā)明尤其涉及如上定義的用途，其特征在于吸收劑粒子優(yōu)選為碳粒子，優(yōu)選炭黑的粒子，或彩色粒子的混合物，例如黃色彩色粒子和品紅色彩色粒子的混合物。

吸收劑粒子可以以如上文在“吸收劑組合物”段落中定義的吸收劑組合物的形式被供給。

在一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明尤其涉及碳粒子，優(yōu)選炭黑粒子，或彩色粒子的混合物，優(yōu)選黃色彩色粒子和品紅色彩色粒子的混合物的以下用途：改進(jìn)在一個(gè)或多個(gè)斑點(diǎn)上的分析方法中(尤其是在一個(gè)或多個(gè)斑點(diǎn)上的多重分析方法中)對(duì)應(yīng)于被分析物的存在的信號(hào)的檢測(cè)。

本發(fā)明更具體地涉及如上定義的用途，其特征在于，在液相的存在下完成對(duì)應(yīng)于被分析物的存在的信號(hào)的檢測(cè)。

信號(hào)的檢測(cè)優(yōu)選包括在一個(gè)或多個(gè)斑點(diǎn)處發(fā)射的信號(hào)的強(qiáng)度的測(cè)量，所述測(cè)量?jī)?yōu)選在固體支持體的下表面處完成。尤其使用捕捉固體支持體的底部的圖像的照相機(jī)來完成信號(hào)的檢測(cè)。

如上文指出的，照相機(jī)可以例如朝向固體支持體的底部定向，或可以使用光學(xué)系統(tǒng)(其可以例如包含以下各項(xiàng)或由以下各項(xiàng)組成：一個(gè)或若干個(gè)鏡子、棱鏡和/或一個(gè)或若干個(gè)透鏡)捕捉固體支持體的底部的圖像。

本發(fā)明特別涉及如上所述的方法，其特征在于增加被檢測(cè)的信號(hào)/背景噪聲比率。

“被檢測(cè)的信號(hào)/背景噪聲”比率尤其是如上文定義的。

本發(fā)明優(yōu)選涉及如上文定義的用途，其特征在于，對(duì)應(yīng)于被分析物的存在的信號(hào)是由化學(xué)發(fā)光化合物和/或熒光團(tuán)(優(yōu)選由化學(xué)發(fā)光化合物)發(fā)射的信號(hào)。

本發(fā)明也涉及如上定義的用途，其中使用如上定義的固體支持體實(shí)施分析方法，尤其是包含至少一個(gè)其的至少一個(gè)斑點(diǎn)包含熒光團(tuán)作為用于一個(gè)或多個(gè)斑點(diǎn)的對(duì)照的區(qū)劃的固體支持體，優(yōu)選包含至少一個(gè)其的斑點(diǎn)包含作為用于斑點(diǎn)的對(duì)照的熒光團(tuán)的區(qū)劃的固體支持體。

本發(fā)明也涉及吸收劑粒子用于改進(jìn)(并因此確保)使用如上定義的試劑盒在如上定義的斑點(diǎn)上的多重分析方法中的信號(hào)的檢測(cè)的用途。

本發(fā)明的其他特征和優(yōu)點(diǎn)將通過以下實(shí)施例更好地顯現(xiàn)，所述實(shí)施例作為說明并且非限制性地被提供。這些實(shí)施例和圖說明了本發(fā)明，而不限制它的范圍。

圖

圖1：微量培養(yǎng)板的孔的圖示的橫截面。在孔的底部上顯示了三個(gè)實(shí)際的斑點(diǎn)，底部由透明膜組成。向下指的空心箭頭顯示了實(shí)際有用的發(fā)射，其朝向照相機(jī)。實(shí)心箭頭顯示了在孔中的光射線的路徑。這些箭頭說明了起源自在液體中光的漫射、在孔壁上、在液體/空氣界面處和在彎月面處的反射的光假象(artifact)的存在。

圖2：微量培養(yǎng)板的孔的圖示的橫截面。在孔的底部上顯示了三個(gè)實(shí)際的斑點(diǎn)，底部由透明膜組成。向下指的空心箭頭顯示了實(shí)際有用的發(fā)射，其朝向照相機(jī)。實(shí)心箭頭顯示了在孔中的光射線的路徑和這些射線的強(qiáng)度。黑色圓點(diǎn)顯示了吸收劑粒子，其使得可以吸收在液體介質(zhì)中發(fā)射的光，因此降低了在液體介質(zhì)中光的漫射以及在孔壁處、在空氣/液體界面處和在彎月面處的光假象。

圖3：具有試樣S1的孔的圖像，沒有加入吸收劑組合物。1：光環(huán)。2：光弧。

圖4：具有試樣S1的孔的圖像，具有以1/1000稀釋的吸收劑組合物。

圖5：具有試樣S1的孔的圖像，具有以1/500稀釋的吸收劑組合物。

圖6：具有試樣S1的孔的圖像，具有以1/200稀釋的吸收劑組合物。

圖7：具有試樣S1的孔的圖像，具有以1/100稀釋的吸收劑組合物。

圖8：具有試樣S2的孔的圖像，沒有加入吸收劑組合物。箭頭指示孿生斑點(diǎn)。

圖9：具有試樣S2的孔的圖像，在與圖8相同的條件下，但在以1/200稀釋的吸收劑組合物的存在下。

圖10：基于包含碳粒子的吸收劑組合物的稀釋，孔的底部(下方曲線)和參比斑點(diǎn)的信號(hào)(上方曲線)的亮度水平的相對(duì)于參比條件(沒有碳粒子)歸一化的強(qiáng)度。

圖11：包含碳粒子的吸收劑組合物的稀釋對(duì)被檢測(cè)的信號(hào)/背景噪聲比率的改進(jìn)。

圖12：相對(duì)于沒有吸收劑溶液的條件的參比斑點(diǎn)的信號(hào)的強(qiáng)度的演變，在加入吸收劑粒子的情況下(上方曲線)和加入染料的情況下(下方曲線)，基于存在的液相的光密度。

圖13：在吸收劑粒子的存在下通過熒光的斑點(diǎn)檢測(cè)。

實(shí)施例

材料和方法

使用具有96個(gè)孔的微量培養(yǎng)板完成多重分析方法，所述孔包含9個(gè)斑點(diǎn)/孔(在第1條線上的3個(gè)斑點(diǎn)編號(hào)1至3，在第2條線上的3個(gè)斑點(diǎn)編號(hào)4至6，在第3條線上的3個(gè)斑點(diǎn)編號(hào)7至9)。

1號(hào)斑點(diǎn)包含以高濃度存在于使用的參比試樣S1中的被分析物AH的專門捕捉配體。

在分析方法期間，在37℃在孔的斑點(diǎn)的存在下安放試樣S1達(dá)40分鐘。在孔的洗滌之后，向孔中加入存在于參比試樣S1中并且與生物素偶聯(lián)的被分析物的或?qū)?yīng)于被分析物AH的專門捕捉配體。在37℃溫育15分鐘之后，洗滌孔，并且向孔中加入與過氧物酶偶聯(lián)的鏈霉抗生物素蛋白報(bào)道物。在37℃溫育15分鐘之后，洗滌孔。“ELISTAR ETAC Ultra ELISA(Cyanagen，Italy)”試劑盒用于顯影步驟，根據(jù)制造商的手冊(cè)。它由供給兩種溶液組成：溶液A包含酶的底物即魯米諾和電子介體(3-(10’酚噻嗪基)丙烷1-磺酸鈉)，且溶液B包含氧化劑(過氧化物溶液)。在獲得信號(hào)之前，如果可用，向孔中加入包含碳粒子的吸收劑組合物的稀釋物。吸收劑組合物可以以與溶液B或溶液A的混合物的方式添加，在兩種模式中觀察到的結(jié)果沒有可注意到的差異。在此實(shí)施例中使用的吸收劑組合物是Cabot(美國(guó))制備的352K。

使用由CDD照相機(jī)通過遠(yuǎn)心物鏡攝取的圖像，測(cè)量通過由從酶促反應(yīng)所得的化學(xué)發(fā)光的產(chǎn)物的化學(xué)發(fā)光發(fā)射的信號(hào)。

也在同一圖像上測(cè)量孔的底部的亮度水平。

為了測(cè)量由熒光產(chǎn)生的信號(hào)，發(fā)射集中在620nm的波長(zhǎng)的紅色光的照明系統(tǒng)均勻地照亮固體支持體的下表面。排布在照相機(jī)的輸入處且具有集中在680nm處的帶寬的濾鏡使得可以切斷此紅色激發(fā)光。它允許由在斑點(diǎn)中存在的熒光團(tuán)發(fā)射的光通過。使用此裝置測(cè)量由斑點(diǎn)通過熒光發(fā)射的信號(hào)。

結(jié)果

(i)在碳粒子的存在下信號(hào)的檢測(cè)的改進(jìn)

在試樣S1的情況下，對(duì)應(yīng)于被分析物AH的斑點(diǎn)(在斑點(diǎn)網(wǎng)格中的1號(hào)斑點(diǎn))處發(fā)射非常強(qiáng)的光。

在參比條件下(參看圖3)，在不存在吸收劑組合物的情況下，即在不存在碳粒子的分散體的情況下，人們可以看到在孔的底部的整個(gè)周緣上的光環(huán)(1)，其由通過充當(dāng)平凹透鏡(planner-concave lens)的液體看到的孔的豎直壁的像導(dǎo)致。該環(huán)可以在對(duì)應(yīng)于高度明亮的被分析物的斑點(diǎn)附近顯示極大的強(qiáng)度，并且因此具有光弧(2)。因此在孔的整個(gè)底部上存在光網(wǎng)。

在懸浮液中的碳粒子的存在下，人們可以看到在孔的周緣上的光環(huán)的消失和光網(wǎng)的減弱(參看圖4至7)。

在不存在吸收劑組合物的情況下，人們有時(shí)看到，從斑點(diǎn)位移，有一個(gè)稍小的光斑，其由在背景中在液體的表面上的斑點(diǎn)的反射造成(參看試樣S2的圖8)。在懸浮液中的碳粒子的存在下，人們可以看到此前觀察到的斑點(diǎn)的反射的消失(參看圖9)。

在試樣S1的情況下，以RLU(相對(duì)光單位)數(shù)測(cè)量了參比斑點(diǎn)(斑點(diǎn)8或斑點(diǎn)Aref)的信號(hào)的強(qiáng)度和孔的底部的亮度水平(參看表1)。

在表1中顯示的結(jié)果來自兩個(gè)不同的板。第一板對(duì)應(yīng)于1/1000和1/500稀釋，且第二對(duì)應(yīng)于1/200和1/100稀釋。

表1：參比斑點(diǎn)的信號(hào)的強(qiáng)度和孔的底部的亮度水平

人們可以看到，當(dāng)人們加入更多的碳粒子時(shí)，光強(qiáng)度降低。有趣的效果是，孔的底部的亮度水平比參比斑點(diǎn)的水平降低得更快(參看表1和圖10)。孔的底部的亮度據(jù)認(rèn)為是不想要的，在人們尋求量化的信號(hào)的測(cè)量中產(chǎn)生噪聲。人們可以因此得出結(jié)論，通過加入處于懸浮液中的碳粒子，改進(jìn)了被檢測(cè)的信號(hào)/背景噪聲比率。

表2：基于吸收劑組合物的稀釋，被檢測(cè)的信號(hào)/背景噪聲比率的改進(jìn)

表2和圖11中所示的結(jié)果顯示，當(dāng)人們?cè)黾犹剂Ｗ拥臐舛葧r(shí)被檢測(cè)的信號(hào)/背景噪聲比率的改進(jìn)。

(ii)碳粒子對(duì)酒石黃獲得的性能的比較

在450nm(接近最大化學(xué)發(fā)光發(fā)射)處，研究在含有摻雜有酒石黃的溶液的孔的光密度(OD)和含有摻雜有在懸浮液中的碳粒子的溶液的孔的光密度。發(fā)明人實(shí)際上顯示了，出人意料地，酒石黃也使得可以消除當(dāng)在液相中獲得信號(hào)時(shí)發(fā)生的光干涉的一些或全部。

表3：基于吸收劑粒子組合物的稀釋，參比斑點(diǎn)的演變

表4：基于吸收劑酒石黃組合物的稀釋，參比斑點(diǎn)的演變

表3和4中所示的結(jié)果顯示，對(duì)于使用250μg/ml的酒石黃來說，獲得0.3的OD。用以1/1000稀釋的碳粒子的分散體獲得等效情況。在參比斑點(diǎn)上，在碳粒子的存在下觀察到8％的信號(hào)損失，且在酒石黃的存在下觀察到12％。對(duì)于使用4000μg/ml濃度的酒石黃來說，獲得接近3.8的OD。用以1/100稀釋的碳粒子的分散體獲得等效情況。在參比斑點(diǎn)上，在碳粒子的存在下觀察到小于20％的信號(hào)損失，且在酒石黃的存在下觀察到大于50％。因此，加入在懸浮液中的碳粒子比酒石黃更加有利，因?yàn)樵谙嗟鹊囊合嗟墓饷芏葧r(shí)，它較少影響被檢測(cè)的信號(hào)(參看圖12)。

(iii)在吸收劑粒子的存在下通過熒光進(jìn)行的斑點(diǎn)的檢測(cè)

還驗(yàn)證了，事實(shí)上在吸收劑粒子的存在下檢測(cè)了由在微量培養(yǎng)板的斑點(diǎn)中存在的作為對(duì)照的熒光團(tuán)發(fā)射的信號(hào)。

如在圖13中可見的，在包含Cab-O-Jet 352K產(chǎn)品(1/200稀釋)的吸收劑溶液的存在下，通過熒光檢測(cè)的信號(hào)使得可以相對(duì)于孔的底部非常清楚地限定斑點(diǎn)的位置。因此，吸收劑的加入沒有阻止通過由作為對(duì)照存在于斑點(diǎn)中的熒光團(tuán)的熒光發(fā)射的信號(hào)的檢測(cè)。

然而，通過熒光獲得的背景噪聲在吸收劑粒子的存在下相對(duì)于不存在它們的情況下獲得的背景噪聲翻倍。作為結(jié)果，該被探測(cè)的信號(hào)比噪聲比率降低一半。