本發(fā)明涉及分子生物學技術領域，具體是一種金黃色葡萄球菌黏附素蛋白抗體的抗黏附能力的檢測方法。
背景技術：
金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus，簡稱S.aureus)是奶牛乳房炎的主要病原菌，近50％的奶牛乳房炎是由該菌引起。奶牛乳房炎不僅造成產(chǎn)奶量下降，甚至嚴重影響牛奶品質(zhì)，導致乳品工業(yè)的經(jīng)濟損失。
S.aureus黏附到乳頭管被認為是乳腺感染的第一步，因此，黏附到乳腺上皮細胞和細胞外基質(zhì)上的能力對于S.aureus的致病性至關重要。S.aureus黏附的過程中有多種黏附因子參與，其中纖維素結合蛋白B(Fibronectin-binding protein B，簡稱FnbpB)是重要的黏附素之一，它能夠介導S.aureus結合于細胞表面的纖維連結素(Fn)與纖維蛋白原(Fg)，使細胞黏附于宿主細胞表面，促進細菌對宿主的侵入。因此，目前研究表明以FnbpB為靶位進行疫苗的研制可能是預防奶牛S.aureus乳房炎的有效方法。
技術實現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的在于提供一種金黃色葡萄球菌黏附素蛋白抗體的抗黏附能力的檢測方法，通過將S.aureus菌株的FnbpB基因進行克隆表達后，再對表達產(chǎn)物的特異性抗體的抗黏附能力進行檢測，進而為以FnbpB為靶位的S.aureus的黏附素疫苗提供參考，還為金黃色葡萄球菌性奶牛乳房炎疫苗的研究提供試驗依據(jù)。
為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供如下技術方案：
金黃色葡萄球菌黏附素蛋白抗體的抗黏附能力的檢測方法，包括以下步驟：
(1)pET-FnbpB-D的誘導表達
首先采用PCR方法對金黃色葡萄球菌FnbpB基因中的D區(qū)進行特異性的擴增得到構建的重組質(zhì)粒，并利用表達載體pET-32a對該構建的重組質(zhì)粒進行誘導表達后，經(jīng)鑒定，誘導表達后的重組質(zhì)粒以可溶性蛋白形式存在，然后將該可溶性蛋白形式的重組質(zhì)粒進行 大量表達純化，得到目的蛋白；
(2)目的蛋白免疫實驗兔后的抗血清制備
將目的蛋白與弗氏完全佐劑乳化后，實驗兔背部多點注射免疫，注射量為600μg/只，2周后，將目的蛋白與弗氏不完全佐劑乳化后，進行加強免疫；1周后，實驗兔耳緣靜脈采血后，制備得到含有抗體的抗血清；
(3)抗體抗黏附能力的檢測，包括以下步驟：
①5μg/mL牛纖維蛋白原包被酶標板，4℃過夜；
②往酶標板中加入5％脫脂乳作為封閉液，37℃封閉3h得到封閉好的酶標板；
③將對數(shù)生長期的S.aureus與制備的抗血清在37℃共孵育60min；
④將孵育的S.aureus加入封閉好的酶標板中，以未經(jīng)抗血清孵育的S.aureus做對照，37℃作用2h，PBST洗滌3次；
⑤25％甲醛固定30min，洗滌同上；
⑥用結晶紫染色30min，洗滌同上；
⑦最后用95％乙醇脫色兩次，每次5min，盡量使結晶紫全部脫出；
⑧在波長405nm處測定經(jīng)抗血清孵育的S.aureus、未經(jīng)抗血清孵育的S.aureus兩組的OD值；根據(jù)測定值，計算經(jīng)抗血清孵育的S.aureus、未經(jīng)抗血清孵育的S.aureus兩組的平均OD405nm值以及標準差，從而對抗體的抗黏附能力進行判定。
與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明的有益效果是：
本發(fā)明通過將S.aureus菌株的FnbpB基因進行克隆表達后，再對表達產(chǎn)物的特異性抗體的抗黏附能力進行檢測，進而為以FnbpB為靶位的S.aureus的黏附素疫苗提供參考。本發(fā)明還為金黃色葡萄球菌性奶牛乳房炎疫苗的研究提供試驗依據(jù)。
具體實施方式
下面將結合本發(fā)明實施例，對本發(fā)明實施例中的技術方案進行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實施例僅僅是本發(fā)明一部分實施例，而不是全部的實施例?；诒景l(fā)明中的實施例，本領域普通技術人員在沒有做出創(chuàng)造性勞動前提下所獲得的所有其他實施例，都 屬于本發(fā)明保護的范圍。
本發(fā)明實施例中，金黃色葡萄球菌黏附素蛋白抗體的抗黏附能力的檢測方法，具體操作步驟如下：
1、pET-FnbpB-D的誘導表達
首先采用PCR方法對金黃色葡萄球菌FnbpB基因中的D區(qū)進行特異性的擴增得到構建的重組質(zhì)粒，并利用表達載體pET-32a對該構建的重組質(zhì)粒進行誘導表達后，經(jīng)鑒定，誘導表達后的重組質(zhì)粒以可溶性蛋白形式存在，然后將該可溶性蛋白形式的重組質(zhì)粒進行大量表達純化，得到目的蛋白。
2、目的蛋白免疫實驗兔后的抗血清制備
將目的蛋白與弗氏完全佐劑乳化后，實驗兔背部多點注射免疫(600μg/只)，2周后，將目的蛋白與弗氏不完全佐劑乳化后，進行加強免疫。1周后，實驗兔耳緣靜脈采血后，制備得到含有抗體的抗血清。
3、抗體抗黏附能力的檢測
①5μg/mL牛纖維蛋白原包被酶標板，4℃過夜；
②往酶標板中加入5％脫脂乳作為封閉液，37℃封閉3h得到封閉好的酶標板；
③將對數(shù)生長期的S.aureus與制備的抗血清在37℃共孵育60min；
④將孵育的S.aureus加入封閉好的酶標板中，以未經(jīng)抗血清孵育的S.aureus做對照，37℃作用2h，PBST洗滌3次；
⑤25％甲醛固定30min，洗滌同上；
⑥用結晶紫染色30min，洗滌同上；
⑦最后用95％乙醇脫色兩次，每次5min，盡量使結晶紫全部脫出；
⑧在波長405nm處測定OD值。
4、抗體抗黏附能力的檢測結果
用酶標儀測定OD405nm，并從統(tǒng)計學角度來計算經(jīng)抗血清孵育的S.aureus、未經(jīng)抗血清孵育的S.aureus兩組的平均OD405nm值以及標準差，結果表明：經(jīng)抗血清孵育的S.arreus 的平均OD405nm值為0.1679(標準差為0.0346)，未經(jīng)抗血清孵育的S.aureus的平均OD405nm值為0.3543(標準差為0.0895)，經(jīng)抗血清孵育的S.aureus的平均OD405nm值明顯低于未經(jīng)抗血清孵育的S.aureus，試驗組與對照組差異極顯著(p＜0.01)，表明抗血清有抑制S.aureus黏附到纖維連結素的作用。
因此，通過上述方法，可以有效地檢測金黃色葡萄球菌黏附素蛋白抗血清的抗黏附能力，為進一步證明FnbpB基因具有幫助S.aureus黏附于宿主細胞的作用，對金黃色葡萄球菌性奶牛乳房炎疫苗的研究提供了依據(jù)。
對于本領域技術人員而言，顯然本發(fā)明不限于上述示范性實施例的細節(jié)，而且在不背離本發(fā)明的精神或基本特征的情況下，能夠以其他的具體形式實現(xiàn)本發(fā)明。因此，無論從哪一點來看，均應將實施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本發(fā)明的范圍由所附權利要求而不是上述說明限定，因此旨在將落在權利要求的等同要件的含義和范圍內(nèi)的所有變化囊括在本發(fā)明內(nèi)。
此外，應當理解，雖然本說明書按照實施方式加以描述，但并非每個實施方式僅包含一個獨立的技術方案，說明書的這種敘述方式僅僅是為清楚起見，本領域技術人員應當將說明書作為一個整體，各實施例中的技術方案也可以經(jīng)適當組合，形成本領域技術人員可以理解的其他實施方式。