一種檢測中華絨螯蟹胚胎冷凍后細胞骨架結(jié)構(gòu)損傷的方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種檢測中華絨螯蟹胚胎冷凍后細胞骨架結(jié)構(gòu)損傷的方法，包括：(1)分別選取新鮮胚胎和經(jīng)過超低溫冷凍的胚胎，用B-PBS漂洗，固定，漂洗；(2)將冷凍前后胚胎的胚盤從卵中剝離；采用Triton-100在室溫下與胚胎作用，漂洗，室溫下封閉，用actin抗體在室溫下與胚胎作用，漂洗，再用標(biāo)有異硫氰熒光素的羊抗兔IgG在室溫下與胚胎作用，漂洗，將胚胎吸出滴在載玻片上，載玻片上加防熒光淬滅劑，再用甘油與PBS混合液封片，觀察冷凍前后胚胎樣品熒光著色情況。本發(fā)明能準(zhǔn)確檢測中華絨螯蟹胚胎細胞骨架結(jié)構(gòu)損傷，對損傷程度進行量化，結(jié)果更直觀，更可靠，檢測準(zhǔn)確率達到99％以上。
【專利說明】
一種檢測中華絨螯蟹胚胎冷凍后細胞骨架結(jié)構(gòu)損傷的方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于水產(chǎn)養(yǎng)殖種質(zhì)保存領(lǐng)域，涉及到一種檢測中華絨螯蟹胚胎冷凍后細胞骨架結(jié)構(gòu)損傷的方法。

【背景技術(shù)】
[0002]我國是一個水生生物種質(zhì)資源較為豐富的國家，豐富多樣的水生生物種質(zhì)資源和遺傳多樣性對于我國水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的快速發(fā)展起到了非常重要的作用。隨著社會經(jīng)濟的發(fā)展，水生生物生存環(huán)境的嚴(yán)重惡化，過度捕撈、有害漁具漁法的運用以及水利工程建設(shè)等諸多原因，導(dǎo)致漁業(yè)生物資源衰退，傳統(tǒng)漁獲產(chǎn)量下降，大量水生生物處于滅絕或瀕危狀態(tài)。利用低溫生物學(xué)的原理，建立優(yōu)良養(yǎng)殖魚類或瀕臨滅絕魚類的冷凍配子庫和胚胎庫，可以實現(xiàn)對優(yōu)良魚類原良種的長期保存，避免過度捕撈、生態(tài)破壞或環(huán)境污染造成的魚類物種滅絕或因近親交配而形成的種質(zhì)退化和遺傳變異現(xiàn)象。
[0003]低溫技術(shù)是一把雙刃劍，應(yīng)用得當(dāng)時，低溫可以長期保存生命；應(yīng)用不得當(dāng)，低溫又會產(chǎn)生嚴(yán)重損傷、殺死生物。近50年來，超低溫冷凍保存技術(shù)被廣泛應(yīng)用于人類和很多哺乳動物的生殖繁育上，盡管超低溫冷凍保存已經(jīng)獲得了很大的成功，但這種冷凍保存技術(shù)仍然會對細胞造成致死和亞致死損傷。甲殼動物一中華絨螯蟹胚胎已冷凍保存成功，但胚胎解凍后成活率不高，結(jié)果難以重復(fù)，超低溫冷凍對其胚胎損傷機理不祥。細胞骨架是細胞的一種超微結(jié)構(gòu)，是遍布于整個細胞的一種復(fù)雜的蛋白質(zhì)纖維網(wǎng)絡(luò)，起支持、轉(zhuǎn)運、運動的作用，在胚胎發(fā)育中具有十分重要的作用，因此細胞骨架結(jié)構(gòu)的完整性是評判胚胎冷凍損傷的重要依據(jù)。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明提供了一種檢測中華絨螯蟹胚胎冷凍后細胞骨架結(jié)構(gòu)損傷的方法，該方法能準(zhǔn)確檢測中華絨螯蟹胚胎細胞骨架結(jié)構(gòu)損傷，對損傷程度進行量化，結(jié)果更直觀，更可靠，檢測準(zhǔn)確率達到99%以上。
[0005]本發(fā)明的一種檢測中華絨螯蟹胚胎冷凍后細胞骨架結(jié)構(gòu)損傷的方法，包括:
[0006](I)分別選取中華絨螯蟹新鮮胚胎和經(jīng)過超低溫冷凍的胚胎，用B-PBS漂洗，漂洗后將2組胚胎樣品分別放入多聚甲醛中固定，再用B-PBS漂洗；
[0007](2)將冷凍前后胚胎的胚盤從卵中剝離；采用Triton-100在室溫下與胚胎作用10?20min，B-PBS漂洗，再用PBS液室溫下封閉I?2小時，用actin抗體在室溫下與胚胎作用70?80min，B-PBS漂洗，再用標(biāo)有異硫氰熒光素的羊抗兔IgG在室溫下與胚胎作用35?40min，PBS漂洗，將胚胎吸出滴在載玻片上，載玻片上加防熒光淬滅劑，再用甘油與PBS混合液封片，激光共聚焦顯微鏡下觀察冷凍前后胚胎樣品熒光著色情況。
[0008]所述步驟(I)和⑵中的B-PBS為含0.3%牛血清蛋白的PBS ;漂洗3次，每次1min0
[0009]所述步驟(I)中的多聚甲醛濃度為4%。
[0010]所述步驟(2)中的Triton-100的濃度為0.1%。
[0011]所述步驟⑵中的PBS液含I %牛血清蛋白和0.05% Tween20。
[0012]所述步驟(2)中actin抗體按1:80稀釋。
[0013]所述步驟(2)中異硫氰熒光素的羊抗兔IgG按1:60稀釋。
[0014]所述步驟(2)中的防熒光淬滅劑為DABC0。
[0015]所述步驟⑵中的甘油與PBS混合液中甘油與PBS的體積比為9:1。
[0016]本發(fā)明通過對中華絨螯蟹冷凍前后胚胎采用改進后的方法進行熒光染色，激光共聚焦顯微鏡觀察冷凍前后胚胎熒光信號強度和熒光量，分析冷凍前后胚胎細胞骨架結(jié)構(gòu)的變化，建立檢測胚胎冷凍后細胞骨架結(jié)構(gòu)損傷的方法。
_7] 有益.效果
[0018]本發(fā)明能準(zhǔn)確檢測中華絨螯蟹胚胎細胞骨架結(jié)構(gòu)損傷，對損傷程度進行量化，結(jié)果更直觀，更可靠，檢測準(zhǔn)確率達到99%以上。

【具體實施方式】
[0019]下面結(jié)合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明講授的內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權(quán)利要求書所限定的范圍。
[0020]實施例1
[0021]在中華絨螯蟹繁殖季節(jié)，采集中華絨螯蟹胚胎，部分胚胎采用30% 1，2丙二醇+20%二甲基甲酰胺作為抗凍保護液，胚胎在抗凍液中按照分步平衡法平衡40min，在-196°C冷凍40min，快速解凍后用0.25mol/L的蔗糖洗脫lOmin，獲得了凍后胚胎樣品。分別選取冷凍前后胚胎各30粒，用含0.3%牛血清蛋白的PBS(B-PBS)漂洗3次，每次lOmin，漂洗后將這2組胚胎樣品分別放入4%的多聚甲醛中于4°C培養(yǎng)箱中固定3小時，再用0.3% B-PBS漂洗3次，每次lOmin。用解剖針將冷凍前后胚胎的胚盤從卵中剝離，0.1%的Triton-1OO在室溫下與胚胎作用1min進行打孔處理，處理完成后用0.3% B-PBS漂洗3次，每次1min0用含I %牛血清蛋白(BSA)和0.05% Tween20 ( —種表面活性劑)的PBS液室溫下封閉胚胎I小時，用兔抗鼠的抗體actin抗體(按1:80稀釋)在室溫下與胚胎作用70min，稀釋液為含5%山羊血清和5%二甲亞砜的Tris鹽酸緩沖液，0.3% B-PBS漂洗3次，每次lOmin，再用標(biāo)有異硫氰熒光素的羊抗兔IgG(IgG-FITC)(按1:60稀釋)在室溫下與胚胎作用35min，0.3% B-PBS漂洗3次，每次lOmin。在潔凈的載玻片上加一滴防熒光淬滅劑DABCO，將處理后的胚胎轉(zhuǎn)入其中，再用甘油與PBS(體積比9:1)的混合液封片。
[0022]OLYMPUS FV-1OOO激光共聚焦顯微鏡觀察冷凍前后胚胎樣品熒光著色情況。與鮮胚相比，凍胚細胞的熒光信號減弱，就凍胚而言，熒光信號越強表明冷凍對胚胎細胞骨架結(jié)構(gòu)影響越小，若熒光信號消失則表明凍胚細胞死亡；通過熒光定量分析冷凍前后胚胎熒光強度，冷凍后胚胎熒光強度越大表明胚胎細胞骨架結(jié)構(gòu)越完整，受冷凍損傷越小；熒光強度越小則表明胚胎細胞骨架結(jié)構(gòu)受冷凍影響越大。
[0023]運用這種方法能準(zhǔn)確檢測中華絨螯蟹胚胎細胞骨架結(jié)構(gòu)損傷，對損傷程度進行量化，結(jié)果更直觀，更可靠，檢測準(zhǔn)確率達到99%以上。
【權(quán)利要求】
1.一種檢測中華絨螯蟹胚胎冷凍后細胞骨架結(jié)構(gòu)損傷的方法，包括: (1)分別選取中華絨螯蟹新鮮胚胎和經(jīng)過超低溫冷凍的胚胎，用B-PBS漂洗，漂洗后將2組胚胎樣品分別放入多聚甲醛中固定，再用B-PBS漂洗； (2)將冷凍前后胚胎的胚盤從卵中剝離；采用Triton-1OO在室溫下與胚胎作用10?20min, B-PBS漂洗，再用PBS液室溫下封閉I?2小時，用act in抗體在室溫下與胚胎作用70?80min，B-PBS漂洗，再用標(biāo)有異硫氰熒光素的羊抗兔IgG在室溫下與胚胎作用35?40min, PBS漂洗，將胚胎吸出滴在載玻片上，載玻片上加防熒光淬滅劑，再用甘油與PBS混合液封片，激光共聚焦顯微鏡下觀察冷凍前后胚胎樣品熒光著色情況。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種檢測中華絨螯蟹胚胎冷凍后細胞骨架結(jié)構(gòu)損傷的方法，其特征在于:所述步驟(I)和(2)中的B-PBS為含0.3%牛血清蛋白的PBS ;漂洗3次，每次1min0
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種檢測中華絨螯蟹胚胎冷凍后細胞骨架結(jié)構(gòu)損傷的方法，其特征在于:所述步驟(I)中的多聚甲醛濃度為4%。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種檢測中華絨螯蟹胚胎冷凍后細胞骨架結(jié)構(gòu)損傷的方法，其特征在于:所述步驟(2)中的Triton-100的濃度為0.1%。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種檢測中華絨螯蟹胚胎冷凍后細胞骨架結(jié)構(gòu)損傷的方法，其特征在于:所述步驟(2)中的PBS液含1%牛血清蛋白和0.05% Tween20。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種檢測中華絨螯蟹胚胎冷凍后細胞骨架結(jié)構(gòu)損傷的方法，其特征在于:所述步驟(2)中actin抗體按1:80稀釋。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種檢測中華絨螯蟹胚胎冷凍后細胞骨架結(jié)構(gòu)損傷的方法，其特征在于:所述步驟(2)中異硫氰熒光素的羊抗兔IgG按1:60稀釋。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種檢測中華絨螯蟹胚胎冷凍后細胞骨架結(jié)構(gòu)損傷的方法，其特征在于:所述步驟(2)中的防熒光淬滅劑為DABC0。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種檢測中華絨螯蟹胚胎冷凍后細胞骨架結(jié)構(gòu)損傷的方法，其特征在于:所述步驟(2)中的甘油與PBS混合液中甘油與PBS的體積比為9:1。
【文檔編號】G01N21/64GK104390944SQ201410598177
【公開日】2015年3月4日 申請日期:2014年10月30日 優(yōu)先權(quán)日:2014年10月30日
【發(fā)明者】黃曉榮, 莊平, 章龍珍, 馮廣朋, 趙峰, 劉鑒毅, 張濤, 宋超, 王妤 申請人:中國水產(chǎn)科學(xué)研究院東海水產(chǎn)研究所