一種同時(shí)測(cè)定地龍注射劑中五種氨基酸含量的pr-hplc測(cè)定方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種同時(shí)測(cè)定地龍注射劑中五種氨基酸含量的PR-HPLC測(cè)定方法，該方法色譜條件：C18或C8反相色譜柱，柱溫：37℃，檢測(cè)波長(zhǎng)248nm，流速0.8ml/min梯度洗脫，流動(dòng)相A為5.0mmol/L七氟丁酸的0.7%三氟乙酸水溶液，流動(dòng)相B為60%乙腈水溶液，洗脫液流速為0min100%A，0.5min98.5%A,10min90%A,15min67%A,20min20%A,25min0%A；對(duì)照品溶液及供試品溶液的配制；精密量取對(duì)照品溶液與供試品溶液各10μl注入反相液相色譜儀，進(jìn)行反相液相色譜測(cè)定分析。該測(cè)定方法操作簡(jiǎn)單快速，無需衍生劑，且穩(wěn)定性強(qiáng)、重現(xiàn)性好，能更好地對(duì)地龍注射液的有效成分及質(zhì)量進(jìn)行控制的反相高效液相色譜測(cè)定方法。
【專利說明】-種同時(shí)測(cè)定地龍注射劑中五種氨基酸含量的PR-HPLC測(cè) 定方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及儀器分析【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種同時(shí)測(cè)定地龍注射劑中五種氨基酸 含量的PR-HPLC測(cè)定方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 地龍注射液，平喘止咳。用于支氣管哮喘所致的咳嗽、喘息。
[0003] 早期對(duì)于地龍注射液含量測(cè)定由3部分組成，分別為氮測(cè)定法測(cè)總氮量、滴定法 測(cè)氨基氮及薄層色譜法測(cè)纈氨酸含量，但該測(cè)定方法專屬性不強(qiáng)、且重現(xiàn)性不高，無法對(duì)地 龍注射液的有效成分及質(zhì)量進(jìn)行控制。
[0004] 黃璐敏在《中國藥師》2010年第13卷第11期的"HPLC法測(cè)定地龍注射液中主要 氨基酸的含量"公開了一種建立測(cè)定地龍注射液中主要氨基酸含量的方法，該方法以6-氨 基喹啉-N-羥基琥珀酰亞胺基甲酸酯（AQC)為衍生劑，與地龍注射液中的游離氨基酸柱前 定量顏色，用HPLC法測(cè)定衍生物含量。雖然丙氨酸、纈氨酸、鹽酸賴氨酸、異亮氨酸、亮氨酸 在各自濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，平均回收率102. 6~104. 9%，RSD 0. 3、. 9%，但其需要使用 到衍生劑進(jìn)行衍生測(cè)定，操作復(fù)雜。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 為了克服上述現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明提供了一種操作簡(jiǎn)單快速，無需衍生劑，且 其穩(wěn)定性強(qiáng)、重現(xiàn)性好，能更好地對(duì)地龍注射液的有效成分及質(zhì)量進(jìn)行控制的反相高效液 相色譜測(cè)定方法。
[0006] 本發(fā)明提供了一種同時(shí)測(cè)定地龍注射劑中五種氨基酸含量的PR-HPLC (反相高效 液相色譜法）測(cè)定方法，包含如下步驟： 51、 色譜條件：C18或C8反相色譜柱，柱溫：37°C，檢測(cè)波長(zhǎng)248nm，流速0. 8ml/min梯 度洗脫，流動(dòng)相A為5. Ommol/L七氟丁酸的0. 7%三氟乙酸水溶液，流動(dòng)相B為60%乙腈水 溶液，洗脫液流速為 Omin 100%A，0.5min 98. 5%A, IOmin 90%A，15min 67%A, 20min 20%A, 25min 0%A ； 52、 對(duì)照品溶液的配制：精密稱取丙氨酸對(duì)照品90. 79mg、繳氨酸對(duì)照品39. 94mg、鹽 酸賴氨酸對(duì)照品32. 53mg、異亮氨酸對(duì)照品30. 87mg、亮氨酸對(duì)照品60. 28mg，另取酪氨酸 I. 3g，加入0. lmol/L鹽酸溶液溶解，用水定容于容量瓶，得對(duì)照品溶液； 53、 供試品溶液的配制：取地龍注射液五支，混勻，用水定容于容量瓶，得供試品溶液； 54、 測(cè)定：精密量取對(duì)照品溶液與供試品溶液各10 μ 1注入反相液相色譜儀，進(jìn)行反相 液相色譜測(cè)定分析。
[0007] 優(yōu)選地，步驟S2具體包括：精密稱取105°C干燥3h的丙氨酸對(duì)照品90. 79mg、纈 氨酸對(duì)照品39. 94mg、鹽酸賴氨酸對(duì)照品32. 53mg、異亮氨酸對(duì)照品30. 87mg、亮氨酸對(duì)照品 60. 28mg，另取酪氨酸I. 3g，置于同一 IOOml量瓶中加少量0. lmol/L鹽酸溶液溶解，加水稀 釋至刻度，且再精密量取5ml，置IOOml量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻，即得對(duì)照品溶液。
[0008] 更優(yōu)選地,步驟S3具體包括：取地龍注射液五支,混勻,精密量取5ml,置IOOml量 瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻，即得供試品溶液。
[0009] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果如下： (1) 操作分析步驟簡(jiǎn)單快速，無需采用衍生劑進(jìn)行衍生，減少試劑的使用，有利于環(huán)保 節(jié)約； (2) 專屬性強(qiáng)，地龍注射液廣地龍陰性制劑色譜在相應(yīng)氨基酸對(duì)照品色譜相應(yīng)位置上 無干擾； (3) 回收率高，加入氨基酸母液，丙氨酸、纈氨酸、鹽酸賴氨酸、異亮氨酸、亮氨酸的平均 回收率分別為 106. 7%，105. 0%，108. 7%，104. 6%，105. 4% ; (4) 重復(fù)性高、精密度好，對(duì)同一批號(hào)地龍注射液制備6份供試品溶液測(cè)定，其RSD均小 于1. 5%，對(duì)同一批號(hào)地龍注射液連續(xù)5次測(cè)定，其RSD均小于0. 7%。

【具體實(shí)施方式】
[0010] 下面結(jié)合本發(fā)明實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明實(shí)施例中的技術(shù)方案進(jìn)行清楚、完整地描述，顯 然，所描述的實(shí)施例僅僅是本發(fā)明一部分實(shí)施例，而不是全部的實(shí)施例。基于本發(fā)明中的實(shí) 施例，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在沒有作出創(chuàng)造性勞動(dòng)前提下所獲得的所有其它實(shí)施例，都屬 于本發(fā)明保護(hù)的范圍。
[0011] 儀器與試藥 儀器：Waters e2695 高效液相色譜儀，Waters 2489UV/Visible 檢測(cè)器，Empowe 3 工 作站；瑞士 METTLER AE-240電子天平。色譜柱：Waters Symmetry C18或C8反相色譜柱， 5 μ m，4. 6X 150mm (優(yōu)選 C18 反相色譜柱：No :WAT045905, No :WAT054448) 試藥：地龍注射液(博羅先鋒藥業(yè)有限公司生產(chǎn)批號(hào)060501等20批);地龍注射液廣地 龍陰性制劑（自制）；丙氨酸、纈氨酸、鹽酸賴氨酸、異亮氨酸、亮氨酸對(duì)照品（中國藥品生物 制品檢定所，624-200104);乙腈為色譜純，水為超純水，其它試劑均為分析純。
[0012] 實(shí)施例1地龍注射液氨基酸含量測(cè)定 測(cè)定地龍注射液中五種氨基酸的含量，五種氨基酸分別為丙氨酸、纈氨酸、鹽酸賴氨 酸、異亮氨酸、亮氨酸。
[0013] 測(cè)定步驟為： 51、 色譜條件：C18反相色譜柱，柱溫：37°C，檢測(cè)波長(zhǎng)248nm，流速0.8ml/min梯度洗 脫，流動(dòng)相A為5. Ommol/L七氟丁酸的0. 7%三氟乙酸水溶液，流動(dòng)相B為60%乙腈水溶 液，洗脫液流速為 Omin 100%A，0.5min 98. 5%A, IOmin 90%A，15min 67%A, 20min 20%A, 25min 0%A ； 52、 對(duì)照品溶液的配制：精密稱取105°C干燥3h的丙氨酸對(duì)照品90. 79mg、纈氨酸對(duì)照 品39. 94mg、鹽酸賴氨酸對(duì)照品32. 53mg、異亮氨酸對(duì)照品30. 87mg、亮氨酸對(duì)照品60. 28mg, 另取酪氨酸I. 3g，置于同一 IOOml量瓶中加少量0. lmol/L鹽酸溶液溶解，加水稀釋至刻度， 且再精密量取5ml，置IOOrnl量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻，即得對(duì)照品溶液； 53、 供試品溶液的配制：取地龍注射液五支，混勻，精密量取5ml，置IOOrnl量瓶中，加水 稀釋至刻度，搖勻，即得供試品溶液； S4、測(cè)定：精密量取對(duì)照品溶液與供試品溶液各10 μ 1注入反相液相色譜儀，進(jìn)行反相 液相色譜測(cè)定分析。
[0014] 取批號(hào)060501等20批進(jìn)行地龍注射液中五種氨基酸含量的測(cè)定，測(cè)定結(jié)果見表 Io
[0015] 表1地龍注射液的五種氨基酸含量測(cè)定結(jié)果

【權(quán)利要求】
1. 一種同時(shí)測(cè)定地龍注射劑中五種氨基酸含量的PR-HPLC測(cè)定方法，其特征在于，包 含如下步驟： 51、 色譜條件：C18或C8反相色譜柱，柱溫：37°C，檢測(cè)波長(zhǎng)248nm，流速0. 8ml/min梯 度洗脫，流動(dòng)相A為5. Ommol/L七氟丁酸的0. 7%三氟乙酸水溶液，流動(dòng)相B為60%乙腈水 溶液，洗脫液流速為 Omin 100%A，0.5min 98.5%A, lOmin 90%A，15min 67%A, 20min 20%A, 25min 0%A ； 52、 對(duì)照品溶液的配制：精密稱取丙氨酸對(duì)照品90. 79mg、繳氨酸對(duì)照品39. 94mg、鹽 酸賴氨酸對(duì)照品32. 53mg、異亮氨酸對(duì)照品30. 87mg、亮氨酸對(duì)照品60. 28mg，另取酪氨酸 1. 3g，加入0. lmol/L鹽酸溶液溶解，用水定容于容量瓶，得對(duì)照品溶液； 53、 供試品溶液的配制：取地龍注射液五支，混勻，用水定容于容量瓶，得供試品溶液； 54、 測(cè)定：精密量取對(duì)照品溶液與供試品溶液各10 yl注入反相液相色譜儀，進(jìn)行反相 液相色譜測(cè)定分析。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述同時(shí)測(cè)定地龍注射劑中五種氨基酸含量的PR-HPLC測(cè)定方 法，其特征在于，步驟S2具體包括：精密稱取105°C干燥3h的丙氨酸對(duì)照品90. 79mg、纈氨 酸對(duì)照品39. 94mg、鹽酸賴氨酸對(duì)照品32. 53mg、異亮氨酸對(duì)照品30. 87mg、亮氨酸對(duì)照品 60. 28mg，另取酪氨酸1. 3g，置于同一 100ml量瓶中加少量0. lmol/L鹽酸溶液溶解，加水稀 釋至刻度，且再精密量取5ml，置100ml量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻，即得對(duì)照品溶液。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述同時(shí)測(cè)定地龍注射劑中五種氨基酸含量的PR-HPLC測(cè)定方法， 其特征在于，步驟S3具體包括：取地龍注射液五支，混勻，精密量取5ml，置100ml量瓶中， 加水稀釋至刻度，搖勻，即得供試品溶液。
【文檔編號(hào)】G01N30/02GK104391053SQ201410592686
【公開日】2015年3月4日 申請(qǐng)日期:2014年10月30日 優(yōu)先權(quán)日:2014年10月30日
【發(fā)明者】任宏, 李冠儒, 謝作君 申請(qǐng)人:廣東新峰藥業(yè)股份有限公司