本發(fā)明涉及飼料加工
技術(shù)領(lǐng)域：
，特別涉及一種棉粕蛋白飼料的制備方法。
背景技術(shù)：
：棉粕是棉籽油品加工的副產(chǎn)物，我國(guó)每年棉籽油料加工產(chǎn)出大量的棉籽餅粕，棉粕中粗蛋白含量豐富，同時(shí)還含有較高的纖維素和豐富的磷和b族維生素，是一種既經(jīng)濟(jì)而又有效的植物蛋白源，開(kāi)發(fā)潛力巨大。但是，由于棉粕中含有一些植物生存、繁殖所必需的抗?fàn)I養(yǎng)因子，例如游離棉酚、低聚糖(α-半乳糖苷)、植酸以及環(huán)丙烯脂肪酸等，這些抗?fàn)I養(yǎng)因子的存在會(huì)危害動(dòng)物的健康成長(zhǎng)，另外，棉粕中粗蛋白含量高，但蛋白質(zhì)品質(zhì)較差，而且蛋氨酸等必需氨基酸含量低且不平衡，使棉粕蛋白的飼用價(jià)值的應(yīng)用范圍受到限制?，F(xiàn)有技術(shù)一般都集中在除去或降解棉粕中的游離棉酚，但對(duì)于除去原料中的其他抗?fàn)I養(yǎng)因子的考慮甚少，有關(guān)綜合考慮產(chǎn)品的蛋白質(zhì)含量、氨基酸配比的合理性的報(bào)道更是鮮見(jiàn)。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的主要目的是提出一種棉粕蛋白飼料的制備方法，旨在提高棉粕中除游離棉酚外的其他抗?fàn)I養(yǎng)因子的脫除率。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提出的一種棉粕蛋白飼料的制備方法，包括如下步驟：步驟s1、將粉碎后的棉粕與水均勻混合后，蒸煮以形成待發(fā)酵物料；步驟s2、將所述待發(fā)酵物料冷卻，接種黑曲霉(aspergillusniger)和酒用活性干酵母(saccharomycescerevisiae)，進(jìn)行先期固態(tài)發(fā)酵，再接種枯草芽孢桿菌(bacillussubtilis)后發(fā)酵，形成固態(tài)發(fā)酵初物料；步驟s3、取所述固態(tài)發(fā)酵初物料，加入黃色短桿菌(brevibacteriumflavum)發(fā)酵液，混合均勻后靜置，制得棉粕蛋白飼料。優(yōu)選地，步驟s1包括：取粉碎后的棉粕100份(質(zhì)量份數(shù))與水混合后蒸煮，其中，所述棉粕與水的重量體積比為5:4～1:1，蒸煮溫度為120～122℃，蒸煮時(shí)間為15～20min。優(yōu)選地，在步驟s2中：所述黑曲霉的接種量為0.05～1％，所述酒用活性干酵母的接種量為0.05～0.5％，所述先期固態(tài)發(fā)酵的發(fā)酵溫度為25～35℃，發(fā)酵時(shí)間為15～60h。優(yōu)選地，在步驟s2中：所述枯草芽孢桿菌的接種量為0.2～1％，發(fā)酵溫度為25～35℃，發(fā)酵時(shí)間為30～72h。優(yōu)選地，步驟s3包括：取棉粕(100份)經(jīng)固態(tài)發(fā)酵后的所述固態(tài)初物料，加入所述黃色短桿菌發(fā)酵液，混合均勻后靜置，其中，所述黃色短桿菌發(fā)酵液的質(zhì)量份數(shù)為2～5份。優(yōu)選地，在步驟s3之前，還包括如下步驟：步驟s31、將黃色短桿菌菌種接種至斜面培養(yǎng)基中，于30～32℃培養(yǎng)24h；步驟s32、將步驟s31中培養(yǎng)的菌種接種至搖瓶種子培養(yǎng)基中，往復(fù)搖床轉(zhuǎn)速120r/min，振幅8cm，于30～32℃培養(yǎng)12h；步驟s33、將步驟s32中培養(yǎng)的菌種接種至搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基中，往復(fù)搖床轉(zhuǎn)速120r/min，振幅8cm，于30～32℃培養(yǎng)至黃色短桿菌種子濃度不低于109個(gè)/ml；步驟s34、將步驟s33中培養(yǎng)的所述黃色短桿菌種子接入發(fā)酵罐，通氣量為2～3l/min，攪拌轉(zhuǎn)速為200～600r/min，ph值為6.7～6.8，于30～32℃發(fā)酵60～72h，制得所述黃色短桿菌發(fā)酵液。優(yōu)選地，在步驟s31中，所述斜面培養(yǎng)基包括以下質(zhì)量百分比含量的成分：牛肉膏或酵母膏1％、蛋白胨1％、nacl0.5％、瓊脂2％以及水95.5％；所述斜面培養(yǎng)基的ph值為7.0～7.2，于0.1mpa壓力下滅菌20min。優(yōu)選地，在步驟s32中，所述搖瓶種子培養(yǎng)基包括以下質(zhì)量百分比含量的成分：葡萄糖2～2.5％、玉米漿2.5～4.0％、硫酸銨0.4～0.6％、碳酸鈣1％、k2hpo40.1％、mgso4·7h2o0.05％以及水91.75～93.95％；所述搖瓶種子培養(yǎng)基的ph值為7.0～7.2，于0.1mpa壓力下滅菌20min。優(yōu)選地，在步驟s33中，所述搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基包括以下質(zhì)量百分比含量的成分：糖蜜12～15％、硫酸銨2.2～2.8％、豆粕水解液4％、生物素300～500μg/l、k2hpo40.1％、mgso4·7h2o0.05％以及碳酸鈣4％，其余為水；所述搖瓶種子培養(yǎng)基的ph值為7.0～7.2，于0.07mpa壓力下滅菌7～10min。優(yōu)選地，在步驟s34中，所述發(fā)酵罐中以糖蜜為原料，初糖濃度為120～150g/l，且每隔4h監(jiān)測(cè)殘?zhí)菨舛龋?dāng)殘?zhí)菨舛冉抵?5g/l時(shí)，流加糖蜜，發(fā)酵結(jié)束前5h，停止流加糖蜜。本發(fā)明技術(shù)方案中，通過(guò)先接種黑曲霉和酒用活性干酵母進(jìn)行協(xié)同發(fā)酵，再接種枯草芽孢桿菌進(jìn)行發(fā)酵，形成固態(tài)發(fā)酵初物料，不僅有效地提高了棉粕中的蛋白質(zhì)含量，還能將棉粕中的α-半乳糖苷、植酸等抗?fàn)I養(yǎng)因子徹底降解；通過(guò)向固態(tài)發(fā)酵初物料中加入黃色短桿菌發(fā)酵液，大幅降低了固態(tài)發(fā)酵初物料中的游離棉酚含量，而且改善了發(fā)酵棉粕中的氨基酸配比，提高了棉粕的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。附圖說(shuō)明為了更清楚地說(shuō)明本發(fā)明實(shí)施例或現(xiàn)有技術(shù)中的技術(shù)方案，下面將對(duì)實(shí)施例或現(xiàn)有技術(shù)描述中所需要使用的附圖作簡(jiǎn)單地介紹，顯而易見(jiàn)地，下面描述中的附圖僅僅是本發(fā)明的一些實(shí)施例，對(duì)于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來(lái)講，在不付出創(chuàng)造性勞動(dòng)的前提下，還可以根據(jù)這些附圖示出的結(jié)構(gòu)獲得其他的附圖。圖1為本發(fā)明提供的棉粕蛋白飼料的制備方法的一實(shí)施例的流程示意圖；圖2為圖1提供的棉粕蛋白飼料的制備方法中黃色短桿菌發(fā)酵液制備方法的流程示意圖；圖3為測(cè)定本發(fā)明制備的棉粕蛋白飼料中游離棉酚含量時(shí)吸光度對(duì)游離棉酚質(zhì)量的關(guān)系圖；圖4為測(cè)定本發(fā)明制備的棉粕蛋白飼料中植酸含量時(shí)吸光度對(duì)磷含量的關(guān)系圖。本發(fā)明目的的實(shí)現(xiàn)、功能特點(diǎn)及優(yōu)點(diǎn)將結(jié)合實(shí)施例，參照附圖做進(jìn)一步說(shuō)明。具體實(shí)施方式下面將結(jié)合本發(fā)明實(shí)施例中的附圖，對(duì)本發(fā)明實(shí)施例中的技術(shù)方案進(jìn)行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實(shí)施例僅僅是本發(fā)明的一部分實(shí)施例，而不是全部的實(shí)施例?；诒景l(fā)明中的實(shí)施例，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在沒(méi)有作出創(chuàng)造性勞動(dòng)前提下所獲得的所有其他實(shí)施例，都屬于本發(fā)明保護(hù)的范圍。需要說(shuō)明，若本發(fā)明實(shí)施例中有涉及方向性指示(諸如上、下、左、右、前、后……)，則該方向性指示僅用于解釋在某一特定姿態(tài)(如附圖所示)下各部件之間的相對(duì)位置關(guān)系、運(yùn)動(dòng)情況等，如果該特定姿態(tài)發(fā)生改變時(shí)，則該方向性指示也相應(yīng)地隨之改變。另外，若本發(fā)明實(shí)施例中有涉及“第一”、“第二”等的描述，則該“第一”、“第二”等的描述僅用于描述目的，而不能理解為指示或暗示其相對(duì)重要性或者隱含指明所指示的技術(shù)特征的數(shù)量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隱含地包括至少一個(gè)該特征。另外，各個(gè)實(shí)施例之間的技術(shù)方案可以相互結(jié)合，但是必須是以本領(lǐng)域普通技術(shù)人員能夠?qū)崿F(xiàn)為基礎(chǔ)，當(dāng)技術(shù)方案的結(jié)合出現(xiàn)相互矛盾或無(wú)法實(shí)現(xiàn)時(shí)應(yīng)當(dāng)認(rèn)為這種技術(shù)方案的結(jié)合不存在，也不在本發(fā)明要求的保護(hù)范圍之內(nèi)。針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中存在的棉粕蛋白含量偏低，除游離棉酚外的其他抗?fàn)I養(yǎng)因子脫除率低，生產(chǎn)成本偏高的缺陷，本發(fā)明提出一種棉粕蛋白飼料的制備方法，如圖1所示，包括如下步驟：步驟s1、將粉碎后的棉粕與水均勻混合后，蒸煮以形成待發(fā)酵物料；可選地，步驟s1包括：取粉碎后的棉粕100份(質(zhì)量份數(shù))與水混合后蒸煮，其中，所述棉粕與水的重量體積比為5:4～1:1，蒸煮溫度為120～122℃，蒸煮時(shí)間為15～20min。步驟s2、將所述待發(fā)酵物料冷卻，接種黑曲霉和酒用活性干酵母，進(jìn)行先期固態(tài)發(fā)酵，再接種枯草芽孢桿菌后發(fā)酵，形成固態(tài)發(fā)酵初物料；可選地，所述黑曲霉的接種量為0.05～1％，所述酒用活性干酵母的接種量為0.05～0.5％，所述先期固態(tài)發(fā)酵的發(fā)酵溫度為25～35℃，發(fā)酵時(shí)間為15～60h；所述枯草芽孢桿菌的接種量為0.2～1％，發(fā)酵溫度為25～35℃，發(fā)酵時(shí)間為30～72h。通過(guò)所述黑曲霉與所述酒用活性干酵母先期協(xié)同發(fā)酵，發(fā)酵期間所述黑曲霉除分泌纖維素和半纖維素酶外，還分泌各種淀粉酶類(lèi)，將纖維素降解成可發(fā)酵性糖，被菌體利用，提高了蛋白質(zhì)含量；所述酒用活性干酵母具有利用α-半乳糖苷等低聚糖作為唯一碳源的基因，同時(shí)還能分泌降解植酸的酶類(lèi)，在先期發(fā)酵階段，棉粕蛋白含量得到提高，低聚糖(α-半乳糖苷)、植酸等抗?fàn)I養(yǎng)因子完全降解，游離棉酚含量也有所降低。同時(shí)，由于棉粕中的纖維素被降解，有利于動(dòng)物的消化與吸收，進(jìn)而提高了所述棉粕蛋白飼料的飼用價(jià)值。然后，在接種所述枯草芽孢桿菌的后發(fā)酵階段，所述棉粕蛋白含量得到進(jìn)一步提高，但是由于所述枯草芽孢桿菌在發(fā)酵期間需消耗大量氧氣以維持其生長(zhǎng)與繁殖，進(jìn)而會(huì)剝奪所述黑曲霉以及所述酒用活性干酵母生長(zhǎng)繁殖所需要的氧氣，抑制它們生長(zhǎng)，故所述枯草芽孢桿菌不宜與所述黑曲霉、所述酒用活性干酵母同時(shí)接種。步驟s3、取所述固態(tài)發(fā)酵初物料，加入黃色短桿菌發(fā)酵液，混合均勻后靜置，制得棉粕蛋白飼料?？蛇x地，步驟s3包括：取棉粕(100份)經(jīng)固態(tài)發(fā)酵后的所述固態(tài)初物料，加入所述黃色短桿菌發(fā)酵液，混合均勻后靜置，其中，所述黃色短桿菌發(fā)酵液的質(zhì)量份數(shù)為2～5份，將所述固態(tài)發(fā)酵初物料與所述黃色短桿菌發(fā)酵液混合均勻后靜置一段時(shí)間，讓所述黃色短桿菌發(fā)酵液與所述固態(tài)發(fā)酵初物料充分反應(yīng)，以去除棉粕中的游離棉酚，即可得到棉粕蛋白飼料。由于形成的固態(tài)發(fā)酵初物料中的賴(lài)氨酸含量嚴(yán)重不足，氨基酸配比也不均衡，而且游離棉酚的含量還需要進(jìn)一步減少，因此在本發(fā)明中，還需要向形成的固態(tài)發(fā)酵初物料中加入黃色短桿菌發(fā)酵液，通過(guò)賴(lài)氨酸的ε-位上的氨基與游離棉酚的活性醛基快速結(jié)合，使游離棉酚的毒性能夠快速喪失，以降低其中的游離棉酚的含量。而且由于黃色短桿菌發(fā)酵液中除含有賴(lài)氨酸外，還含有其他氨基酸，可以調(diào)整固態(tài)發(fā)酵初物料中的氨基酸配比，使氨基酸配比更為均衡合理，其營(yíng)養(yǎng)價(jià)值更接近于豆粕，從而可以提高棉粕在混合飼料中的配比，提高產(chǎn)品的附加值。同時(shí)，黃色短桿菌發(fā)酵液中殘存的糖蜜等營(yíng)養(yǎng)成分能增強(qiáng)動(dòng)物的適口感，促進(jìn)動(dòng)物采食，進(jìn)而提高配合飼料中發(fā)酵棉粕所占的比例。最后，為便于延長(zhǎng)產(chǎn)品的壽命并且方便運(yùn)輸，將制得的棉粕蛋白飼料進(jìn)行通風(fēng)干燥并冷卻包裝，具體地，于50～85℃通風(fēng)干燥至含水量低于15％，然后冷卻包裝，即可得到產(chǎn)品。在本發(fā)明中，步驟s3中的所述黃色短桿菌發(fā)酵液的制備方法如圖2所示，即在步驟s3之前，還包括如下步驟：步驟s31、斜面培養(yǎng)：將黃色短桿菌菌種接種至斜面培養(yǎng)基中，于30～32℃培養(yǎng)24h；可選地，所述斜面培養(yǎng)基包括以下質(zhì)量百分比含量的成分：牛肉膏或酵母膏1％、蛋白胨1％、nacl0.5％、瓊脂2％以及水95.5％；調(diào)節(jié)所述斜面培養(yǎng)基的ph值至7.0～7.2，于0.1mpa壓力下滅菌20min，將所述黃色短桿菌菌種接種至所述斜面培養(yǎng)基上，以?xún)?yōu)化并保藏菌種。步驟s32、搖瓶培養(yǎng)：將步驟s31中培養(yǎng)的菌種接種至搖瓶種子培養(yǎng)基中，往復(fù)搖床轉(zhuǎn)速120r/min，振幅8cm，于30～32℃培養(yǎng)12h；可選地，所述搖瓶種子培養(yǎng)基包括以下質(zhì)量百分比含量的成分：葡萄糖2～2.5％、玉米漿2.5～4.0％、硫酸銨0.4～0.6％、碳酸鈣(預(yù)先干熱滅菌)1％、k2hpo40.1％、mgso4·7h2o0.05％以及水91.75～93.95％調(diào)節(jié)；所述搖瓶種子培養(yǎng)基的ph值至7.0～7.2，于0.1mpa壓力下滅菌20min。具體地，將所述搖瓶培養(yǎng)基加入到體積容量為500ml的三角瓶中，種子裝液量為100ml，種子培養(yǎng)12h，使菌種進(jìn)一步擴(kuò)大。步驟s33、搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)：將步驟s32中培養(yǎng)的菌種接種至搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基中，往復(fù)搖床轉(zhuǎn)速120r/min，振幅8cm，于30～32℃培養(yǎng)至黃色短桿菌種子濃度不低于109個(gè)/ml；可選地，所述搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基包括以下質(zhì)量百分比含量的成分：糖蜜12～15％、硫酸銨2.2～2.8％、豆粕水解液4％、生物素300～500μg/l、k2hpo40.1％、mgso4·7h2o0.05％以及碳酸鈣(預(yù)先干熱滅菌)4％，其余為水；所述搖瓶種子培養(yǎng)基的ph值為7.0～7.2，于0.07mpa壓力下滅菌7～10min。具體地，將所述搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基加入到體積容量為500ml的三角瓶中，發(fā)酵液裝液量為25ml，培養(yǎng)至所述黃色短桿菌種子的濃度不低于109個(gè)/ml。步驟s34、發(fā)酵罐發(fā)酵：將步驟s33中培養(yǎng)的所述黃色短桿菌種子接入發(fā)酵罐，通氣量為2～3l/min，攪拌轉(zhuǎn)速為200～600r/min，ph值為6.7～6.8，于30～32℃發(fā)酵60～72h，制得所述黃色短桿菌發(fā)酵液?？蛇x地，所述發(fā)酵罐中以糖蜜為原料，初糖濃度為120～150g/l，且每隔4h監(jiān)測(cè)殘?zhí)菨舛?，?dāng)殘?zhí)菨舛冉抵?5g/l時(shí)，流加糖蜜，發(fā)酵結(jié)束前5h，停止流加糖蜜，整個(gè)發(fā)酵時(shí)間控制在60～72h，最終制得所述黃色短桿菌發(fā)酵液，其中，所述黃色短桿菌種子接入所述發(fā)酵罐的接種量為10％。實(shí)施例1：準(zhǔn)備材料如下：將黃色短桿菌菌種依次通過(guò)上述斜面培養(yǎng)、搖瓶培養(yǎng)、搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)以及發(fā)酵罐發(fā)酵制備黃色短桿菌發(fā)酵液，備用；將干棉粕粉碎，備用。待發(fā)酵物料制備：取干棉粕10kg，按100:100重量體積比加水，混合均勻后于121℃蒸15min，以形成待發(fā)酵物料；固態(tài)發(fā)酵初物料制備：將待發(fā)酵物料(按棉粕干物料重)接種0.4％黑曲霉和0.05％酒用活性干酵母，先期固態(tài)發(fā)酵27h，再接種1％枯草芽孢桿菌后發(fā)酵30h，形成固態(tài)發(fā)酵初物料，其中，發(fā)酵溫度為30℃；棉粕蛋白飼料制備：取固態(tài)發(fā)酵初物料(按100份干棉粕固態(tài)發(fā)酵后形成的初物料取樣)，加入黃色短桿菌發(fā)酵液0.3kg，混合均勻后靜置1h，于70℃通風(fēng)干燥，至物料含水量低于15％，得到所述棉粕蛋白飼料。實(shí)施例2：實(shí)施例2的材料準(zhǔn)備同實(shí)施例1。待發(fā)酵物料制備：取干棉粕10kg，按100:80重量體積比加水，混合均勻后于121℃蒸煮15min，以形成待發(fā)酵物料；固態(tài)發(fā)酵初物料制備：將待發(fā)酵物料(按棉粕干物料重)接種0.2％黑曲霉和0.2％酒用活性干酵母，先期固態(tài)發(fā)酵36h，再接種0.5％枯草芽孢桿菌后發(fā)酵60h，形成固態(tài)發(fā)酵初物料，其中，發(fā)酵溫度為30℃；棉粕蛋白飼料制備：取固態(tài)發(fā)酵初物料(按100份干棉粕固態(tài)發(fā)酵后形成的初物料取樣)，加入黃色短桿菌發(fā)酵液0.5kg，混合均勻后靜置3h，于50℃通風(fēng)干燥，至物料含水量低于15％，得到所述棉粕蛋白飼料。實(shí)施例3：實(shí)施例3的材料準(zhǔn)備同實(shí)施例1。待發(fā)酵物料制備：取干棉粕1噸，按100:100重量體積比加水，混合均勻后于121℃蒸煮20min，以形成待發(fā)酵物料；固態(tài)發(fā)酵初物料制備：將待發(fā)酵物料(按棉粕干物料重)接種0.05％黑曲霉和0.1％酒用活性干酵母，先期固態(tài)發(fā)酵60h，再接種0.8％枯草芽孢桿菌后發(fā)酵72h，形成固態(tài)發(fā)酵初物料，其中，發(fā)酵溫度為34℃；棉粕蛋白飼料制備：取固態(tài)發(fā)酵初物料(按100份干棉粕固態(tài)發(fā)酵后形成的初物料取樣)，加入黃色短桿菌發(fā)酵液0.05噸，混合均勻后靜置3h，于75℃通風(fēng)干燥，至物料含水量低于15％，得到所述棉粕蛋白飼料。實(shí)施例4：實(shí)施例4的材料準(zhǔn)備同實(shí)施例1。待發(fā)酵物料制備：取機(jī)械粉碎后的干棉粕10噸，按100:100重量體積比加水，混合均勻后于121℃蒸煮20min，以形成待發(fā)酵物料；固態(tài)發(fā)酵初物料制備：將待發(fā)酵物料(按棉粕干物料重)接種0.4％黑曲霉和0.1％酒用活性干酵母，先期固態(tài)發(fā)酵20h，再接種0.2％枯草芽孢桿菌后發(fā)酵60h，形成固態(tài)發(fā)酵初物料，其中，發(fā)酵溫度為25℃；棉粕蛋白飼料制備：取固態(tài)發(fā)酵初物料(按100份干棉粕固態(tài)發(fā)酵后形成的初物料取樣)，加入黃色短桿菌發(fā)酵液0.3噸，混合均勻后靜置3h，于75℃通風(fēng)干燥，至物料含水量低于15％，得到所述棉粕蛋白飼料。實(shí)施例5：實(shí)施例5的材料準(zhǔn)備同實(shí)施例1。待發(fā)酵物料制備：取機(jī)械粉碎后的干棉粕100噸，按100:100重量體積比加水，混合均勻后于121℃蒸煮20min，以形成待發(fā)酵物料；固態(tài)發(fā)酵初物料制備：將待發(fā)酵物料(按棉粕干物料重)接種1％黑曲霉和0.5％酒用活性干酵母，先期固態(tài)發(fā)酵15h，再接種0.2％枯草芽孢桿菌后發(fā)酵48h，形成固態(tài)發(fā)酵初物料，其中，發(fā)酵溫度為25℃；棉粕蛋白飼料制備：取固態(tài)發(fā)酵初物料(按100份干棉粕固態(tài)發(fā)酵后形成的初物料取樣)，加入黃色短桿菌發(fā)酵液2噸，混合均勻后靜置3h，于75℃通風(fēng)干燥，至物料含水量低于15％，得到所述棉粕蛋白飼料。對(duì)實(shí)施例1至實(shí)施例5制備的所述棉粕蛋白飼料的各項(xiàng)參數(shù)進(jìn)行測(cè)試，包括蛋白含量、游離棉酚含量、低聚糖含量以及植酸含量，其中，蛋白含量、游離棉酚含量、低聚糖含量以及植酸含量的測(cè)定方法如下：1)蛋白含量測(cè)定(參照凱氏定氮法)測(cè)試原理：棉粕中的蛋白質(zhì)為含氮的有機(jī)化合物，需將棉粕中的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)化為銨鹽定量。先將棉粕中的蛋白質(zhì)與濃硫酸和催化劑一同加熱消化，使棉粕中的蛋白質(zhì)分解，分解得到的氨氣和濃硫酸反應(yīng)生成硫酸銨；然后再進(jìn)行堿化蒸餾，使氨游離出來(lái)；游離出來(lái)的氨經(jīng)硼酸吸收后，再用0.01mol/l的hcl標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定，通過(guò)hcl溶液的消耗量以及化學(xué)計(jì)量數(shù)算出蛋白-n和銨鹽-n總量。a、測(cè)定總氮含量準(zhǔn)確稱(chēng)取棉粕飼料樣品0.5g(不妨令之為m1)，置于消化管中，加入0.22gk2so4和cuso4的混合試劑(其中，k2so4和cuso4的質(zhì)量比為3:1)、5ml蒸餾水以及15ml濃硫酸在通風(fēng)櫥中進(jìn)行消化，消化時(shí)先用小火消化至有白煙冒出，再加大火力消化至消化液變?yōu)樗{(lán)綠色，停止消化。再將消化液冷至室溫，沿消化管壁緩緩加入35ml蒸餾水搖勻，搖勻后用玻璃棒引流至100ml容量瓶中，并用少量水將消化管中殘留的消化液洗出，加水定容至刻度線(xiàn)。取5ml待測(cè)樣品倒入凱氏定氮裝置蒸餾器的反應(yīng)室內(nèi)，在尾氣出口接裝有20ml濃度為2％的硼酸溶液的燒杯，硼酸溶液中滴加3滴溴甲酚綠-甲基紅指示劑，待圓底燒瓶中的水沸騰后將蒸汽出口管接在蒸餾器上，并通入冷凝水，取5ml濃度為40％的naoh溶液快速倒入反應(yīng)室內(nèi)，用玻璃塞塞住溶液入口，并液封。當(dāng)硼酸溶液由紅色變?yōu)榫G色時(shí)再蒸餾8min，將尾氣吸收液倒入250ml錐形瓶中，用少量蒸餾水將燒杯中殘留的吸收液洗出。然后將吸收液用0.01mol/l的hcl標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行滴定，當(dāng)溶液變?yōu)闇\紅色即停止滴定。根據(jù)hcl標(biāo)準(zhǔn)溶液消耗的體積計(jì)算出棉粕飼料樣品中包括蛋白質(zhì)-n和銨鹽氮總量a。b、nh4+氮含量測(cè)試取棉粕飼料樣品0.5g(不妨令之為m2)，研碎，加蒸餾水20ml，混勻后于55℃的水浴中提取0.5h，然后取出、冷卻并抽濾，將濾液定容至25ml。取5.0ml濾液，倒入凱氏定氮裝置蒸餾器的反應(yīng)室內(nèi)，快速加入1％氧化鎂懸濁液入反應(yīng)室內(nèi)，用玻璃塞塞住溶液入口，并液封。其他操作同凱氏定氮法，計(jì)算出0.5g樣品中nh4+-n含量b。c、計(jì)算蛋白質(zhì)含量：蛋白含量＝[(a/m1)-(b/m2)]×6.25×100％2)游離棉酚含量測(cè)定(參照間苯三酚法)測(cè)試原理：在6.6mol/l的hcl介質(zhì)中，芳香醛與間苯三酚作用生成紫紅色化合物，在550nm處有最大吸收，其顏色深淺與芳香醛含量呈正比，據(jù)此定量。a、配制1mg/ml游離棉酚標(biāo)準(zhǔn)溶液：準(zhǔn)確稱(chēng)取0.0285g醋酸棉酚，用70％的丙酮水溶液溶解，定容至25ml，即為母液。b、0.02mg/ml游離棉酚工作液：準(zhǔn)確移取母液1ml，用70％丙酮水溶液稀釋?zhuān)ㄈ葜?0ml，即為工作液。c、顯色劑：取16.6ml濃鹽酸，加入二水間苯三酚1g，用95％乙醇定容至100ml，混勻后，轉(zhuǎn)入棕色瓶，置于4℃冰箱中保存，備用。d、游離棉酚標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)：準(zhǔn)確吸取游離棉酚工作液0、0.20、0.40、0.60、0.80、1.00ml，依次用70％丙酮水溶液定容至1.00ml，加入2ml顯色劑，搖勻，置于55℃恒溫水浴中，5min后，將反應(yīng)液轉(zhuǎn)入1cm比色皿，以未加游離棉酚試樣為空白樣，于550nm處測(cè)定吸光度(見(jiàn)表1)，以吸光度對(duì)游離棉酚質(zhì)量作圖(見(jiàn)圖3)，其線(xiàn)性回歸方程為：y＝0.0188x-0.0155，r2＝0.9953。e、棉粕飼料樣品中游離棉酚含量測(cè)定：準(zhǔn)確稱(chēng)取經(jīng)機(jī)械粉碎后且過(guò)100目篩的棉粕飼料樣品1g(精確到0.1mg)，置于具塞錐形瓶中，加入50ml70％丙酮水溶液，蓋上瓶塞，置于36℃的恒溫振蕩器中振蕩2h，以中速濾紙過(guò)濾；取濾液1ml，加入2ml顯色劑，混勻，于55℃恒溫水浴中5min，然后比色測(cè)定。每組樣品重復(fù)試驗(yàn)3次，取平均值，根據(jù)游離棉酚標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)方程計(jì)算出棉粕樣品中游離棉酚含量。表1不同含量的游離棉酚標(biāo)準(zhǔn)液的吸光度值樣品編號(hào)123456游離棉酚工作液/ml0.000.200.400.600.801.00游離棉酚質(zhì)量/μg0.004.008.0012.0016.0020.0070％丙酮水溶液/ml1.000.800.600.400.200.00吸光度0.000.0630.1230.2180.2900.3553)植酸含量測(cè)定(沉淀消解法)準(zhǔn)確稱(chēng)取研細(xì)的棉粕飼料樣品1g(精確到0.1mg)，加入10％na2so450ml，1.2％hcl50ml，置于慢速攪拌的40℃恒溫水浴鍋中，10min后抽濾，并將濾液轉(zhuǎn)移至250ml容量瓶中，用蒸餾水定容。準(zhǔn)確移取提取液10ml置于離心管中，加入1.0％fecl34ml，靜置2min，再經(jīng)過(guò)15min沸水浴，使植酸完全轉(zhuǎn)化為植酸鐵沉淀，冷至室溫后，將離心管置于4000rpm離心機(jī)離心6min后取出，棄去上清液，將沉淀用15ml5％na2so4和0.6％hcl的混合溶液洗滌，再離心，如此反復(fù)三次。最后棄去上清液，沉淀經(jīng)蒸餾水溶解后轉(zhuǎn)入消化管中進(jìn)行消化至沉淀完全消失；將消化液冷卻至室溫，沿消化管壁緩緩加入30ml蒸餾水，混勻后用玻璃棒引流轉(zhuǎn)入100ml容量瓶中，用蒸餾水定容。取2ml消化液置于具塞試管中，依次加入2ml鉬酸銨溶液、1mlna2so3、1ml對(duì)苯二酚以及14ml蒸餾水，混勻后作為待測(cè)試液?？瞻讟悠烦患酉和?，其他操作與待測(cè)樣品相同；靜置0.5h后于660nm條件下測(cè)定待測(cè)樣品的吸光度，根據(jù)磷含量標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)求出樣品植酸磷的含量，再轉(zhuǎn)化為棉粕飼料樣品中植酸含量，植酸含量的計(jì)算公式如下：式中，od為測(cè)定樣品植酸含量的吸光度；ms為棉粕飼料樣品的質(zhì)量。其中，磷標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的制作包括：a、2.85μg/ml磷標(biāo)準(zhǔn)工作液配制：稱(chēng)取磷酸二氫鉀0.0506g，用蒸餾水溶解，并定容至100ml，再?gòu)闹腥〕?.50ml，用水稀釋并定容至100ml；b、曲線(xiàn)繪制：分別移取磷標(biāo)準(zhǔn)工作溶液0、2、4、6、8、10ml，依次加入0.80mol/l硫酸溶液4ml、50g/l鉬酸銨0.4ml，用蒸餾水稀釋至50ml，搖勻；顯色20min，于660nm條件下測(cè)定吸光度，繪制吸光度對(duì)磷含量的工作曲線(xiàn)，如圖4所示，標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)為：y＝0.0028x﹣0.0026，r2＝0.9993。4)低聚糖(包括棉籽糖和水蘇糖)含量測(cè)定稱(chēng)取棉粕(或發(fā)酵棉粕)樣品用20倍體積的溫水(50～60℃)提取50min，然后10000g離心5min，取上清液，用0.22μm膜過(guò)濾。采用高效液相色譜(shimadzuseries10achromatograph(kyoto,japan))定量，使用的色譜柱為：supelcosillc-nh225cm×4.6mm(supelco,bellefonte,pa)，流動(dòng)相包括80％乙腈和20％水(體積比)，流速為1ml/min。低聚糖(包括棉籽糖和水蘇糖)通過(guò)示差折光檢測(cè)器檢測(cè)，棉籽糖和水蘇糖標(biāo)樣均為分析純。最終測(cè)定實(shí)施例1至實(shí)施例5制備的所述棉粕蛋白飼料的各參數(shù)結(jié)果如下：蛋白含量≥50％，游離棉酚含量≤30mg/kg，不含低聚糖(α-半乳糖苷)、植酸等抗?fàn)I養(yǎng)因子。說(shuō)明本發(fā)明技術(shù)方案中，通過(guò)先接種黑曲霉和酒用活性干酵母進(jìn)行協(xié)同發(fā)酵，再接種枯草芽孢桿菌進(jìn)行發(fā)酵，形成固態(tài)發(fā)酵初物料，不僅有效地提高了棉粕中的蛋白質(zhì)含量，還能將棉粕中的α-半乳糖苷、植酸等抗?fàn)I養(yǎng)因子徹底降解；通過(guò)向固態(tài)發(fā)酵初物料中加入黃色短桿菌發(fā)酵液，降低了固態(tài)發(fā)酵初物料中的游離棉酚含量，而且改善了發(fā)酵棉粕中的氨基酸配比，提高棉粕的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。以上所述僅為本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例，并非因此限制本發(fā)明的專(zhuān)利范圍，凡是在本發(fā)明的發(fā)明構(gòu)思下，利用本發(fā)明說(shuō)明書(shū)及附圖內(nèi)容所作的等效結(jié)構(gòu)變換，或直接/間接運(yùn)用在其他相關(guān)的
技術(shù)領(lǐng)域：
均包括在本發(fā)明的專(zhuān)利保護(hù)范圍內(nèi)。當(dāng)前第1頁(yè)12