一種通過三維熒光光譜優(yōu)化超聲條件提取胞外聚合物的方法
【專利摘要】一種通過三維熒光光譜優(yōu)化超聲條件提取胞外聚合物的方法屬于污水生物處理活性污泥組分分析領(lǐng)域。本發(fā)明通過三維熒光光譜圖分析活性污泥緊密附著型胞外聚合物的提取程度及細(xì)胞破裂程度，優(yōu)化超聲條件。污泥在梯度離心提取黏液和松散附著型胞外聚合物后，超聲提取緊密附著型胞外聚合物，離心或超聲后的水樣經(jīng)濾膜過濾稀釋后由三維熒光光譜儀分析。采用氙弧燈為激發(fā)光源，將掃描后得到的熒光強(qiáng)度減去水的空白熒光強(qiáng)度，得到樣品三維熒光光譜。將扣除空白后的激發(fā)波長260～280nm與發(fā)射波長360～375nm范圍內(nèi)熒光數(shù)值進(jìn)行平均，依靠可溶性微生物產(chǎn)物類蛋白物質(zhì)的平均熒光強(qiáng)度變化，評價(jià)緊密附著型胞外聚合物提取程度和細(xì)胞破碎情況的方法。
【專利說明】一種通過三維熒光光譜優(yōu)化超聲條件提取胞外聚合物的方 法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本專利屬于污水生物處理活性污泥組分分析領(lǐng)域，具體涉及一種用熒光分光光度 儀掃描超聲后提取活性污泥緊密胞外聚合物的過濾液，得到三維熒光光譜圖后，評價(jià)超聲 細(xì)胞破碎及胞外聚合物提取程度的方法，最終選擇優(yōu)化后的超聲條件提取污泥緊密胞外聚 合物。

【背景技術(shù)】
[0002] 在廢水生化處理中，活性污泥的胞外聚合物（Extracellular Polymeric Substances，EPS)是在特定廢水水質(zhì)、處理工藝、反應(yīng)裝置的運(yùn)行條件下，微生物生長代謝 中分泌、吸附、溶解的包覆在細(xì)胞外部的多聚物，包括蛋白質(zhì)、多糖、腐殖酸等。
[0003] EPS在污水處理中有重要作用：相互黏附，保持細(xì)胞的絮體結(jié)構(gòu)或者生物膜的 聚集；提供活性污泥良好的保護(hù)屏障，抵御有毒物質(zhì)及惡劣環(huán)境；保持菌膠團(tuán)或者生物 膜的水分，影響污泥沉降、過濾與脫水性能；含有大量的酶，參與廢水中污染物質(zhì)的吸 附與去除。所以，提取與分析活性污泥胞外聚合物的組成對指導(dǎo)污水生物處理有重要 意義。根據(jù)EPS與污泥細(xì)胞結(jié)合的程度，分為松散附著型胞外聚合物（Loosely Bound Extracellular Polymeric Substances, LB-EPS)及緊密附著型胞外聚合物（Tightly Bound Extracellular Polymeric Substances, TB-EPS)〇
[0004] 分層提取活性污泥胞外聚合物的方法有多種，包括樹脂提取法、熱與堿提取法、梯 度離心法和超聲提取法等。其中，離心與超聲提取無需加入其他化學(xué)試劑，操作簡單，經(jīng)濟(jì) 易行，且提取的EPS不需透析等處理即可測定，因而得到廣泛應(yīng)用。
[0005] 不同聲強(qiáng)、聲能密度、時(shí)間的超聲波作用于不同濃度的菌膠團(tuán)活性污泥，可以破壞 絮體結(jié)構(gòu)、分散細(xì)胞，使得粘在細(xì)胞表面的物質(zhì)脫落，提取緊密附著型胞外聚合物，例如各 種酶（α -葡萄糖苷酶、α -淀粉酶、蛋白酶、堿性磷酸酶和酸性磷酸酶等）。但是，超聲強(qiáng)度 與能量增大時(shí)，將破碎細(xì)菌，釋放細(xì)胞內(nèi)的營養(yǎng)物質(zhì)。因此，判斷超聲過程中緊密附著型胞 外聚合物是否提取完全及細(xì)胞是否破碎對分析活性污泥胞外聚合物十分關(guān)鍵。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的是在離心提取LB-EPS后，通過三維熒光光譜評價(jià)不同超聲條件下 TB-EPS的提取情況。胞外聚合物中含有的物質(zhì)不同，在不同激發(fā)和發(fā)射波長下有對應(yīng)的熒 光反應(yīng)。本發(fā)明的方法依靠某類蛋白質(zhì)物質(zhì)為可溶性微生物產(chǎn)物，其平均熒光強(qiáng)度變化的 特征，具有評價(jià)準(zhǔn)確，分析快速的特點(diǎn)。
[0007] 為了實(shí)現(xiàn)超聲提取緊密附著型胞外聚合物的目的，本發(fā)明采用以下方案：
[0008] 取活性污泥混合液，在4°C以2000g的離心力離心15分鐘，得到細(xì)胞黏液Slime。 將Slime倒去，加入磷酸鹽緩沖液至活性污泥混合液的原體積，在4°C以4000g的離心力離 心15分鐘，上清液即為LB-EPS。再次加入PBS至原體積后，混合均勻，在不同強(qiáng)度和不同時(shí) 間下超聲。離心或超聲后的水樣經(jīng)0. 45微米濾膜過濾稀釋后由三維熒光光譜儀分析測定。
[0009] 三維熒光光譜掃描測定條件：采用氙弧燈為激發(fā)光源，激發(fā)波長200?450nm，發(fā) 射掃描波長220?600nm，激發(fā)和發(fā)射狹縫寬度為5?15nm，激發(fā)波長掃描間隔為0. 5? 10nm，掃描速度為 900 ?1500nm/min。
[0010] 超聲樣品后的三維熒光光譜圖合成：用Wolfram Mathematica*軟件將樣品的熒光 強(qiáng)度減去同條件下蒸餾水的三維熒光值，合成3D-EEM圖。
[0011] 優(yōu)化不同超聲條件提取TB-EPS :將扣除空白后的激發(fā)波長260?280nm與發(fā)射波 長360?375nm范圍內(nèi)熒光數(shù)據(jù)進(jìn)行平均，得到類蛋白質(zhì)可溶性微生物產(chǎn)物平均熒光強(qiáng)度。 以超聲強(qiáng)度和超聲時(shí)間為平面二維坐標(biāo)，平均熒光強(qiáng)度為縱坐標(biāo)，繪制三維立體關(guān)系圖。平 均熒光強(qiáng)度突變時(shí)對應(yīng)的超聲條件為提取TB-EPS最佳條件。
[0012] 本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是：
[0013] 1、評價(jià)方式簡單易行，不需要復(fù)雜的操作過程測定化學(xué)組分，僅依靠過濾后樣品 的三維熒光光譜分析與計(jì)算過程。
[0014] 2、靈敏度高，適用于不同超聲儀器和超聲條件下對污泥胞外聚合物提取程度及細(xì) 胞破碎情況的評價(jià)。
[0015] 3、超聲及判斷過程中樣品不添加其他物質(zhì)，可以進(jìn)行后續(xù)分析檢測，例如：測定蛋 白質(zhì)總量及沉淀后再溶解進(jìn)行蛋白質(zhì)雙向電泳，研究EPS蛋白質(zhì)組學(xué)與污水處理工藝之間 的聯(lián)系。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0016] 圖1活性污泥分層提取EPS
[0017] 圖2緊密附著型胞外聚合物的熒光光譜圖
[0018] 圖3超聲時(shí)間、超聲強(qiáng)度與平均熒光強(qiáng)度的關(guān)系

【具體實(shí)施方式】
[0019] 本發(fā)明的目的在于提供一種通過三維熒光光譜優(yōu)化超聲提取胞外聚合物的方法， 判斷提取程度及細(xì)胞破碎情況的方法。
[0020] 取活性污泥混合液，在冷凍離心機(jī)中4 °C以2000g離心力工作15分鐘，得到 Slime。將Slime傾去，加入等體積憐酸鹽緩沖液PBS(137mmol/L NaCl，8. 10mmol/L Na2HPO4 · 7H20,2. 68mmol/L KC1，I. 47mmol/L KH2P04, pH 為 7. 3)，使細(xì)胞重新懸浮之后，保 持4°C以4000g離心15分鐘，上清液即為LB-EPS。再次加入PBS后混合均勻，在不同強(qiáng)度 下超聲2. 5-30分鐘。離心或超聲后的水樣經(jīng)0. 45微米濾膜過濾，所有樣品經(jīng)相同倍數(shù)稀 釋后由三維熒光光譜儀分析檢測。采用氙弧燈為激發(fā)光源，激發(fā)波長200?450nm，發(fā)射掃 描波長220?600nm，激發(fā)和發(fā)射狹縫寬度為5?15nm，激發(fā)波長掃描間隔為0· 5?10nm， 掃描速度為900?1500nm/min。
[0021] 將掃描后得到的熒光強(qiáng)度用減去水的空白熒光強(qiáng)度，合成矩陣，輸出超聲后的水 樣三維熒光光譜圖。將扣除空白后的激發(fā)波長260?280nm與發(fā)射波長360?375nm范圍 內(nèi)熒光數(shù)據(jù)進(jìn)行平均，得到可溶性微生物產(chǎn)物的類蛋白物質(zhì)平均熒光強(qiáng)度。
[0022] 以超聲強(qiáng)度和超聲時(shí)間為平面二維坐標(biāo)，平均熒光強(qiáng)度為縱坐標(biāo)，繪制關(guān)系圖。平 均熒光強(qiáng)度突變時(shí)對應(yīng)的超聲條件為提取TB-EPS最佳條件。
[0023] 實(shí)例 1
[0024] 試驗(yàn)污泥取自實(shí)驗(yàn)室連續(xù)流運(yùn)行的分段進(jìn)水MUCT工藝。處理水質(zhì)處理 北京工業(yè)大學(xué)家屬區(qū)實(shí)際生活污水，溶解性COD為85. 00-213. OOmg · I71，氨氮濃度 57. 00-74. OOmg噸4,正磷酸鹽濃度為5. 00-6. 50mg噸' 工藝裝置的運(yùn)行條件如下：水力停 留時(shí)間9小時(shí)，容積負(fù)荷0. 52KgAm3 ·(!)，污泥齡18天，污泥回流比100%，內(nèi)回流比75%。 超聲處理活性污泥樣品時(shí)，反應(yīng)器全程硝化反硝化穩(wěn)定運(yùn)行150天以上，氨氮平均去除率 為 90. 8%。
[0025] 取沉淀后的新鮮污泥10毫升，固體濃度15000mg/L。經(jīng)2000g在4°C離心15min 后，得到上清液為經(jīng)0. 45微米濾膜過濾，得到黏液Slime。在沉淀物中加入PBS補(bǔ)充到原體 積后，4°C以4000g的離心力離心15min，上清液經(jīng)0· 45微米濾膜過濾為LB-EPS。沉淀物中 再次加入PBS至10毫升后超聲處理。采用美國SONICS超聲破碎儀（130W，20kHz)，探頭直 徑2謹(jǐn)。分別在不同強(qiáng)度（20%、25%、30%、35%、40%、60%、80%、100%)下各超聲2.5、 5、7. 5、10、20、30分鐘，記錄超聲結(jié)束時(shí)，儀器所顯示的能量值。超聲后的樣品經(jīng)0. 45微米 濾膜過濾后分析測定。預(yù)處理活性污泥的方法參見圖1，之后進(jìn)行三維熒光光譜分析。
[0026] 采用脈沖氙燈作為三維熒光光譜儀的激發(fā)光源，分析過濾后經(jīng)相同稀釋倍數(shù)后的 水樣，激發(fā)波長200?400nm，發(fā)射掃描波長290?550nm，激發(fā)和發(fā)射狹縫寬度為10nm，激 發(fā)波長掃描間隔為5nm，掃描速度為1200nm/min。掃描過程添加290nm濾光片，去除二級瑞 麗散射。
[0027] 將儀器保存的不同激發(fā)和發(fā)射波長下的熒光值在進(jìn)行矩陣合成，同時(shí)減去 Milli -Q水作為空白的熒光強(qiáng)度，得到不同超聲強(qiáng)度和超聲時(shí)間下的3D -EEM圖，可以發(fā)現(xiàn) 在不同超聲時(shí)間和超聲強(qiáng)度下，可溶性微生物產(chǎn)物的類蛋白物質(zhì)有峰值（如圖2)。
[0028] 在Wen Chen等人發(fā)表的〈〈Fluorescence Excitation-Emission Matrix Regional Integration to Quantify Spectra for Dissolved Organic Matter〉〉文章中，Peak A 附 近屬于可溶性微生物產(chǎn)物的類蛋白物質(zhì)。所以，將扣除空白后的激發(fā)波長260?280nm與 發(fā)射波長360?375nm范圍內(nèi)熒光數(shù)據(jù)進(jìn)行平均，得到可溶性微生物產(chǎn)物的類蛋白物質(zhì)平 均熒光強(qiáng)度。
[0029] 以操作的不同超聲時(shí)間、超聲強(qiáng)度與類蛋白質(zhì)平均熒光強(qiáng)度做圖可知（如圖2)， 當(dāng)超聲時(shí)間小于10分鐘與超聲強(qiáng)度小于40%的時(shí)候，可溶性微生物產(chǎn)物平均熒光強(qiáng)度基 本穩(wěn)定。延長超聲時(shí)間或增大超聲強(qiáng)度都會使得可溶性微生物產(chǎn)物的類蛋白物質(zhì)平均熒光 強(qiáng)度增大。當(dāng)超聲強(qiáng)度超過80%，熒光強(qiáng)度急劇增加，表示污泥有較大程度的破裂。
[0030] 最終得出在超聲強(qiáng)度在40%時(shí)，超聲時(shí)間為10分鐘，此時(shí)超聲提取實(shí)例1使用的 活性污泥提取TB - EPS充分且細(xì)胞保持相對完整。
【權(quán)利要求】
1. 一種通過三維熒光光譜優(yōu)化超聲條件提取胞外聚合物的方法，其特征在于，包括以 下步驟： 取活性污泥混合液，在4°C以2000g的離心力離心15分鐘，得到細(xì)胞黏液Slime ;將 Slime倒去，加入磷酸鹽緩沖液至活性污泥混合液的原體積，在4°C以4000g的離心力離心 15分鐘，上清液即為LB-EPS ;再次加入PBS至原體積后，混合均勻，在不同強(qiáng)度和不同時(shí)間 下超聲；離心或超聲后的水樣經(jīng)〇. 45微米濾膜過濾稀釋后由三維熒光光譜儀分析測定； 三維熒光光譜掃描測定條件：采用氙弧燈為激發(fā)光源，激發(fā)波長200?450nm，發(fā)射掃 描波長220?600nm，激發(fā)和發(fā)射狹縫寬度為5?15nm，激發(fā)波長掃描間隔為0? 5?10nm， 掃描速度為900?1500nm/min ; 將樣品的熒光強(qiáng)度減去同條件下蒸餾水的三維熒光值，合成三維熒光光譜圖； 優(yōu)化不同超聲條件提取TB-EPS :將扣除空白后的激發(fā)波長260?280nm與發(fā)射波長 360?375nm范圍內(nèi)熒光數(shù)據(jù)進(jìn)行平均，得到類蛋白質(zhì)可溶性微生物產(chǎn)物平均熒光強(qiáng)度；以 超聲強(qiáng)度和超聲時(shí)間為平面二維坐標(biāo)，平均熒光強(qiáng)度為縱坐標(biāo)，繪制三維立體關(guān)系圖；平均 熒光強(qiáng)度突變時(shí)對應(yīng)的超聲條件為提取TB-EPS最佳條件。
【文檔編號】G01N21/64GK104316502SQ201410559720
【公開日】2015年1月28日 申請日期:2014年10月18日 優(yōu)先權(quán)日:2014年10月18日
【發(fā)明者】李夕耀, 彭永臻, 何岳蘭, 張瓊, 賈方旭 申請人:北京工業(yè)大學(xué)