一類氨基菁類熒光染料及其制備方法和應用
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及一類連接環(huán)肽cyclo(⑶）的氨基菁類焚光染料及其制備方法和應用， 該化合物同時具有腫瘤的影像診斷與靶向治療的雙功能。 技術背景
[0002] 癌癥是最迫切的公共衛(wèi)生問題，并且其統(tǒng)計數字是非常驚人的。未來腫瘤個性化 治療的巨大挑戰(zhàn)是探索改進用于病人體內局部的和分散的腫瘤細胞的早期檢測方法，這對 于癌癥的成功治療以及提高腫瘤病人的生存率是至關重要的。目前，癌癥的臨床檢測和診 斷方法主要有磁共振影像，正電子發(fā)射斷層掃描，計算機斷層掃描，X射線，超聲等，但它們 缺乏特異性和敏感性，也可能造成放射性風險。光學影像方法是一種新興的用于腫瘤檢測 的非侵入性的、實時的、高分辨的方法。光信號可以提供生物組織與腫瘤的解剖結構以及與 腫瘤代謝和生物化學相關的分子信息。在光學影像技術中，近紅外熒光影像的波長范圍在 700-1000nm，并且生物組織和器官在近紅外光譜區(qū)的吸收和自發(fā)熒光比較低，從而使背景 干擾降到最低，改善組織的穿透深度。因此，近紅外熒光影像吸引了越來越廣泛的關注。
[0003] 具有良好效果的腫瘤近紅外熒光影像需要化學和光物理性質優(yōu)異的近紅外熒光 染料。一個理想的近紅外影像熒光染料必須滿足下面的條件：發(fā)射光譜在近紅外光譜范圍 內，具有大斯托克斯位移，摩爾消光系數及量子產率高，在溶劑中、緩沖液及生理條件下的 物理化學性質穩(wěn)定，以及水溶性良好。此外，一個合格的近紅外熒光影像染料還應該具有合 適的化學官能團允許與其他特異性配體的結合。
[0004] 目前為止，幾種標記RGD環(huán)肽的近紅外熒光染料如Cy5. 5 (人ex:675nm，入eni: 694nm)，ICG(Xex:783nm，Xem:810nm)，cypate(Xex:790nm，Xem:810nm)已報道用于體內診 斷和治療。這些熒光熒光染料具有改進的受體結合親和力，增加了對腫瘤靶向的敏感性和 特異性，也闡明了構效關系及相關反應機理。但是，它們都是小斯托克斯位移的熒光染料， 無法避免診斷影像時因為發(fā)生熒光自淬滅和激發(fā)光散射引起的熒光檢測誤差。文獻中至今 從未報道過具有大斯托克斯位移并且處于近紅外區(qū)的用于腫瘤診斷影像的熒光染料。
[0005] 雖然近些年來人們對腫瘤的產生、轉移等機理的研究取得了許多進展，但因為早 期診斷不夠靈敏、特異性好的靶向藥物的缺乏以及無法進行實時有效的治療監(jiān)測，惡性腫 瘤仍然嚴重威脅著人類的健康與生命。腫瘤診斷治療學（Tumortheranostics)是最近提 出來的一種用于腫瘤診斷與治療的新方法，其核心是將腫瘤治療與實時顯影有效結合，指 導醫(yī)生不斷選擇合適的治療方案，提高腫瘤患者的生存率和生活質量，為腫瘤個體化治療 提供一種新思路。因此合成既具有腫瘤特異顯影又能用于靶向治療作用的診斷治療劑具有 十分重要的意義，目前這種雙功能熒光染料還比較少見。

【發(fā)明內容】

[0006] 本發(fā)明的目的在于提供一類用于腫瘤影像診斷與靶向治療的雙功能氨基菁類熒 光染料及其制備方法和應用。
[0007] 本發(fā)明所述的氨基菁類熒光染料，其通式如結構式I
[0008]
[0009] 結構式I中包含衍生的菁染料結構單元II和avP3整合素受體的特定配體的環(huán) 肽結構單元III;
[0010]
[0011] 當n為0時，結構單元II和結構單元III直接相連；代表性的例子是氨基菁類染料 Cy7-RGD；
[0012] 當n為1時，結構單元II和結構單元III通過連接基團R相連；R為氨基酸結構單 元，結構式從上向下-MKCH^CO-，m取1~18之間的整數（優(yōu)選情況下m取5,6);可以 得到不同碳鏈長度的氨基菁類染料，由于連接鏈較小，對于兩個關鍵部分結構單元II和III 的性能幾乎沒有影響，所以在腫瘤熒光影像診斷和靶向治療的雙功能性能上預計不會有明 顯差異。代表性的例子是染料Cy7-hex-R⑶；
[0013] 結構單元II為衍生的菁染料結構，屬于水溶性熒光分子，其光譜具有較大的斯托 克斯位移，且對正常細胞毒性較小；結構單元III為a 3整合素受體的特定配體的環(huán)肽 結構，可用于靶向定位。所述的熒光染料由結構單元II和III兩部分相連后，具有腫瘤影像 診斷與靶向治療的雙功能特性。
[0014]X為C(CH3)2、0、S或Se;
[0015] 札為11 或 0H;
[0016]R2選自C1-18 烷基、芐基或（CH2)4S03H，（CH2)5C02H。
[0017] 熒光染料的制備方法，其特征在于，包括如下步驟：
[0018] 1)在冰浴條件下將三氯氧磷用二氯甲烷溶劑稀釋0. 5-1. 5倍的混合液逐滴加入 用二氯甲烷溶劑稀釋〇. 5-1. 5倍的N，N-二甲基甲酰胺混合液中，三氯氧磷與N，N-二甲基 甲酰胺的摩爾比為1 :1~3,然后再向上述混合液中逐滴加入環(huán)已酮，三氯氧磷與環(huán)己酮的 摩爾比為1 :〇. 2~0. 7 ;反應液加熱到回流，反應3-5h，反應液倒入用大量碎冰沉淀，過濾， 獲得中間體A;
[0019] 優(yōu)選的情況下：三氯氧磷和二氯甲烷的體積比1 :1;二氯甲烷和N，N-二甲基甲酰 胺以體積比1:1混合；三氯氧磷，N，N-二甲基甲酰胺與環(huán)己酮的摩爾比為1 :1. 28:0. 25。
[0020]
[0021] 2)按摩爾比1:1~2加入原料化合物苯并雜環(huán)磺酸化合物和氫氧化鉀，再加入以 體積比1:1~2混合的甲醇：異丙醇混合液；然后進行回流反應，將反應液過濾得黃色固體 并干燥，將所得干燥產物和過量含私基團的烷基化試劑在加熱條件下回流5~20h，冷卻后 析出中間體B;
[0022] 優(yōu)選的情況下：原料化合物苯并雜環(huán)磺酸化合物和氫氧化鉀按摩爾比1:1. 5加 入；甲醇：異丙醇以體積比1:1混合；優(yōu)選的回流時間為12h;
[0023]
[0024] 3)反應瓶中按照摩爾比1:2~3加入中間體A和季銨鹽中間體B，再加入以體積 比1:2~3混合的甲苯：正丁醇混合液，經甲苯分水，在氮氣保護下回流后，去除反應溶劑、 溶解、析出、過濾、重結晶后得到Cy7 ;
[0025] 優(yōu)選的情況下：中間體A和季銨鹽中間體B以摩爾比1:2加入；甲苯：正丁醇以摩 爾比3:7混合；
[0026]
[0027] 4)按1:0. 5~3:1~10的摩爾比向反應瓶中依次加入Cy7、環(huán)肽cyclo(RGD)、 Na2C03，再加入無水DMF，于50°C、氮氣保護下反應后，反應液經析出、過濾和提純后獲得通 式I中n= 0時的化合物；
[0028] 優(yōu)選的情況下：Cy7、環(huán)肽cyclo(RGD)、Na2C03的摩爾比為1:1:1;
[0029]
[0030] 5)反應瓶中以摩爾比1:1~10加入Cy7和過量的氨基化合物RNH2，再加入無水 DMF、氮氣保護下反應結束后，反應液經析出、過濾、提純得到Cy7-NH-R;
[0031] 優(yōu)選的情況下：以摩爾比1:3加入Cy7和過量的氨基化合物RNH2;
[0032]
[0033] 6)按摩爾比1:1~2稱取Cy7-NH_R和1，1'-羰基二咪挫，再加入無水DMF，于 40°C、氮氣保護下，攪拌3~45分鐘后，降至室溫加入環(huán)肽cyclo(RGD)，Cy7-NH-R與環(huán)肽 cyclo(RGD)摩爾比1:0. 5~3,繼續(xù)攪拌反應1~5小時后，將反應液經析出、過濾、提純后 獲得通式I中n= 1時的化合物；
[0034] 優(yōu)選的情況下：按摩爾比1:1. 6稱取Cy7-NH_R和1，1' -羰基二咪唑；攪拌時間優(yōu) 選為5分鐘；加入環(huán)肽cyclo(RGD)與Cy7-NH-R摩爾比1 :1 ;
[0035]
0
[0036] 本發(fā)明的另一方面在于保護上述的氨基菁類熒光染料在制備腫瘤細胞診斷或治 療藥物中的應用，尤其是具有對神經膠質瘤細胞的特異靶向診斷和特異性毒性方面的應 用。
[0037] 本發(fā)明的氨基菁類熒光染料的具有以下三點獨特表現。一是在分子結構上，環(huán)肽 cycl〇(RGD)連接在近紅外菁染料的甲川鏈的中間位置，并且連接位點是獨特的亞胺結構， 這種結構賦予分子一定的水溶性。二是光譜性能上，中間亞胺結構賦予染料在光譜上有獨 特的大斯托克斯位移性能，具體說，代表性染料Cy7-RGD在PBS緩沖溶液中的斯托克斯位移 到達137nm。這個大斯托克斯位移性能，使得染料應用性能大幅提升，表現為熒光信號有效 避開激發(fā)光干擾，更少的生物樣品自發(fā)熒光信號的背景干擾等。三是生物性能上，這類結 構和光譜獨特的氨基菁類染料，一方面仍然具有單純環(huán)肽cyclo(RGD) -樣的結合特異性， 可以靶標結合a 3整合素受體，從而實現對于神經膠質瘤細胞的特異性診斷。另一方 面，這種中間位點連接方式，增加了染料對a 3整合素受體過度表達的腫瘤細胞（如神 經膠質瘤細胞）的毒性。例如代表性染料Cy7-R⑶對神經膠質瘤細胞U87MG的IC50值為 8. 0yM。這個結果說明這種新型染料具有對神經膠質瘤細胞的特異靶向診斷和特異性毒性 的雙重功能。
【附圖說明】
[0038] 圖1為實施例1合成的Cy7_RGD的質譜表征圖。
[0039] 圖2、圖3、圖4、圖5為實施例3中Cy7_RGD與參比化合物Cy7_hex的在乙醇和在