一種豬細(xì)小病毒滅活疫苗免疫效力評(píng)價(jià)方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種豬細(xì)小病毒滅活疫苗免疫效力評(píng)價(jià)方法，該方法是通過(guò)考察注射疫苗后機(jī)體血清抗體水平來(lái)評(píng)價(jià)的，具體技術(shù)方法是創(chuàng)新性的建立了針對(duì)PPV的ELISA抗體效價(jià)評(píng)價(jià)方法。具有操作簡(jiǎn)便、特異和敏感等特點(diǎn)，為PPV滅活苗抗體檢測(cè)提供一種有效技術(shù)手段。
【專利說(shuō)明】一種豬細(xì)小病毒滅活疫苗免疫效力評(píng)價(jià)方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及疫苗【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種豬細(xì)小病毒滅活疫苗免疫效力評(píng)價(jià)方 法。

【背景技術(shù)】
[0002] 豬細(xì)小病毒（Porcine parvovirus, PPV)引起初孕母豬的繁殖障礙性疾病，主要表 現(xiàn)為胚胎和胎豬的感染和死亡，而母豬通常表現(xiàn)為亞臨床癥狀。血清學(xué)陰性初孕母豬在妊 娠期小于70天感染PPV，可導(dǎo)致胚胎或胎豬的感染，從而產(chǎn)生流產(chǎn)、死胎、木乃伊胎等繁殖 障礙癥狀。PPV在世界各地普遍存在，目前已成為導(dǎo)致胚胎和胎豬感染和死亡的主要病原之 一。該病毒除了能直接導(dǎo)致母豬繁殖障礙外，還與仔豬的腸炎性腹瀉和仔豬皮炎相關(guān)。另 外，PPV與豬圓環(huán)病毒2型混合感染，誘發(fā)斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合癥也有報(bào)道。
[0003] 目前，所使用的豬細(xì)小病毒滅活疫苗效力的評(píng)價(jià)方法為經(jīng)典的血凝抑制試驗(yàn)。所 用到的試驗(yàn)動(dòng)物為豬或者是豚鼠，由于PPV抗體陰性豬很難找，而且試驗(yàn)成本又高，選用對(duì) PPV敏感的豚鼠來(lái)代替豬完成疫苗的效力評(píng)價(jià)得到了專家的認(rèn)可。對(duì)于豚鼠的使用，試驗(yàn)前 一定要測(cè)定豚鼠體內(nèi)是否有PPV HI抗體，只有PPV HI抗體陰性豚鼠，才能用于PPV滅活疫 苗的效力檢測(cè)，由于豚鼠接觸PPV后，體內(nèi)就會(huì)產(chǎn)生PPV抗體，因此，在每次試驗(yàn)前均應(yīng)做好 相應(yīng)的監(jiān)測(cè)篩選，保證使用PPV抗體陰性豚鼠，在每次試驗(yàn)中，也要設(shè)立陰性對(duì)照組，以防 試驗(yàn)過(guò)程中感染PPV。在這些過(guò)程中，我們要通過(guò)HI試驗(yàn)篩選和測(cè)定抗體，血清樣品需要進(jìn) 行白陶土等的處理，對(duì)血凝價(jià)的判定，4單位HA的標(biāo)定，試驗(yàn)用PBS液PH控制等，整個(gè)試驗(yàn) 過(guò)程對(duì)操作者的要求相對(duì)較高，試驗(yàn)的周期較長(zhǎng)，結(jié)果的人為因素影響較大，該方法大都只 能作為定性或相對(duì)定量，無(wú)法進(jìn)行精確定量。該過(guò)程使用的試劑和豚鼠紅細(xì)胞影響對(duì)疫苗 效果的評(píng)價(jià)。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明旨在針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的技術(shù)缺陷，提供一種豬細(xì)小病毒滅活疫苗免疫效力評(píng) 價(jià)方法，以實(shí)現(xiàn)測(cè)定周期短，結(jié)果易判斷，成本低的技術(shù)目的。
[0005] 為實(shí)現(xiàn)以上技術(shù)目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：
[0006] -種豬細(xì)小病毒滅活疫苗免疫效力評(píng)價(jià)方法，包括以下步驟：
[0007] 1)制備標(biāo)準(zhǔn)陰性血清與標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清：
[0008] 采集PPV HI < 1:8的豚鼠血清，經(jīng)白陶土溶液處理后作為標(biāo)準(zhǔn)陰性血清；選擇滅 活疫苗免疫陰性豚鼠后血清，經(jīng)白陶土溶液處理，血凝抑制價(jià)> 1:64的血清，作為標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng) 性血清；
[0009] 2)病毒抗原的濃縮、純化；
[0010] 3)抗原的包被；
[0011] 4)檢測(cè)：
[0012] 在酶標(biāo)板上加入稀釋后的待測(cè)血清100μ 1，37°C作用0. 5?1. 5h ;
[0013] 加入已經(jīng)包被PPV純化抗原，37°C作用0· 5?L 5h ;
[0014] 棄去一抗，用PBST洗滌；
[0015] 加入PBS稀釋的HRP標(biāo)記羊抗鼠IgGlOOy 1，37°C作用0· 5?1. 5h ;
[0016] 棄去二抗，用PBST洗滌；
[0017] 加入顯色液進(jìn)行避光顯色15?25min ;
[0018] 每孔加入50 μ 1終止液終止顯色；
[0019] 酶標(biāo)儀讀取0D45(I的值。
[0020] 優(yōu)選的，所述步驟2)包括以下步驟：
[0021] 利用IBRS-2或ST細(xì)胞培養(yǎng)病毒，待細(xì)胞病變達(dá)到80%以上時(shí)，收獲病毒培養(yǎng)液， 反復(fù)凍融收獲保存?zhèn)溆?；將病毒培養(yǎng)液經(jīng)4°C 5000rmp/min離心30min，去沉淀，上清液再經(jīng) 10000rpm/min 4°C離心60min，取上清；上清裝入透析袋中用0.01M pH7.4PBS緩沖液，透析 3-4d，每天換液4次；然后用PEG6000濃縮，獲得病毒濃縮液，于-20°C保存?zhèn)溆谩?br> [0022] 優(yōu)選的，步驟3)包括以下步驟：
[0023] 以陽(yáng)性血清與陰性血清在不同抗原濃度下的0D45(I值之差最大作為選定最適血清 稀釋度的標(biāo)準(zhǔn)確定最適血清稀釋度，以此稀釋度對(duì)應(yīng)的抗原稀釋度為最適抗原包被濃度； 利用上述最適血清稀釋度和最適抗原包被濃度為條件對(duì)抗原執(zhí)行包被。
[0024] 優(yōu)選的，步驟3)執(zhí)行抗原包被時(shí)抗原包被濃度為15?30ug/mL。
[0025] 優(yōu)選的，步驟3)執(zhí)行抗原包被時(shí)陽(yáng)性血清的稀釋倍數(shù)為1:4?1:16。
[0026] 在以上技術(shù)方案中當(dāng)檢測(cè)結(jié)果、即0D45(I值彡2. 1時(shí)判別為抗體陽(yáng)性、即疫苗已產(chǎn) 生效力；當(dāng)檢測(cè)結(jié)果、即〇〇45。值< 2. 1時(shí)判別為抗體陰性、即疫苗未產(chǎn)生效力。
[0027] 本發(fā)明具有如下技術(shù)優(yōu)越性：
[0028] (1)本發(fā)明的檢測(cè)方法檢測(cè)周期短，檢測(cè)到結(jié)果判定僅需3小時(shí)左右，而目前HI抑 制試驗(yàn)檢測(cè)時(shí)間需要4?6小時(shí)。
[0029] (2)該方法穩(wěn)定性優(yōu)于HI方法，操作簡(jiǎn)單，可重復(fù)性好，批間差異穩(wěn)定。
[0030] (3)特異性好，可準(zhǔn)確判定陰陽(yáng)性結(jié)果，而目前HI效價(jià)篩選小鼠時(shí)只能檢測(cè)到 < 23以下，通過(guò)本發(fā)明建立的ELISA方法可以精確的確定陰性小鼠，可以更嚴(yán)格的篩選陰 性小鼠。
[0031] (4)對(duì)抗體水平的評(píng)價(jià)，本發(fā)明建立的ELISA方法檢測(cè)結(jié)果與HI效價(jià)測(cè)定結(jié)果符 合率達(dá)到100%。
[0032] 本發(fā)明采用純化的細(xì)小病毒抗原，用病毒包被ELISA板，然后與待檢豚鼠血清抗 體及制備的豚鼠陽(yáng)性血清進(jìn)行反應(yīng)，然后與辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的豬抗豚鼠二抗反應(yīng)，最 后通過(guò)TMB顯色，同時(shí)利用購(gòu)入的國(guó)標(biāo)產(chǎn)品豬細(xì)小病毒滅活疫苗免疫豚鼠（PPV HK8)后采 血分離血清，制備出針對(duì)于PPV的陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)血清，同時(shí)采集陰性豚鼠（PPV HK8)血清作為 陰性對(duì)照，利用酶標(biāo)儀檢測(cè)結(jié)果。用于在細(xì)小病毒滅活疫苗的效力試驗(yàn)中陰性豚鼠的篩選， 以及抗體水平的評(píng)價(jià)。該方法與常規(guī)血凝抑制（HI)試驗(yàn)比較：測(cè)定周期短，結(jié)果更易判斷， 敏感性更高，特異性更好。本研究建立的ELISA具有操作簡(jiǎn)便、特異和敏感等特點(diǎn)，為PPV 滅活苗豚鼠效力試驗(yàn)抗體檢測(cè)提供一種有效技術(shù)手段。

【具體實(shí)施方式】
[0033] 實(shí)施例1豬細(xì)小病毒滅活疫苗評(píng)價(jià)用豚鼠的篩選
[0034] 1.豚鼠的購(gòu)入：購(gòu)入10只豚鼠，來(lái)源于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司。
[0035] 2.采血分離血清，分別進(jìn)行ELISA抗體和HI抗體效價(jià)的測(cè)定。
[0036] 2· 1HI抗體效價(jià)測(cè)定
[0037] 2. 1. 1抗原制備：對(duì)豚鼠紅細(xì)胞血凝價(jià)達(dá)1 :128以上且病毒含量達(dá) 1051^105(|/0.11111時(shí)，經(jīng)甲醛滅活，滅菌徹底后作為血凝抑制試驗(yàn)抗原。以50%紅細(xì)胞凝集 (HA 5CI)的抗原最高稀釋度作為抗原效價(jià)結(jié)果判定終點(diǎn)?？乖璈A5(I效價(jià)不低于1:128。
[0038] 2. 1. 2陽(yáng)性血清和陰性血清對(duì)照樣品的制造：選擇3-6月齡健康易感仔豬，采集血 清測(cè)定HI效價(jià)為0的血清作為陰性血清對(duì)照。選擇滅活疫苗（BJ-2株）免疫豬只后制備 血清，其一個(gè)抗原工作量（即4HA 5(I)進(jìn)行血凝抑制試驗(yàn)測(cè)定，HI效價(jià)> 1 :128,作為陽(yáng)性對(duì) 照血清。
[0039] 2. 1. 3豬細(xì)小病毒血凝和抗豬細(xì)小病毒血清抗體血凝抑制試驗(yàn)操作步驟
[0040] 2· 1. 3· 1血凝素工作液制備
[0041] ①血凝素凝集價(jià)測(cè)定：用生理鹽水將血凝素稀釋成不同倍數(shù)，加入0. 5%豚鼠紅 細(xì)胞懸液。將96孔板在振蕩器上搖勻，置于20-301：，20-401^11判定結(jié)果，使50%紅細(xì)胞凝 集的最高稀釋度，作為判定終點(diǎn)。
[0042] 表1血凝素凝集價(jià)測(cè)定流程數(shù)據(jù)
[0043]

【權(quán)利要求】
1. 一種豬細(xì)小病毒滅活疫苗免疫效力評(píng)價(jià)方法，其特征在于包括以下步驟： 1) 制備標(biāo)準(zhǔn)陰性血清與標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清： 采集PPV HI < 1:8的豚鼠血清，經(jīng)白陶土溶液處理后作為標(biāo)準(zhǔn)陰性血清；選擇滅活疫 苗免疫陰性豚鼠后血清，經(jīng)白陶土溶液處理，血凝抑制價(jià)> 1:64的血清，作為標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血 清； 2) 病毒抗原的濃縮、純化； 3) 抗原的包被； 4) 檢測(cè)： 在酶標(biāo)板上加入稀釋后的待測(cè)血清1〇〇μ 1，37°C作用0. 5?1. 5h ; 加入已經(jīng)包被PPV純化抗原，37°C作用0. 5?1. 5h ; 棄去一抗，用PBST洗滌； 加入PBS稀釋的HRP標(biāo)記羊抗鼠IgGlOOy 1，37°C作用0. 5?1. 5h ; 棄去二抗，用PBST洗滌； 加入顯色液進(jìn)行避光顯色15?25min ; 每孔加入50 μ 1終止液終止顯色； 酶標(biāo)儀讀取〇D45(l的值。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種豬細(xì)小病毒滅活疫苗免疫效力評(píng)價(jià)方法，其特征在于步 驟2)包括以下步驟： 利用IBRS-2或ST細(xì)胞培養(yǎng)病毒，待細(xì)胞病變達(dá)到80%以上時(shí)，收獲病毒培養(yǎng)液，反 復(fù)凍融收獲保存?zhèn)溆?；將病毒培養(yǎng)液經(jīng)4°C 5000rmp/min離心30min，去沉淀，上清液再經(jīng) 10000rpm/min 4°C離心60min，取上清；上清裝入透析袋中用0· 01M pH7. 4PBS緩沖液，透析 3-4d，每天換液4次；然后用PEG6000濃縮，獲得病毒濃縮液，于-20°C保存?zhèn)溆谩?br> 3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種豬細(xì)小病毒滅活疫苗免疫效力評(píng)價(jià)方法，其特征在于步 驟3)包括以下步驟： 以陽(yáng)性血清與陰性血清在不同抗原濃度下的〇D45(l值之差最大作為選定最適血清稀釋 度的標(biāo)準(zhǔn)確定最適血清稀釋度，以此稀釋度對(duì)應(yīng)的抗原稀釋度為最適抗原包被濃度；利用 上述最適血清稀釋度和最適抗原包被濃度為條件對(duì)抗原執(zhí)行包被。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種豬細(xì)小病毒滅活疫苗免疫效力評(píng)價(jià)方法，其特征在于步 驟3)執(zhí)行抗原包被時(shí)抗原包被濃度為15?30ug/mL。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種豬細(xì)小病毒滅活疫苗免疫效力評(píng)價(jià)方法，其特征在于步 驟3)執(zhí)行抗原包被時(shí)陽(yáng)性血清的稀釋倍數(shù)為1:4?1:16。
【文檔編號(hào)】G01N33/96GK104215781SQ201410449450
【公開(kāi)日】2014年12月17日 申請(qǐng)日期:2014年9月4日 優(yōu)先權(quán)日:2014年9月4日
【發(fā)明者】呂茂杰, 楊保收, 盛長(zhǎng)忠, 梁武 申請(qǐng)人:天津瑞普生物技術(shù)股份有限公司