豬細小病毒和/或豬圓環(huán)病毒2型的可視化基因芯片以及試劑盒的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種檢測豬細小病毒和/或豬圓環(huán)病毒2型的可視化基因芯片以及檢 測方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 隨著我國養(yǎng)豬業(yè)向集約化和規(guī)?；较虬l(fā)展，規(guī)?；i場疫病多發(fā)、多種病原混 合感染較普遍存在，給養(yǎng)豬業(yè)造成了一定損失。其中豬細小病毒（PPV)和豬圓環(huán)病毒2型 (PCV2)是引起豬繁殖障礙的兩種重要疫病病原。這兩種病臨診癥狀相似，需要進行鑒別診 斷。
[0003] 目前，對這兩種疾病的診斷多采用分離鑒定及常規(guī)的血清學方法，所需時間較長， 也有PCR技術(shù)的鑒別方法，但還沒有建立操作性強且能同時鑒別兩種病毒的方法。因此，有 必要建立能同時進行兩種疫病快速檢測的方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 為了解決上述問題，本發(fā)明提供了一種特異性強、靈敏度高、可同時檢測豬細小病 毒和/或豬圓環(huán)病毒2型的可視化基因芯片和試劑盒。
[0005] 基因芯片，是指指通過不同方法將生物分子（寡核苷酸、cDNA、genomic DNA、多肽、 抗體、抗原等）固著于硅片、玻璃片（珠）、塑料片（珠）、凝膠、尼龍膜等固相遞質(zhì)上形成的 生物分子點陣，其突出的特點是微型化、集成化、平行化和高通量。
[0006] 本發(fā)明檢測豬細小病毒和/或豬圓環(huán)病毒2型的基因芯片，它包括固相載體以及 固定在固相載體上的探針；所述探針包括SEQ ID NO :1、2所示基因片段，用于分別檢測豬 細小病毒和/或豬圓環(huán)病毒2型。
[0007] 優(yōu)選地，它還包括質(zhì)控探針，其核苷酸序列如SEQ ID NO :3和/或SEQ ID NO :4所 不O
[0008] 本發(fā)明還提供了一種檢測豬細小病毒和/或豬圓環(huán)病毒2型的試劑盒，其特征在 于：它包括前述的基因芯片以及擴增試劑；其中，擴增試劑包括SEQ ID NO :5~6、SEQ ID NO :7~8所示引物對，用于分別擴增豬細小病毒和/或豬圓環(huán)病毒2型的基因。
[0009] 優(yōu)選地，它還包括質(zhì)控探針的擴增引物，其核苷酸序列如SEQ ID NO :9~10和/ 或 SEQ ID NO :11 ~12 所示。
[0010] 優(yōu)選地，所述SEQ ID NO :5、7、9、11所示上游引物標記有生物素。
[0011] 本發(fā)明還提供了 SEQ ID NO :1、2所示基因片段在制備檢測豬細小病毒和/或豬圓 環(huán)病毒2型的基因芯片的用途。
[0012] 優(yōu)選地，所述基因芯片還包括質(zhì)控探針，其核苷酸序列如SEQ ID NO :3和/或SEQ ID NO :4 所示。
[0013] 本發(fā)明還提供了 SEQ ID NO :5~6、SEQ ID NO :7~8所示引物對以及SEQ ID NO : 1、2所示基因片段在制備檢測豬細小病毒和/或豬圓環(huán)病毒2型中的用途；其中，兩對引物 對為擴增試劑，SEQ ID NO :1、2所示基因片段為檢測探針。
[0014] 優(yōu)選地，所述試劑盒還包括質(zhì)控探針和質(zhì)控探針的擴增引物，質(zhì)控探針的核苷酸 序列如SEQ ID NO :3和/或SEQ ID NO :4所示，質(zhì)控探針的擴增引物，分別如EQ ID NO: 9 ~10、SEQ ID NO :11 ~12 所示。
[0015] 本發(fā)明基因芯片和試劑盒可以有效檢測豬細小病毒和豬圓環(huán)病毒2型病原，具有 特異性好、靈敏性高和保存期長等特點，耗時短，檢測快速，檢測結(jié)果的觀察直觀，無需昂貴 的設(shè)備，可以迅速掌握畜禽疫病的感染情況，臨床應(yīng)用前景良好。
[0016] 以下通過實施例形式的【具體實施方式】，對本發(fā)明的上述內(nèi)容作進一步的詳細說 明。但不應(yīng)將此理解為本發(fā)明上述主題的范圍僅限于以下的實施例。凡基于本發(fā)明權(quán)利要 求書記載的內(nèi)容所實現(xiàn)的技術(shù)均屬于本發(fā)明的范圍。
【附圖說明】
[0017] 圖1 :陣列排布示意圖；
[0018] 圖2 :點陣設(shè)置圖不；
[0019] 圖3:樣品設(shè)置圖示；
[0020] 圖4 :芯片預(yù)雜交的組裝圖示
[0021] 圖5 :芯片特異性檢測結(jié)果A:PRV檢測結(jié)果；B:PPV檢測結(jié)果；C:PCV2檢測結(jié)果； D:PRV+PPV檢測結(jié)果；E:PRV+PPV檢測結(jié)果；F:PRV+PCV2檢測結(jié)果。
[0022] 圖6 :NS1探針基因芯片靈敏性檢測結(jié)果
[0023] 圖7 :0RF2探針基因芯片靈敏性檢測結(jié)果
[0024] 圖8 :穩(wěn)定性檢測結(jié)果
【具體實施方式】
[0025] 實施例1本發(fā)明檢測方法
[0026] -、探針基因的設(shè)計以及包含探針的質(zhì)粒菌的構(gòu)建
[0027] 1 材料
[0028] I. 1 種毒
[0029] PRV Fa株，由衛(wèi)生部成都生物制品研宄所惠贈；
[0030] PCV2由本實驗室趙春容從四川資陽病料中分離；
[0031] 豬細小病毒滅活疫苗購自北京中?？萍紕游锉＝】萍脊尽?br>[0032] 1. 2探針基因重組質(zhì)粒菌
[0033] T/GAPDH由英駿生物公司合成。
[0034] 1. 3主要實驗儀器
[0035] 電子天平：Sartorius BP 310S ;
[0036] 超純水儀：Milli Qplus，法國產(chǎn)；
[0037] 超凈工作臺：SW-CJ-2FD，蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；
[0038] 恒溫搖床：真空機：SinBo,香港；
[0039] 恒溫水浴鍋；Thermo Savant冷凍干燥儀；
[0040] 核酸蛋白檢測儀：Bio-RAD，SmartSpaee TM 3010 ;
[0041] 高速冷凍離心機3K18型：SigmaB，德國產(chǎn)；
[0042] Mini-SUB凝膠電泳裝置，電泳儀：POWER Pac300,凝膠電泳圖像分析系統(tǒng)2000型： Bio-RADt意大利產(chǎn)；
[0043] 梯度 PCR 儀：PX 2, Thermo hybaid ;分子雜交儀：Thermo,美國產(chǎn)；
[0044] 晶芯? SmartArrayer?48 (微陣列芯片點樣系統(tǒng)），晶芯? LuxScan?10K微陣列芯片 掃描儀：
[0045] Capitalbio Corporation，北京博奧生物有限公司；
[0046] 高純氮氣瓶：四川冠峰氣體有限公司生產(chǎn)。
[0047] 1. 4主要試劑
[0048] Plasmid miniprep Kit，Gel Extractraction Kit，均購自 Omega (美國）生物技 術(shù)有限公司；
[0049] 血液/細胞/組織基因組DNA提取試劑盒、50bp DNA LadderUOObp DNA Ladder、 2XTaq PCR MasterMix、DH5a感受態(tài)細胞-化學轉(zhuǎn)化，Amp均購自北京天根生化科技有限公 司；
[0050] PUC18Cloning Vector，pMD19_T Simple克隆試劑盒，均購自寶生物（大連）科技 有限公司；
[0051] LB 液體培養(yǎng)基（含 100mg/ml Amp) ;LB 平板（含 100mg/ml Amp)等。
[0052] Western Blot膜封閉液，購自天根生物科技有限生司；
[0053] Streptavidin-HRP，DAB Kit (Brown)購自英駿生物科技有限公司；
[0054] Baio?點樣緩沖液，購自上海百傲生物工程有限公司；
[0055] 預(yù)雜交緩沖液：甲酰胺 50ml、20XSSC 25ml、100Xdenhartd's 5ml、脫脂奶粉 5g、 0· 2M Na3PO4IOml,超純水定容至 100ml ;
[0056] 雜交緩沖液，甲酰胺45ml、20XSSC 25ml、100Xdenhartd's 1ml、脫脂奶粉2g、20m M Na3PO4 (pH 6· 5) 10ml，超純水定容至 100ml ;
[0057] 尼龍膜，購自GE Healthcare ;硝酸纖維素膜，購自Millipore.
[0058] 0· 2M PBS 緩沖液：NaCl 8g、KCl 0· 2g、Na2HPO4L 42g、KH2PO4O. 27g，定容至 IL ;
[0059] 洗液 I :1XSSC 0· 1% SDS ;洗液 II :0· 2XSSC 0· 1% SDS ;洗液III :0· 2XSSC ;超 純水。
[0060] 2實驗方法
[0061] 2.1探針設(shè)計
[0062] 2. LlPPV 探針
[0063] PPV-NSl 基因 （SEQ ID NO :1):
[0064] TTCATGGGCCAGCATCAACAGGAAAAAGTATAATTGCTCAACACATTGCAAACTTAGTTGGTAATGTTG GTTGCTACAATGCAGCCAATGTGAACTTTCC
[0065] 2. I. 2PCV2 探針
[0066] PCV2-0RF2 基因 （SEQ ID NO :2):
[0067] GGAGTGGTAGGAGAAGGGTTGGGTTATGGTATGGCGGGAGGAGTAGTTTACATAGGGGTCATAGGTTAG GGCATTGGCCTTTGTTACAAAGTTATCATCTAGAATAACAGCAGTGGAGCCCA
[0068] 2. I. 3 質(zhì)控 I :PUC18 基因 （SEQ ID NO :3):
[0069] GCAGGGTCGGAACAGGAGAGCGCACGAGGGAGCTTCCAGGGGGAAACGCCTGGTATCTTTATAGTCCTG TCGGGTTTCGCCACCTCTGACTTGAGCGTCGATTTTTGTGATGCTCGTCAGGGGGGCGGAGCCTATGGAAAAACGCC AGCAACGCGGCCTTTTTACGGTTCCTGGCCTTTTGCTGGCCTTTTGCTCACATGTTCTTTCCTGCGTTATCCCC
[0070] 2. I. 4 質(zhì)控 2 :GAPDH 基因 （SEQ ID NO :4):
[0071] CCCCTTCATCACCACGGACTACATGACCTACATGTTCAAGTACGACACCGTCCACGGCCACTGGAAGCA CAGCGACATCACACTCAAGGACTCCAAGACCCTTCTCTTCGGTGACAAGCCGGTCACCGTCTTTGGCATCAGGAACC CTGAGGAAATCCCGTGGGGTGAGGCTGGCGCTGAGTATGTCGTGGAGTCCACCGGCGTCTTCACTGACAAGGACAAG GCTGCTGCACATCTCAAGGGTGGTGCCAAGAAGG
[0072] 2. I. 5重組質(zhì)粒及其重組菌的制備
[0073] 2. I. 5. 1探針基因的連接
[0074] 采用pMD19-T Simple克隆試劑盒，進行探針基因的連接重組，具體步驟按說明進 行。連接體系如下：
[0075] pMD19-T Simple 我休 丨.0 ul 膠回收PCR產(chǎn)物 2.0 ul Solution 1 5.0 ul 去離子水 2.0 ul Total 1().() ul
[0076] 4°C連接過夜，連接產(chǎn)物用于轉(zhuǎn)化DH5a感受態(tài)細胞。
[0077] 2. L 5. 2探針基因的轉(zhuǎn)化
[0078] 取9ul連接產(chǎn)物，向其中加入Iul Solution III (可增強轉(zhuǎn)化效率），混勻。將連接 產(chǎn)物加入50ul感受細胞中，混勻，冰浴30min ;42°C水浴熱休克90s，快速冰浴冷卻5min ;立 即加入600ul 37°C預(yù)熱的LB液體培養(yǎng)基（不含Amp)，37°C，180r/min振蕩培養(yǎng)lh，使受體 菌恢復(fù)正常生長狀態(tài)；4000r/min離心5min，棄上清510ul，重懸菌液后取150ul培養(yǎng)物均 勾涂布于LB平板（含100mg/ml Amp)，瞭干，于37°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)約12h。
[0079] 即得T/NS1和T/0RF22個檢測探針以及T/PUC18和T/GAPDH 2個定位探針基因重 組質(zhì)粒菌。
[0080] 2. 2可視芯片的制備
[0081] 2. 2.1陣列的設(shè)計排布
[0082] 每張芯片分為2個重復(fù)陣列，每個陣列為7排不同的探針基因，每排探針基因重復(fù) 噴樣4次。每個陣列探針基因排布為：第一排為空白對照（超純水），第二排為空白對照（超 純水），第三排為PPV-NS1基因，第四排為PCV2-0RF2基因，第五排為空白對照（超純水），