利用QCM傳感器檢測CP4-EPSPs蛋白的方法及專用金片的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了利用QCM傳感器檢測CP4-EPSPs蛋白的方法及專用金片。本發(fā)明提供了一種制備用于檢測CP4-EPSPS的QCM金片的方法，包括如下步驟：1）用巰基十一酸和3-巰基丙酸共修飾QCM金片，得到修飾后金片；2）將抗CP4-EPSPS抗體固定到所述修飾后金片，得到用于檢測所述CP4-EPSPS的QCM金片。本發(fā)明的實驗證明，本發(fā)明利用石英晶體微天平生物傳感器對MCMV的檢測進(jìn)行了研究，通過對兩種修飾金片方法11-MUA單獨修飾QCM金片和3-MPA和11-MUA共同修飾QCM金片作比較，分析3-MPA和11-MUA共同修飾QCM金片檢測靈敏度高、特異性好，且能應(yīng)用于實際檢測的方法。
【專利說明】利用QCM傳感器檢測CP4-EPSPs蛋白的方法及專用金片
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生物【技術(shù)領(lǐng)域】，尤其涉及一種利用QCM傳感器檢測CP4-EPSPS蛋白的方法及專用金片。
【背景技術(shù)】
[0002]草甘膦不僅是一種對于一年生和多年生雜草五中普遍適用的廣譜、高效除草劑，而且具有土壤強(qiáng)吸收性和哺乳動物、鳥類、魚類低毒性等有利于環(huán)境的特性。廣泛用于果園、非耕地、免耕地中玉米、大豆、棉花播前或播后處理，以及出苗后定向處理，是全世界除草劑使用量最大的品種之一。5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶(EPSPs)催化倒數(shù)第二個莽草酸途徑，當(dāng)?shù)孜锪姿嵯┐急猁}有高度親和性的時候酶表現(xiàn)出高度耐草甘膦特性，在催化合成芳香酸，苯基丙氨酸和酪氨酸時這是關(guān)鍵步驟，也伴隨一些吲哚乙酸、木質(zhì)素和植物抗毒素等次生化合物。是許多抗生素除草劑的首選靶標(biāo)酶。草甘膦能與植物的EPSPs結(jié)合導(dǎo)致植物死亡。從天然的農(nóng)桿菌菌系CP4中分離的EPSPs酶有很好的抗草甘膦功能，稱 CP4-EPSPs。
[0003]全球抗草甘膦作物種植面積呈逐年上升趨勢。轉(zhuǎn)基因作物進(jìn)入市場以來，引起食品安全與控制的普遍警惕。草甘膦的長期使用會影響土壤微生物，加大大豆根部病害幾率，而最為嚴(yán)重的是抗草甘膦雜草的出現(xiàn)，因此，掌握科學(xué)快速檢測抗性雜草的方法以便及對沒有加施標(biāo)簽予以聲明的情況下大量進(jìn)入中國市場的轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品進(jìn)行檢測就顯得十分迫切且意義重大。目前檢測EPSPs基因方法主要有基于核酸水平的PCR法和基于蛋白水平的酶聯(lián)免疫法和免疫層析試紙條法。闞貴珍等研究結(jié)果表明試紙條法中陰性樣品一條帶陽性樣品兩條帶，PCR檢測結(jié)果中陽性基因特異片段為146bp。董峰雙夾心酶聯(lián)免疫法結(jié)果表明檢出限為80ppb。G.J.Rogan用酶聯(lián)免疫法檢測大豆中CP4_EPSPs蛋白的檢出限為210 μ g/g，變異系數(shù)小于15%。
[0004]石英晶體微天平是一種簡單，效價高，高分辨率，利用壓電效應(yīng)原理的質(zhì)量傳感技術(shù)。免疫學(xué)檢測法可以檢測具有抗原性的蛋白質(zhì)類表達(dá)產(chǎn)物，它是通過抗原-抗體特異性反應(yīng)來實現(xiàn)的，抗原-抗體反應(yīng)是一種非共價鍵特異性吸附反應(yīng)，在一般情況下，抗原只和由自己誘導(dǎo)產(chǎn)生的抗體或具有相同抗原決定簇的抗原誘導(dǎo)產(chǎn)生的抗體進(jìn)行特異性反應(yīng)。所以，免疫學(xué)反應(yīng)具有高度的特異性。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的是提供一種制備用于檢測CP4-EPSPS的QCM金片的方法。
[0006]本發(fā)明提供的方法，包括如下步驟:
[0007]I)用巰基十一酸和3-巰基丙酸共修飾QCM金片，得到修飾后金片；
[0008]2)將抗CP4-EPSPS抗體固定到所述修飾后金片，得到用于檢測所述CP4-EPSPS的QCM金片。
[0009]上述方法中，上述QCM金片為單側(cè)鍍金片，12mmX20mm,單側(cè)鍍金50nm, BioNavis公司，貨號 QSX301-Au-13052。
[0010]步驟I)中，所述巰基十一酸和3-巰基丙酸共修飾QCM金片按照如下方法制備:將所述QCM金片浸泡在含有巰基十一酸和3-巰基丙酸的乙醇溶液中。
[0011]步驟I)中，所述浸泡為4°C浸泡12h ；
[0012]上述方法中，
[0013]步驟I)中，所述含有巰基十一酸和3-巰基丙酸的乙醇溶液中，所述巰基十一酸和所述3-巰基丙酸的摩爾比為1:10。
[0014]上述方法中，
[0015]所述巰基十一酸在所述溶液中的終濃度為0.9M ；
[0016]所述3-巰基丙酸在所述溶液中的終濃度為9M。
[0017]上述方法中，
[0018]步驟2)中，將抗目的蛋白抗體固定到所述修飾后金片為將所述抗目的蛋白抗體與所述修飾后金片上的巰基十一酸和3-巰基丙酸通過共價鍵連接。
[0019]步驟2)中，所述將抗CP4-EPSPS抗體固定到所述修飾后金片具體按照如下方法制備:先用含有EDC和Sulfo-NHS的溶液滴于所述修飾后金片表面，常溫(25°C)下靜置2小時；再滴加所述抗CP4-EPSPS抗體，37V反應(yīng)3小時；再滴加濃度為lmg/mLBSA，25°C下靜置I小時，得到用于檢測所述CP4-EPSPS的QCM金片；
[0020]含有EDC (N-乙基-N’ - ( 二甲氨基丙基)碳二亞胺)和Sulfo-NHS (N-羥基硫代琥珀酰亞胺)的溶液=EDC和Sulfo-NHS溶于MES溶液，使EDC在溶液中的終濃度0.075M,NHS在溶液中的終濃度為0.015M。
[0021]MES (脂肪酸甲酯磺酸鹽)溶液:稱取3.90g MES溶于180mLddH20，調(diào)節(jié)pH至5.0，定容至Ij 200mL。
[0022]上述方法中，
[0023]所述抗目的蛋白抗體為單克隆抗體或多克隆抗體。
[0024]上述方法中，
[0025]所述目的蛋白為抗草甘膦蛋白，所述抗草甘膦蛋白具體為CP4-EPSPS ；
[0026]所述抗目的蛋白抗體為抗CP4-EPSPS單克隆抗體。
[0027]由上述的方法制備的用于檢測目標(biāo)蛋白的QCM金片也是本發(fā)明保護(hù)的范圍；所述目的蛋白具體為抗草甘膦蛋白。
[0028]上述的用于檢測目標(biāo)蛋白的QCM金片在檢測目標(biāo)蛋白中的應(yīng)用也是本發(fā)明保護(hù)的范圍；所述目的蛋白具體為抗草甘膦蛋白。
[0029]上述的用于檢測目標(biāo)蛋白的QCM金片在檢測抗除草劑轉(zhuǎn)基因植物中的應(yīng)用也是本發(fā)明保護(hù)的范圍；所述除草劑具體為草甘膦。
[0030]本發(fā)明的實驗證明，本發(fā)明根據(jù)抗原抗體特異性結(jié)合的原理，將CP4-EPSPS蛋白單克隆抗體修飾到金片上，通過QCM生物傳感器對有抗原性的CP4-EPSPs蛋白特異性檢測，可以實現(xiàn)方便快捷，真實可靠，檢測過程在兩個小時以內(nèi)，方便實際樣品檢測，靈敏度高達(dá)
0.01%，與其他檢測方法比較，具有很強(qiáng)的實際應(yīng)用優(yōu)勢。本發(fā)明用QCM檢測CP4-EPSPS轉(zhuǎn)基因蛋白的方法，可以廣泛應(yīng)用到進(jìn)出口植物檢驗檢疫工作中，對于轉(zhuǎn)基因檢測有著重要的應(yīng)用價值。作為特異性檢測草甘膦轉(zhuǎn)基因蛋白芯片，具有較好的穩(wěn)定性與保存性，發(fā)揮出商業(yè)價值。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0031 ] 圖1為QCM檢測CP4-EPSPs蛋白的靈敏度與重復(fù)性
[0032]圖2為QCM檢測CP4-EPSPs蛋白的特異性
[0033]圖3為3-MPA和Il-MUA共修飾的QCM金片檢測實際樣品柱形圖
【具體實施方式】
[0034]下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。
[0035]下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到，部分列舉如下:
[0036]石英晶體微天平(Biolin Scientific AB公司)；CP4_EPSPS蛋白(序列I)及抗CP4-EPSPS單克隆抗體(購自北京陸橋質(zhì)檢科技有限公司)；牛血清蛋白(BSA)(上海游然傳感科技有限公司);N-乙基-N’-(二甲氨基丙基)二亞胺(EDC) (Sigma公司);N-羥基硫代琥珀酰亞胺(Sulfo-NHS) (Sigma公司);脂肪酸甲酯磺酸鹽(MES)(上海共價化學(xué)科技有限公司);緩沖液PBS (Sigma公司);巰基十一酸(Il-MUA)和3-巰基丙酸(3-MPA)(上海共價化學(xué)科技有限公司);Tis-HCl (pH6.5)(上海共價化學(xué)科技有限公司)；30%氨水和氨水(北京翰隆達(dá)科技發(fā)展有限公司)。Bt蛋白抗原，10%轉(zhuǎn)基因玉米標(biāo)準(zhǔn)品M0N810 (歐體標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)與測量研究所，ERM-BF-41 3gk)和非轉(zhuǎn)基因玉米。
[0037]下述實施例中所用的溶液的配置:
[0038](I) 3-巰基丙酸(3-MPA)乙醇溶液(IOmM):用分析天平稱取0.1061g3_MPA溶于IOOmL無水乙醇中，混勻。
[0039](2)巰基十一酸(Il-MUA)乙醇溶液(IOmM):用分析天平稱取0.2183gll_MUA溶于IOOmL無水乙醇中，混勻。
[0040](3)MES (脂肪酸甲酯磺酸鹽)溶液:用分析天平稱取3.90g MES溶于180mL ddH20，調(diào)節(jié)pH至5.0，定容至Ij 200mL。
[0041](4)含有EDC (N-乙基-N’ -( 二甲氨基丙基)碳二亞胺)和Sulfo-NHS (N-羥基硫代琥珀酰亞胺)的溶液:用分析天平稱取一定量的EDC和Sulfo-NHS溶于100 μ L MES溶液，振蕩均勻，使EDC在溶液中的濃度0.075Μ, NHS在溶液中的濃度0.015Μ?，F(xiàn)用現(xiàn)配。
[0042](5)磷酸鹽緩沖液(PBS，ρΗ7.4):用分析天平分別稱取4g NaCU0.72g Na2HPO4,
0.12g KH2PO4和0.1g KCl溶于480mL滅菌后的蒸餾水中，使用酸度儀和HCl調(diào)節(jié)緩沖液的pH至7.4 ;然后再向瓶中加入滅菌蒸餾水，定容到500mL。
[0043](6) Tris-HCl (0.1M, ρΗ6.0):用分析天平稱取 1.211g Tris-base 溶于 80mL 的ddH20，用HCl調(diào)節(jié)pH至6.0，然后定容到IOOmL0
[0044]實施例1、檢測CP4-EPSPs蛋白的QCM金片的制備
[0045]1、QCM金片預(yù)處理
[0046]取出QCM金片(QSX30 l-Au-13052)，先用Mi 11 iQ水沖洗表面，之后將金片放入裝有混合溶液(混合溶液是將30%氨水、30%雙氧水以及Mi 11 iQ水按體積比1: 1:5混合配制)的小燒杯中。先把水浴鍋的溫度設(shè)定為85°C并使之升溫至所設(shè)溫度，之后將小燒杯放入水浴鍋中(注意燒杯不要與水浴鍋加熱管接觸，防止燒杯裂碎)，處理大約10分鐘。取出燒杯，用平頭鑷子夾出金片，用MilliQ水清洗金片表面殘留液體，用氮氣吹干表面；之后用無水乙醇繼續(xù)清洗金片表面，氮氣吹干，為清洗后的QCM金片，待用。
[0047]2、修飾QCM金片
[0048]含有Il-MUA和3-MPA乙醇溶液按照如下方法制備:將IOmM的Il-MUA和IOmM的3-MPA溶于無水乙醇中，得到的溶液，按照1:10混合，其中=Il-MUA在溶液中的終濃度為
0.9M，3-MPA在溶液中的終濃度為9mM。
[0049]將上述I得到的預(yù)處理QCM金片置于裝有含有Il-MUA和3-MPA乙醇溶液的玻璃瓶中，為了防止溶液揮發(fā)用封口膜封閉瓶口，4°C浸泡12h，得到Il-MUA和3-MPA共修飾的QCM金片。
[0050]3、固定單抗的QCM金片
[0051]將抗CP4-EPSPS單抗固定到修飾后金片為將抗CP4-EPSPS單抗與上述2得到的Il-MUA和3-MPA共修飾的QCM金片上的Il-MUA和3-MPA通過共價鍵連接；具體方法如下:
[0052]I)活化
[0053]用無水乙醇淋洗上述2得到Il-MUA和3-MPA共修飾的QCM金片表面，然后用氮氣干燥，再將含有0.075M的EDC和0.015M的Sulfo-NHS的溶液均勻滴加在QCM金片表面，常溫(25°C)下靜置2小時，用以活化固定在QCM金片表面的Il-MUA和3-MPA的硫醇羧基，得到活化的金片。
[0054]2)固定單抗
[0055]倒掉經(jīng)過I)處理的活化的金片上的含有0.4M的EDC和0.1M的Sulfo-NHS的溶液，用無水乙醇清洗金片表面，并用氮氣吹干表面；將Tris-HCl (0.1Μ，ρΗ6.0)稀釋CP4-EPSPS蛋白單抗?jié)舛葹?.2mg/mL，然后將單抗溶液均勻地滴加在QCM金片表面，放在調(diào)好溫度的(37°C)恒溫箱內(nèi)反應(yīng)3小時，3小時后用MilliQ水清洗QCM表面殘留的單抗溶液并用氮氣吹干；在％11金片表面滴加BSA，濃度為lmg/mL (PBS稀釋)，常溫(25°C )下靜置2小時，達(dá)到封閉未結(jié)合的NHS-酯基的目的；然后清洗金片表面，用氮氣吹干待用(存放于PBS溶液中，4°C )，得到固定抗CP4-EPSPS單抗的QCM金片。
[0056]實施例2、利用石英晶體微天平傳感器檢測CP4-EPSPs蛋白
[0057]石英晶體微天平傳感器檢測方法:將修飾好的金片固定于QCM傳感器中，打開蠕動泵開始流速為200μ 1/min，樣品管通入PBS，等基線穩(wěn)定流速改為50 μ 1/min，通入待檢測抗原，PBS稀釋到目標(biāo)濃度，通過Qsoft軟件的中F和D的變化，實時觀察反應(yīng)結(jié)果。
[0058]1、QCM檢測CP4-EPSPS蛋白的靈敏度
[0059]將待測抗原CP4-EPSPS 蛋白用 PBS 稀釋成 500ng/mL、I μ g/mL、5 μ g/mL、10 μ g/mL和15 μ g/mL，取100 μ L的每個濃度的CP4-EPSPS蛋白按照上述的方法進(jìn)行QCM檢測。
[0060]結(jié)果如圖1所示，當(dāng)進(jìn)樣時間約20min左右秒后，蠕動泵將抗原溶液送達(dá)金片表面，引起金片頻率下降和耗散上升，說明抗原與QCM金片表面固定的抗體特異性地結(jié)合在一起?？乖芤簶悠窛舛仍酱螅c金片表面單抗結(jié)合的抗原越多，引起頻率下降越多。由圖1可知用QCM檢測CP4-EPSPs蛋白的靈敏度可以達(dá)到500ng/ml，其頻率下降分別為1.39、
1.55 和 1.72HZ。
[0061 ] 2、QCM檢測CP4-EPSPS蛋白的重復(fù)性[0062]在同樣的條件下分別對15片QCM金片進(jìn)行清洗、修飾活化、固定單克隆抗體等過程，將固定好單抗的QCM金片用于檢測上述5種濃度的抗原，每個濃度測量三次，得到結(jié)果如表1，計算了三次測量值的平均值、SD及CV%。得到的CV%均小于相應(yīng)平均值的10%，說明QCM金片檢測CP4-EPSPs蛋白的重復(fù)性較好。
[0063]結(jié)果如表1所示，每次檢測都有明顯的反應(yīng)，且同一濃度的響應(yīng)值差異很小，隨蛋白濃度的降低反應(yīng)響應(yīng)值也相應(yīng)減小，表明QCM檢測CP4-EPSPS的重復(fù)性較好。
[0064]表1 QCM金片的重復(fù)性
【權(quán)利要求】
1.一種制備用于檢測目的蛋白的QCM金片的方法，包括如下步驟: 1)用巰基十一酸和3-巰基丙酸共修飾QCM金片，得到修飾后金片； 2)將抗目的蛋白抗體固定到所述修飾后金片，得到用于檢測所述CP4-EPSPS的QCM金片。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于: 步驟I)中，所述巰基十一酸和3-巰基丙酸共修飾QCM金片按照如下方法制備:將所述QCM金片浸泡在含有巰基十一酸和3-巰基丙酸的乙醇溶液中。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于: 步驟I)中，所述含有巰基十一酸和3-巰基丙酸的乙醇溶液中，所述巰基十一酸和所述3-巰基丙酸的摩爾比為1:10。
4.根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的方法，其特征在于: 所述巰基十一酸在所述溶液中的終濃度為0.9M ； 所述3-巰基丙酸在所述溶液中的終濃度為9M。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4中任一所述的方法,其特征在于: 步驟2)中，將抗目的蛋白抗體固定到所述修飾后金片為將所述抗目的蛋白抗體與所述修飾后金片上的巰基十一酸和3-巰基丙酸通過共價鍵連接。
6.根據(jù)權(quán)利要求1-5中任一所述的方法,其特征在于: 所述抗目的蛋白抗體為單克隆抗體或多克隆抗體。
7.根據(jù)權(quán)利要求1-6中任一所述的方法,其特征在于: 所述目的蛋白為抗草甘膦蛋白，所述抗草甘膦蛋白具體為CP4-EPSPS ； 所述抗目的蛋白抗體為抗CP4-EPSPS單克隆抗體。
8.由權(quán)利要求1-7任一所述的方法制備的用于檢測目標(biāo)蛋白的QCM金片；所述目的蛋白具體為抗草甘膦蛋白。
9.權(quán)利要求8所述的用于檢測目標(biāo)蛋白的QCM金片在檢測目標(biāo)蛋白中的應(yīng)用；所述目的蛋白具體為抗草甘膦蛋白。
10.權(quán)利要求8所述的用于檢測目標(biāo)蛋白的QCM金片在檢測抗除草劑轉(zhuǎn)基因植物中的應(yīng)用；所述除草劑具體為草甘膦。
【文檔編號】G01N33/68GK103792370SQ201410049536
【公開日】2014年5月14日 申請日期:2014年2月13日 優(yōu)先權(quán)日:2014年2月13日
【發(fā)明者】黃新, 蔡淼 申請人:中國檢驗檢疫科學(xué)研究院