利用光分析的單個(gè)粒子檢測裝置、單個(gè)粒子檢測方法以及單個(gè)粒子檢測用計(jì)算機(jī)程序的制作方法
【專利摘要】提供一種能夠在基于利用共焦顯微鏡或多光子顯微鏡的光測量逐個(gè)檢測單個(gè)粒子的掃描分子計(jì)數(shù)法的單個(gè)粒子檢測技術(shù)中，在非發(fā)光粒子和發(fā)光粒子混合存在的樣本溶液中分別識(shí)別并檢測非發(fā)光粒子和發(fā)光粒子的存在的技術(shù)。關(guān)于本發(fā)明的檢測樣本溶液中的單個(gè)粒子的技術(shù)，一邊使顯微鏡的光檢測區(qū)域的位置在包含非發(fā)光粒子和發(fā)光粒子的樣本溶液內(nèi)移動(dòng)一邊檢測來自光檢測區(qū)域的光，生成按時(shí)間序列的光強(qiáng)度數(shù)據(jù)，將時(shí)序光強(qiáng)度數(shù)據(jù)中相對(duì)于背景光強(qiáng)度的光強(qiáng)度的增大檢測為表示發(fā)光粒子的存在的信號(hào)，將相對(duì)于背景光強(qiáng)度的光強(qiáng)度的下降檢測為表示非發(fā)光粒子的存在的信號(hào)。
【專利說明】利用光分析的單個(gè)粒子檢測裝置、單個(gè)粒子檢測方法以及單個(gè)粒子檢測用計(jì)算機(jī)程序

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種單個(gè)粒子檢測技術(shù)，能夠使用共焦顯微鏡或多光子顯微鏡的光學(xué)系統(tǒng)等能夠檢測來自溶液中的微小區(qū)域的光的光學(xué)系統(tǒng)，檢測分散或溶解在溶液中的原子、分子或它們的聚合體(以下將它們稱為“粒子”)、例如蛋白質(zhì)、肽、核酸、脂質(zhì)、糖鏈、氨基酸或它們的聚合體等生物體分子、病毒、細(xì)胞等粒子狀的對(duì)象物、或非生物學(xué)粒子，來獲取在分析或解析它們的狀態(tài)(相互作用、結(jié)合/離解狀態(tài)等)時(shí)有用的信息，更詳細(xì)地說，涉及一種能夠使用如上所述的光學(xué)系統(tǒng)測量依賴于單個(gè)粒子的存在的光強(qiáng)度的變化來檢測單個(gè)粒子并進(jìn)行各種分析的單個(gè)粒子檢測裝置、單個(gè)粒子檢測方法以及單個(gè)粒子檢測用計(jì)算機(jī)程序。

【背景技術(shù)】
[0002]由于近年來的光測量技術(shù)的發(fā)展，使用共焦顯微鏡的光學(xué)系統(tǒng)和還能夠進(jìn)行光子計(jì)數(shù)(單光子檢測)的超高靈敏度的光檢測技術(shù)，能夠檢測/測量單光子或熒光單分子水平的微弱光。因此，提出了各種使用這樣的微弱光測量技術(shù)對(duì)生物體分子等的特性、分子間相互作用、或結(jié)合/離解反應(yīng)進(jìn)行檢測的光分析計(jì)數(shù)。作為這樣的光分析技術(shù)，例如已知有突光相關(guān)光譜分析(Fluorescence Correlat1n Spectroscopy:FCS。例如參照專利文獻(xiàn)1_3、非專利文獻(xiàn)1-3)、突光強(qiáng)度分布分析(Fluorescence-1ntensity Distribut1nAnalysis:FIDA。例如專利文獻(xiàn)4、非專利文獻(xiàn)4)、光子計(jì)數(shù)直方圖(Photon CountingHistogram:PCH。例如專利文獻(xiàn)5)等。另外,在專利文獻(xiàn)6?8中提出了一種根據(jù)使用共焦顯微鏡的光學(xué)系統(tǒng)測量出的樣本溶液的熒光信號(hào)的時(shí)間經(jīng)過來檢測熒光性物質(zhì)的方法。
[0003]并且，本申請(qǐng)的 申請(qǐng)人:在專利文獻(xiàn)9?11中提出了一種利用共焦顯微鏡或多光子顯微鏡的光學(xué)系統(tǒng)等能夠檢測來自溶液中的微小區(qū)域的光的光學(xué)系統(tǒng)的、基于與FCS、FIDA等光分析技術(shù)不同的原理的新的光分析技術(shù)。在上述的FCS、FIDA等光分析技術(shù)的情況下，如果清楚地進(jìn)行描述則是，針對(duì)通過連續(xù)地測量來自浮游于作為樣本溶液內(nèi)的光的檢測區(qū)域的微小區(qū)域(以下稱為“光檢測區(qū)域”。)的熒光分子的光而得到的光強(qiáng)度數(shù)據(jù)執(zhí)行統(tǒng)計(jì)性的運(yùn)算處理，從而檢測熒光分子的濃度和/或其它特性。與此相對(duì)，在專利文獻(xiàn)9?11所提出的新的光分析技術(shù)中，一邊使光檢測區(qū)域的位置在樣本溶液內(nèi)移動(dòng)、即一邊通過光檢測區(qū)域?qū)颖救芤簝?nèi)進(jìn)行掃描，一邊在光檢測區(qū)域包含在樣本溶液中分散且隨機(jī)運(yùn)動(dòng)的發(fā)出光的粒子(發(fā)光粒子)時(shí)逐個(gè)檢測從該發(fā)光粒子發(fā)出的光，由此，能夠?qū)颖救芤褐械陌l(fā)光粒子逐一地進(jìn)行檢測來進(jìn)行發(fā)光粒子的計(jì)數(shù)、獲取與樣本溶液中的發(fā)光粒子的濃度或數(shù)密度有關(guān)的信息。根據(jù)該光分析技術(shù)(以下稱為“掃描分子計(jì)數(shù)法”)，與FCS、FIDA等光分析技術(shù)同樣地，進(jìn)行測量所需要的樣本可以是微量的(例如幾十UL左右)，另外，測量時(shí)間短(在一次測量中反復(fù)進(jìn)行多次秒級(jí)時(shí)間的測量。)，并且能夠在作為觀測對(duì)象的粒子的濃度低于FCS、FIDA等光分析技術(shù)能夠良好地進(jìn)行測量的水平(InM左右)的樣本溶液中檢測發(fā)光粒子的存在，并定量地檢測其濃度、數(shù)密度或其它特性。因而，期待“掃描分子計(jì)數(shù)法”在對(duì)醫(yī)學(xué)、生物學(xué)的研究開發(fā)領(lǐng)域中經(jīng)常使用的稀少或昂貴的樣本進(jìn)行分析的情況下，或在疾病的臨床診斷、生理活性物質(zhì)的篩選等檢測體數(shù)多的情況下，成為與以前的生物化學(xué)方法相比能夠廉價(jià)或迅速地執(zhí)行實(shí)驗(yàn)或檢查且能夠檢測無法良好地執(zhí)行FCS、FIDA等的程度的更低濃度的粒子的濃度和/或特性的強(qiáng)力工具。
[0004]專利文獻(xiàn)1:日本特開2005-098876
[0005]專利文獻(xiàn)2:日本特開2008-292371
[0006]專利文獻(xiàn)3:日本特開2009-281831
[0007]專利文獻(xiàn)4:日本特許第4023523號(hào)
[0008]專利文獻(xiàn)5:國際公開2008-080417
[0009]專利文獻(xiàn)6:日本特開2007-20565
[0010]專利文獻(xiàn)7:日本特開2008-116440
[0011]專利文獻(xiàn)8:日本特開平4-337446號(hào)公報(bào)
[0012]專利文獻(xiàn)9:國際公開第2011/108369
[0013]專利文獻(xiàn)10:國際公開第2011/108370
[0014]專利文獻(xiàn)11:國際公開第2011/108371
[0015]專利文獻(xiàn)12:國際公開2010-119098
[0016]非專利文獻(xiàn)1:金城政孝、蛋白質(zhì)核酸酶Vol.44、N0.9、1431-1438頁1999年
[0017]非專利文獻(xiàn)2:F.J.Meyer-Alms> 突光相關(guān)譜(Fluorescence Correlat1nSpectroscopy)、R.Rigler 編、Springer、柏林、2000 年、204-224 頁
[0018]非專利文獻(xiàn)3:加藤則子及其他4名、遺傳醫(yī)學(xué)、Vol.6、N0.2,271-277頁
[0019]非專利文獻(xiàn)4:卡斯柯(Kask)及其他3名、美國科學(xué)學(xué)院紀(jì)要、1999年、96卷、13756-13761 頁(P.Kask, K.Palo, D.Ullmann, K.Gall PNAS96, 13756-13761(1999))


【發(fā)明內(nèi)容】

[0020]發(fā)明要解決的問題
[0021]另外，在如上所述的掃描分子計(jì)數(shù)法中使用的共焦顯微鏡或多光子顯微鏡的光學(xué)系統(tǒng)的情況下，由于光軸方向的分辨率高于普通的光學(xué)顯微鏡，因此在從共焦區(qū)組織(光檢測區(qū)域)釋放出有意義的背景光的情況下，當(dāng)不發(fā)光的單個(gè)粒子通過共焦區(qū)組織的內(nèi)部時(shí)，觀測到來自共焦區(qū)組織的光強(qiáng)度的下降(專利文獻(xiàn)12)。因此，本申請(qǐng)的 申請(qǐng)人:在日本特愿2011-184635中提出了如下一種“反轉(zhuǎn)型掃描分子計(jì)數(shù)法”:使用不發(fā)光的單個(gè)粒子作為觀測對(duì)象粒子，利用與通過光檢測區(qū)域掃描釋放出實(shí)質(zhì)固定的背景光的樣本溶液內(nèi)的“掃描分子計(jì)數(shù)法”同樣的方法進(jìn)行光的檢測，檢測不發(fā)光或發(fā)光強(qiáng)度低于背景光的單個(gè)粒子被包含在光檢測區(qū)域內(nèi)時(shí)的單個(gè)粒子的光強(qiáng)度的下降，從而檢測單個(gè)粒子的存在。根據(jù)所述的“反轉(zhuǎn)型掃描分子計(jì)數(shù)法”，能夠檢測低濃度的不發(fā)光的單個(gè)粒子。
[0022]另外，根據(jù)本發(fā)明的發(fā)明人等的研究發(fā)現(xiàn)，如上述的“反轉(zhuǎn)型掃描分子計(jì)數(shù)法”的情況那樣，即使在來自共焦區(qū)組織的光中存在有意義的背景光，如果來自發(fā)光粒子的發(fā)光強(qiáng)度高于背景光，則也能夠逐個(gè)檢測單個(gè)發(fā)光粒子所釋放的光。因而，在包含在檢測光波長下不發(fā)光或發(fā)光強(qiáng)度低于背景光的單個(gè)粒子(以下稱為“非發(fā)光粒子”。)和在檢測光波長下發(fā)光強(qiáng)度高于背景光的單個(gè)發(fā)光粒子的溶液中，如果進(jìn)行依照掃描分子計(jì)數(shù)法的光測量，貝1J與非發(fā)光粒子對(duì)應(yīng)的信號(hào)(光強(qiáng)度的變化)表現(xiàn)為向下凸，與發(fā)光粒子對(duì)應(yīng)的信號(hào)表現(xiàn)為向上凸。即，在這種情況下，能夠同時(shí)且相互區(qū)分地檢測包含在同一樣本溶液中的非發(fā)光粒子和發(fā)光粒子各自的存在。在本發(fā)明中，有利地利用所述知識(shí)。
[0023]這樣，本發(fā)明的主要課題在于提供一種在檢測光波長下不發(fā)光或發(fā)光強(qiáng)度低于背景光的單個(gè)粒子(非發(fā)光粒子)和在檢測光波長下發(fā)光強(qiáng)度高于背景光的單個(gè)粒子(發(fā)光粒子)包含在同一樣本溶液內(nèi)的情況下能夠利用掃描分子計(jì)數(shù)法的原理來識(shí)別并檢測非發(fā)光粒子和發(fā)光粒子各自的存在的單個(gè)粒子檢測技術(shù)。
[0024]用于解決問題的方案
[0025]根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方式，通過下述單個(gè)粒子檢測裝置來達(dá)成上述課題，該單個(gè)粒子檢測裝置使用共焦顯微鏡或多光子顯微鏡的光學(xué)系統(tǒng)檢測在樣本溶液中分散且隨機(jī)運(yùn)動(dòng)的單個(gè)粒子，該單個(gè)粒子檢測裝置的特征在于，包括:光檢測區(qū)域移動(dòng)部，其使顯微鏡的光學(xué)系統(tǒng)的光檢測區(qū)域的位置在樣本溶液內(nèi)移動(dòng)；光檢測部，其檢測來自光檢測區(qū)域的光；以及信號(hào)處理部，其生成一邊使光檢測區(qū)域的位置在樣本溶液內(nèi)移動(dòng)一邊由光檢測部檢測出的來自光檢測區(qū)域的光的按時(shí)間序列的光強(qiáng)度數(shù)據(jù)，在按時(shí)間序列的光強(qiáng)度數(shù)據(jù)中逐個(gè)檢測表示各個(gè)單個(gè)粒子的存在的信號(hào)，其中，由光檢測部檢測出的來自光檢測區(qū)域的光包含實(shí)質(zhì)固定的背景光，單個(gè)粒子包含具有比背景光的發(fā)光強(qiáng)度高的發(fā)光強(qiáng)度的第一單個(gè)粒子和具有比背景光的發(fā)光強(qiáng)度低的發(fā)光強(qiáng)度的第二單個(gè)粒子，第一單個(gè)粒子的信號(hào)為在該第一單個(gè)粒子進(jìn)入到光檢測區(qū)域內(nèi)時(shí)產(chǎn)生的、由光檢測部檢測出的光強(qiáng)度的增大，第二單個(gè)粒子的信號(hào)為在該第二單個(gè)粒子進(jìn)入到光檢測區(qū)域內(nèi)時(shí)產(chǎn)生的、由光檢測部檢測出的光強(qiáng)度的下降。
[0026]在所述結(jié)構(gòu)中，“在樣本溶液中分散并隨機(jī)運(yùn)動(dòng)的單個(gè)粒子”是指在樣本溶液中分散或溶解的原子、分子或它們的聚合體等，只要是不固定在基板等上而在溶液中自由地進(jìn)行布朗運(yùn)動(dòng)的粒子，則可以是任意的粒子。共焦顯微鏡或多光子顯微鏡的光學(xué)系統(tǒng)的“光檢測區(qū)域”是指這些顯微鏡中檢測光的微小區(qū)域，在從物鏡提供照明光的情況下，相當(dāng)于該照明光會(huì)聚到的區(qū)域(在共焦顯微鏡中，特別地根據(jù)物鏡和針孔之間的位置關(guān)系來確定。)?！吧鲜鰜碜怨鈾z測區(qū)域的光包含實(shí)質(zhì)固定的背景光”是指光檢測區(qū)域內(nèi)不存在作為觀測對(duì)象的單個(gè)粒子時(shí)的檢測光(即，背景光)的強(qiáng)度值為收斂于允許誤差范圍內(nèi)的有意義的強(qiáng)度值。換言之，背景光被調(diào)節(jié)成其變動(dòng)與單個(gè)粒子進(jìn)入到光檢測區(qū)域內(nèi)時(shí)產(chǎn)生的檢測光的強(qiáng)度的變動(dòng)幅度相比充分小。此外，在本說明書中，在稱為“單個(gè)粒子的信號(hào)”的情況下，只要沒有特別限定，就是指表示單個(gè)粒子的存在的信號(hào)?！爸饌€(gè)檢測表示各個(gè)單個(gè)粒子的存在的信號(hào)”即是指按每個(gè)單個(gè)粒子逐一地檢測按時(shí)間序列的光強(qiáng)度數(shù)據(jù)上的單個(gè)粒子進(jìn)入到光檢測區(qū)域內(nèi)時(shí)產(chǎn)生的光強(qiáng)度的暫時(shí)性的增大或下降。另外，在下面，將具有比背景光的發(fā)光強(qiáng)度高的發(fā)光強(qiáng)度的單個(gè)粒子(第一單個(gè)粒子)稱為“發(fā)光粒子”，將具有比背景光的發(fā)光強(qiáng)度低的發(fā)光強(qiáng)度的單個(gè)粒子(第二單個(gè)粒子)稱為“非發(fā)光粒子”。即，關(guān)于非發(fā)光粒子，優(yōu)選檢測光的波長頻帶下的發(fā)光強(qiáng)度幾乎為0，但是即使是與背景光的強(qiáng)度相比有意的低水平，也是可以允許的。
[0027]如從上述理解的那樣，在本發(fā)明的裝置中，基本上與專利文獻(xiàn)9?11所記載的“掃描分子計(jì)數(shù)法”同樣地，一邊使光檢測區(qū)域的位置在樣本溶液內(nèi)移動(dòng)、即一邊通過光檢測區(qū)域?qū)颖救芤簝?nèi)進(jìn)行掃描，一邊逐次進(jìn)行光的檢測。在所述結(jié)構(gòu)中，在來自光檢測區(qū)域的光中包含了有意義的強(qiáng)度的背景光的情況下，在發(fā)光粒子(第一單個(gè)粒子)進(jìn)入到光檢測區(qū)域時(shí)或在樣本溶液內(nèi)移動(dòng)的光檢測區(qū)域包含有發(fā)光粒子時(shí)，由于發(fā)光粒子的存在而來自光檢測區(qū)域的到達(dá)光檢測部的光強(qiáng)度或光量增大，在非發(fā)光粒子(第二單個(gè)粒子)進(jìn)入到光檢測區(qū)域時(shí)或在樣本溶液內(nèi)移動(dòng)的光檢測區(qū)域包含有非發(fā)光粒子時(shí)，由于非發(fā)光粒子的存在而來自光檢測區(qū)域的到達(dá)光檢測部的光強(qiáng)度或光量下降。這樣，在本發(fā)明的裝置中，在樣本溶液中包含發(fā)光粒子和非發(fā)光粒子作為觀測對(duì)象粒子即單個(gè)粒子的情況下，以從光檢測區(qū)域檢測出有意義的(比發(fā)光粒子的光強(qiáng)度低且比非發(fā)光粒子的光強(qiáng)度高的值的)背景光強(qiáng)度的狀態(tài)進(jìn)行光檢測，生成時(shí)序光強(qiáng)度數(shù)據(jù)。然后，在時(shí)序光強(qiáng)度數(shù)據(jù)上，將光強(qiáng)度或光量的增大和/或下降分別逐個(gè)檢測為第一和第二單個(gè)粒子的信號(hào)，從而以第一和第二單個(gè)粒子的存在被相互識(shí)別出的方式進(jìn)行檢測。根據(jù)所述結(jié)構(gòu)，樣本溶液中的互不相同的粒子、即各第一和第二粒子被分開檢測出、即按種類被檢測出，按種類獲取與粒子在溶液內(nèi)的狀態(tài)有關(guān)的各種信息。換言之，在本發(fā)明的裝置中，在某檢測波長頻帶下的光測量中，能夠逐個(gè)檢測種類互不相同的至少兩種單個(gè)粒子。
[0028]在上述本發(fā)明的裝置中，作為來自光檢測區(qū)域的光中應(yīng)該包含的背景光，可以是在樣本溶液內(nèi)分散的物質(zhì)所產(chǎn)生的熒光、磷光、化學(xué)發(fā)光、生物發(fā)光或散射光。在這種情況下，可以在釋放光或使光散射的物質(zhì)未分散于作為樣本溶液使用的溶液中的情況下，在所述溶液中主動(dòng)地溶解或分散釋放光或使光散射的物質(zhì)。另外，在作為樣本溶液使用的溶液發(fā)出自體熒光的情況下，可以利用該自體熒光作為上述背景光。特別是在產(chǎn)生背景光的物質(zhì)以及作為觀察對(duì)象粒子的發(fā)光粒子需要激勵(lì)光或照明光的情況下，在顯微鏡裝置中配備照明光用的光源和光學(xué)系統(tǒng)。另一方面，在產(chǎn)生背景光的物質(zhì)沒有激勵(lì)光或照明光而發(fā)光的情況下，例如在通過化學(xué)發(fā)光或生物發(fā)光而發(fā)光的物質(zhì)的情況下，在顯微鏡裝置中不需要照明光。并且，應(yīng)該理解到，對(duì)于背景光，如果在光檢測區(qū)域內(nèi)存在非發(fā)光粒子的情況下減少，則也可以是通過透射照明等產(chǎn)生的照明光。
[0029]另外，在上述本發(fā)明的裝置中的發(fā)光粒子的發(fā)光強(qiáng)度與背景光強(qiáng)度之間的關(guān)系中，優(yōu)選發(fā)光粒子的發(fā)光強(qiáng)度大到足以能夠與背景光強(qiáng)度相區(qū)分。因此，優(yōu)選的是，調(diào)整發(fā)光粒子的發(fā)光強(qiáng)度與背景光強(qiáng)度之間的關(guān)系，使得發(fā)光粒子的發(fā)光強(qiáng)度高于從與光檢測區(qū)域內(nèi)存在發(fā)光粒子時(shí)的排除體積相當(dāng)?shù)捏w積區(qū)域釋放的背景光強(qiáng)度。即，優(yōu)選調(diào)整背景光強(qiáng)度和發(fā)光粒子的發(fā)光強(qiáng)度使得從每單位體積的發(fā)光粒子(第一單個(gè)粒子)釋放的發(fā)光強(qiáng)度超過從每單位體積的光檢測區(qū)域內(nèi)發(fā)出的背景光強(qiáng)度。另一方面，在本發(fā)明的裝置中的非發(fā)光粒子的發(fā)光強(qiáng)度與背景光強(qiáng)度之間的關(guān)系中，如果調(diào)整非發(fā)光粒子的發(fā)光強(qiáng)度與背景光強(qiáng)度之間的關(guān)系使得非發(fā)光粒子的發(fā)光強(qiáng)度低于從與光檢測區(qū)域內(nèi)存在非發(fā)光粒子時(shí)的排除體積相當(dāng)?shù)捏w積區(qū)域釋放的背景光強(qiáng)度，則由于非發(fā)光粒子的存在而產(chǎn)生光強(qiáng)度的減少。因而，優(yōu)選調(diào)整背景光強(qiáng)度和非發(fā)光粒子的發(fā)光強(qiáng)度使得從每單位體積的非發(fā)光粒子(第二單個(gè)粒子)釋放的發(fā)光強(qiáng)度低于從每單位體積的光檢測區(qū)域內(nèi)發(fā)出的背景光強(qiáng)度。特別是在檢測由于非發(fā)光粒子的存在而引起的背景光的減少的情況下，背景光的減少程度依賴于非發(fā)光粒子的尺寸與光檢測區(qū)域的尺寸之間的關(guān)系。關(guān)于該點(diǎn)，根據(jù)考慮了后面記述的背景光的變動(dòng)幅度的估計(jì)，發(fā)現(xiàn)在非發(fā)光粒子的發(fā)光強(qiáng)度實(shí)質(zhì)為O的情況下，優(yōu)選的是，非發(fā)光粒子的外徑為光檢測區(qū)域的直徑的15%以上，更為優(yōu)選的是，非發(fā)光粒子的外徑為光檢測區(qū)域的直徑的35%以上。(參照日本特愿2011-184635)。在發(fā)光粒子的情況下，每單位體積的發(fā)光強(qiáng)度越強(qiáng)，則能夠檢測的發(fā)光粒子的外徑與光檢測區(qū)域的直徑之比越小。對(duì)于背景光的調(diào)節(jié)，例如可以通過調(diào)節(jié)樣本溶液中任意發(fā)光物質(zhì)的分散量來進(jìn)行。
[0030]可以根據(jù)單個(gè)粒子的特性或者樣本溶液中的數(shù)密度或濃度適當(dāng)?shù)刈兏鲜霰景l(fā)明的裝置中的光檢測區(qū)域的位置在樣本溶液內(nèi)的移動(dòng)速度。特別地，當(dāng)光檢測區(qū)域的移動(dòng)速度變快時(shí)，由于單個(gè)粒子的存在而引起的光強(qiáng)度或光量的增大/下降的程度減少，因此優(yōu)選的是，能夠適當(dāng)?shù)刈兏鈾z測區(qū)域的移動(dòng)速度以能夠高精度或高靈敏度地測量由單個(gè)粒子引起的光強(qiáng)度或光量的增大/下降。
[0031]另外，優(yōu)選的是，將光檢測區(qū)域的位置在樣本溶液內(nèi)的移動(dòng)速度設(shè)定得比作為檢測對(duì)象的單個(gè)粒子的擴(kuò)散移動(dòng)速度(由布朗運(yùn)動(dòng)引起的粒子的平均移動(dòng)速度)高。如上述說明的那樣，本發(fā)明的裝置在光檢測區(qū)域通過單個(gè)粒子的存在位置時(shí)檢測由于該單個(gè)粒子的存在而引起的光強(qiáng)度或光量的增大/下降來逐個(gè)檢測單個(gè)粒子。然而，單個(gè)粒子在溶液中由于進(jìn)行布朗運(yùn)動(dòng)而隨機(jī)地移動(dòng)，在多次出入光檢測區(qū)域的情況下，導(dǎo)致從一個(gè)單個(gè)粒子多次檢測到表示其存在的信號(hào)，難以使檢測出的信號(hào)與一個(gè)單個(gè)粒子的存在對(duì)應(yīng)起來。因此，如上述那樣，將光檢測區(qū)域的移動(dòng)速度設(shè)定得比單個(gè)粒子的擴(kuò)散移動(dòng)速度高，由此能夠使一個(gè)單個(gè)粒子對(duì)應(yīng)一個(gè)(表示單個(gè)粒子的存在的)信號(hào)。此外，擴(kuò)散移動(dòng)速度因單個(gè)粒子的特性的不同而變化，因此，如上所述，優(yōu)選的是本發(fā)明的裝置構(gòu)成為能夠根據(jù)單個(gè)粒子的特性(特別是擴(kuò)散系數(shù))適當(dāng)?shù)刈兏鈾z測區(qū)域的移動(dòng)速度。
[0032]可以通過任意的方式進(jìn)行光檢測區(qū)域的位置在樣本溶液內(nèi)的移動(dòng)。例如，可以使用在激光掃描型光學(xué)顯微鏡中所采用的檢電鏡(Galvano-miiror)等變更顯微鏡的光學(xué)系統(tǒng)的光路來變更光檢測區(qū)域的位置，或者可以(例如移動(dòng)顯微鏡的臺(tái)等)移動(dòng)樣本溶液的位置來移動(dòng)光檢測區(qū)域在樣本溶液內(nèi)的相對(duì)位置。光檢測區(qū)域的位置的移動(dòng)軌跡可以任意地設(shè)定，例如可以從圓形、橢圓形、矩形、直線以及曲線中選擇即可。特別是在變更顯微鏡的光學(xué)系統(tǒng)的光路來變更光檢測區(qū)域的位置的情況下，光檢測區(qū)域的移動(dòng)迅速，并且在樣本溶液中實(shí)質(zhì)上不發(fā)生機(jī)械振動(dòng)、流體動(dòng)力的作用，因此作為檢測對(duì)象的單個(gè)粒子不會(huì)受到力學(xué)作用的影響而能夠在穩(wěn)定的狀態(tài)下進(jìn)行光的測量，在這點(diǎn)上是有利的。
[0033]另外，在上述本發(fā)明的裝置的信號(hào)處理部的處理中，可以根據(jù)由光檢測部檢測出的按時(shí)間序列的表示光的信號(hào)的形狀來進(jìn)行根據(jù)逐次的來自光檢測部的檢測值的信號(hào)判斷是否一個(gè)粒子進(jìn)入到了光檢測區(qū)域的判斷。在一個(gè)實(shí)施方式中，可以在檢測出從背景光的強(qiáng)度起進(jìn)行計(jì)量而具有比規(guī)定的閾值高或低的光強(qiáng)度的信號(hào)時(shí)，判斷為一個(gè)單個(gè)粒子進(jìn)入到了光檢測區(qū)域。更具體地說，如后面的實(shí)施方式一欄中說明的那樣，通常表示單個(gè)粒子的存在的信號(hào)在光檢測部的按時(shí)間序列的檢測值、即光強(qiáng)度數(shù)據(jù)上表現(xiàn)為超過某種程度的強(qiáng)度的向上凸的吊鐘型的脈沖狀的信號(hào)(在發(fā)光粒子的情況下)、或者表現(xiàn)為低于某種程度的強(qiáng)度的向下凸的吊鐘型的脈沖狀的信號(hào)(在非發(fā)光粒子的情況下)，噪聲不是吊鐘型的脈沖狀或者表現(xiàn)為振幅小的信號(hào)。因此，本發(fā)明的裝置的信號(hào)處理部可以構(gòu)成為將時(shí)序光強(qiáng)度數(shù)據(jù)上從背景光的強(qiáng)度起進(jìn)行計(jì)量而超過規(guī)定閾值的向上凸的吊鐘型的脈沖狀的信號(hào)或低于規(guī)定閾值的向下凸的吊鐘型的脈沖狀的信號(hào)檢測為表示單個(gè)粒子的存在的信號(hào)。“規(guī)定閾值”能夠通過實(shí)驗(yàn)設(shè)定為適當(dāng)?shù)闹怠?br> [0034]并且，通過本發(fā)明的裝置得到的光強(qiáng)度比較微弱，產(chǎn)生細(xì)小的增加和減少，所述的光強(qiáng)度的細(xì)小的增加和減少使表示單個(gè)粒子的存在的信號(hào)的檢測精度變差。因此，信號(hào)處理部可以構(gòu)成為使按時(shí)間序列的光強(qiáng)度數(shù)據(jù)平滑化，在對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行加工以能夠忽略光強(qiáng)度的細(xì)小的增加和減少之后，將平滑化后的時(shí)序光強(qiáng)度數(shù)據(jù)上從背景光的強(qiáng)度起進(jìn)行計(jì)量而超過規(guī)定閾值的向上凸的吊鐘型的脈沖狀的信號(hào)或者具有低于規(guī)定閾值的強(qiáng)度的向下凸的吊鐘型的脈沖狀的信號(hào)檢測為表示單個(gè)粒子的存在的信號(hào)。
[0035]并且，在另一個(gè)實(shí)施方式中，單個(gè)粒子的信號(hào)的檢測處理可以通過以下方式進(jìn)行(參照日本特愿2012-32421):計(jì)算光強(qiáng)度數(shù)據(jù)上的光強(qiáng)度的時(shí)間變化的、假定在光檢測區(qū)域內(nèi)不存在單個(gè)粒子的狀態(tài)的情況下的產(chǎn)生概率和假定在光檢測區(qū)域內(nèi)存在單個(gè)粒子的狀態(tài)的情況下的產(chǎn)生概率，根據(jù)這些產(chǎn)生概率檢測單個(gè)粒子在光檢測區(qū)域內(nèi)存在的時(shí)間來檢測表示各個(gè)單個(gè)粒子的存在的信號(hào)。如果清楚地進(jìn)行描述，則在掃描分子計(jì)數(shù)法的時(shí)序光強(qiáng)度數(shù)據(jù)上發(fā)現(xiàn)，噪聲始終是隨機(jī)地瞬間的光強(qiáng)度的增大/下降，與此相對(duì)地，如果是單個(gè)粒子的信號(hào)，則是在時(shí)間上集中的光強(qiáng)度的增大/下降。即，單個(gè)粒子的信號(hào)和噪聲在時(shí)序光強(qiáng)度數(shù)據(jù)上的光強(qiáng)度值的時(shí)間變化的圖案不同，因此在時(shí)序光強(qiáng)度數(shù)據(jù)上的某部分的光強(qiáng)度值的時(shí)間變化的圖案為在光檢測區(qū)域內(nèi)沒有單個(gè)粒子的情況下容易產(chǎn)生的圖案時(shí)，能夠判斷為該部分是只有噪聲的部分，在時(shí)序光強(qiáng)度數(shù)據(jù)上的某部分的光強(qiáng)度值的時(shí)間變化的圖案為在光檢測區(qū)域內(nèi)存在單個(gè)粒子的情況下容易產(chǎn)生的圖案時(shí)，能夠判斷為該部分是與單個(gè)粒子的信號(hào)對(duì)應(yīng)的部分。因此，計(jì)算在時(shí)序光強(qiáng)度數(shù)據(jù)上出現(xiàn)的光強(qiáng)度值的時(shí)間變化的圖案的、在光檢測區(qū)域內(nèi)存在單個(gè)粒子的情況和不存在單個(gè)粒子的情況的各個(gè)情況下產(chǎn)生的概率，辨別該光強(qiáng)度值的時(shí)間變化的圖案是在光檢測區(qū)域內(nèi)存在單個(gè)粒子的情況和在光檢測區(qū)域內(nèi)不存在單個(gè)粒子的情況的哪一個(gè)情況下容易產(chǎn)生的圖案，由此能夠檢測單個(gè)粒子的信號(hào)。
[0036]并且，在上述本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，可以對(duì)信號(hào)的個(gè)數(shù)進(jìn)行計(jì)數(shù)來對(duì)包含在光檢測區(qū)域中的單個(gè)粒子的個(gè)數(shù)進(jìn)行計(jì)數(shù)(粒子的計(jì)數(shù))。在這種情況下，通過將所檢測出的單個(gè)粒子的個(gè)數(shù)和光檢測區(qū)域的位置的移動(dòng)量組合，能夠獲得與樣本溶液中的被分類的單個(gè)粒子的數(shù)密度或濃度有關(guān)的信息。具體地說，例如可以計(jì)算多個(gè)樣本溶液的數(shù)密度或濃度之比，或者計(jì)算相對(duì)于作為濃度或數(shù)密度的基準(zhǔn)的標(biāo)準(zhǔn)樣本溶液的相對(duì)的數(shù)密度或濃度之比，或者使用相對(duì)于作為濃度或數(shù)密度的基準(zhǔn)的標(biāo)準(zhǔn)樣本溶液的相對(duì)的數(shù)密度或濃度之比來確定絕對(duì)的數(shù)密度值或濃度值?；蛘撸绻ㄟ^任意的方法、例如以規(guī)定的速度移動(dòng)光檢測區(qū)域的位置等而能夠確定出光檢測區(qū)域的位置的移動(dòng)軌跡的總體積，則能夠具體估算單個(gè)粒子的數(shù)密度或濃度。特別地，在本發(fā)明的情況下，能夠?qū)旌洗嬖谟谕粯颖救芤褐械陌l(fā)光粒子和非發(fā)光粒子分別分開地進(jìn)行計(jì)數(shù)和/或濃度的估算。
[0037]此外，關(guān)于如上所述的粒子的計(jì)數(shù)，在其典型的方式中是對(duì)在任意設(shè)定的測量時(shí)間中獲得的單個(gè)粒子的信號(hào)的個(gè)數(shù)進(jìn)行計(jì)數(shù)。然而，在這種情況下，根據(jù)設(shè)定的測量時(shí)間的長度的不同而檢測出的單個(gè)粒子的信號(hào)數(shù)發(fā)生變動(dòng)，特別地，在單個(gè)粒子濃度低時(shí)，基于檢測信號(hào)數(shù)估算的單個(gè)粒子濃度值的偏差變大而精度可能下降。因此，在上述本發(fā)明的裝置中，作為粒子計(jì)數(shù)的其它方式，可以執(zhí)行測量直到單個(gè)粒子的信號(hào)數(shù)達(dá)到任意設(shè)定的個(gè)數(shù)為止，根據(jù)測量時(shí)間估算單個(gè)粒子濃度值。即，上述本發(fā)明的裝置可以構(gòu)成為重復(fù)進(jìn)行光檢測區(qū)域移動(dòng)部使光學(xué)系統(tǒng)的光檢測區(qū)域的位置的移動(dòng)、光檢測部對(duì)來自光檢測區(qū)域的光的檢測以及信號(hào)處理部對(duì)表示單個(gè)粒子的存在的信號(hào)的檢測直到信號(hào)處理部檢測出的表示單個(gè)粒子的存在的信號(hào)的個(gè)數(shù)達(dá)到預(yù)先決定的個(gè)數(shù)為止，根據(jù)表示單個(gè)粒子的存在的信號(hào)的個(gè)數(shù)達(dá)到預(yù)先決定的個(gè)數(shù)所需要的時(shí)間來確定樣本溶液中的單個(gè)粒子的濃度。在這種情況下，對(duì)于單個(gè)粒子的濃度高的樣本溶液，期待測量時(shí)間的縮短，對(duì)于單個(gè)粒子的濃度低的樣本溶液，花費(fèi)充分的時(shí)間執(zhí)行測量。即，根據(jù)上述結(jié)構(gòu)，與單個(gè)粒子的濃度相應(yīng)地使測量時(shí)間最優(yōu)化。另外，如果事先將預(yù)先決定的個(gè)數(shù)設(shè)定為達(dá)成結(jié)果所要求的精度的個(gè)數(shù)，則能夠?qū)z測預(yù)先決定的該個(gè)數(shù)的單個(gè)粒子所需要的時(shí)間或基于時(shí)間導(dǎo)出的任意結(jié)果中的偏差抑制得小，從而滿足結(jié)果的精度。
[0038]在上述本發(fā)明的裝置中，也能夠通過通用的計(jì)算機(jī)實(shí)現(xiàn)一邊使光檢測區(qū)域的位置在發(fā)光粒子和非發(fā)光粒子混合存在的樣本溶液內(nèi)移動(dòng)一邊在背景光的存在下進(jìn)行光檢測并將光強(qiáng)度或光量的增大或下降分別逐次地檢測為發(fā)光粒子或非發(fā)光粒子的信號(hào)的單個(gè)粒子檢測技術(shù)的處理。因而，根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)方式，提供一單個(gè)粒子檢測用計(jì)算機(jī)程序，用于使用共焦顯微鏡或多光子顯微鏡的光學(xué)系統(tǒng)檢測在樣本溶液中分散且隨機(jī)運(yùn)動(dòng)的單個(gè)粒子，該單個(gè)粒子檢測用計(jì)算機(jī)程序使計(jì)算機(jī)執(zhí)行以下步驟:使顯微鏡的光學(xué)系統(tǒng)的光檢測區(qū)域的位置在樣本溶液內(nèi)移動(dòng)；一邊使光檢測區(qū)域的位置在樣本溶液內(nèi)移動(dòng)一邊檢測來自光檢測區(qū)域的光并生成按時(shí)間序列的光強(qiáng)度數(shù)據(jù)；以及在按時(shí)間序列的光強(qiáng)度數(shù)據(jù)中逐個(gè)檢測表示各個(gè)單個(gè)粒子的存在的信號(hào)；其中，檢測出的來自光檢測區(qū)域的光包含實(shí)質(zhì)固定的背景光，單個(gè)粒子包含具有比背景光的發(fā)光強(qiáng)度高的發(fā)光強(qiáng)度的第一單個(gè)粒子和具有比背景光的發(fā)光強(qiáng)度低的發(fā)光強(qiáng)度的第二單個(gè)粒子，第一單個(gè)粒子的信號(hào)為在該第一單個(gè)粒子進(jìn)入到光檢測區(qū)域內(nèi)時(shí)產(chǎn)生的、被檢測出的光強(qiáng)度的增大，第二單個(gè)粒子的信號(hào)為在該第二單個(gè)粒子進(jìn)入到光檢測區(qū)域內(nèi)時(shí)產(chǎn)生的、被檢測出的光強(qiáng)度的下降。此外，通過存儲(chǔ)到計(jì)算機(jī)能夠讀取的存儲(chǔ)介質(zhì)中來提供計(jì)算機(jī)程序。計(jì)算機(jī)通過讀出存儲(chǔ)在存儲(chǔ)介質(zhì)中的程序來執(zhí)行信息的加工、運(yùn)算處理，由此實(shí)現(xiàn)上述步驟。在此，計(jì)算機(jī)能夠讀取的記錄介質(zhì)可以是磁盤、磁光盤、⑶_R0M、DVD-R0M、半導(dǎo)體存儲(chǔ)器等。并且，上述的程序也可以通過通信線路傳輸?shù)接?jì)算機(jī)，由接受該傳輸?shù)挠?jì)算機(jī)來執(zhí)行程序。
[0039]在所述的結(jié)構(gòu)中也同樣，背景光可以是分散在樣本溶液內(nèi)的物質(zhì)產(chǎn)生的熒光、磷光、化學(xué)發(fā)光、生物發(fā)光或散射光、或者是照明光。另外，優(yōu)選的是，調(diào)整背景光強(qiáng)度以及發(fā)光粒子和非發(fā)光粒子的發(fā)光強(qiáng)度，使得在發(fā)光粒子的發(fā)光強(qiáng)度與背景光強(qiáng)度之間的關(guān)系中，從每單位體積的發(fā)光粒子(第一單個(gè)粒子)釋放的發(fā)光強(qiáng)度超過從每單位體積的光檢測區(qū)域內(nèi)發(fā)出的背景光強(qiáng)度，并且在非發(fā)光粒子的發(fā)光強(qiáng)度與背景光強(qiáng)度之間的關(guān)系中，從每單位體積的非發(fā)光粒子(第二單個(gè)粒子)釋放的發(fā)光強(qiáng)度低于從每單位體積的光檢測區(qū)域內(nèi)發(fā)出的背景光強(qiáng)度。特別地，非發(fā)光粒子的外徑優(yōu)選為光檢測區(qū)域的直徑的15%以上，更優(yōu)選為光檢測區(qū)域的直徑的35%以上。
[0040]另外，在上述的計(jì)算機(jī)程序中，也可以根據(jù)按時(shí)間序列的信號(hào)的形狀來進(jìn)行表示各個(gè)單個(gè)粒子的存在的信號(hào)的逐個(gè)檢測。在實(shí)施方式中，典型地是，在逐個(gè)檢測表示單個(gè)粒子的存在的信號(hào)的步驟中，可以形成為在檢測出從背景光的強(qiáng)度起進(jìn)行計(jì)量而具有高于規(guī)定的閾值的光強(qiáng)度的信號(hào)時(shí)，判斷為一個(gè)發(fā)光粒子進(jìn)入到了光檢測區(qū)域，在檢測出從背景光的強(qiáng)度起進(jìn)行計(jì)量而具有低于規(guī)定的閾值的光強(qiáng)度的信號(hào)時(shí)，判斷為一個(gè)非發(fā)光粒子進(jìn)入到了光檢測區(qū)域。具體地說，在逐個(gè)檢測表示單個(gè)粒子的存在的信號(hào)的步驟中，可以將時(shí)序光強(qiáng)度數(shù)據(jù)上從背景光的強(qiáng)度起進(jìn)行計(jì)量而具有超過規(guī)定閾值的強(qiáng)度的向上凸的吊鐘型的脈沖狀信號(hào)檢測為表示發(fā)光粒子的存在的信號(hào)，將從背景光的強(qiáng)度起進(jìn)行計(jì)量而具有低于規(guī)定閾值的強(qiáng)度的向下凸的吊鐘型的脈沖狀信號(hào)檢測為表示非發(fā)光粒子的存在的信號(hào)，此時(shí)，可以對(duì)時(shí)序光強(qiáng)度數(shù)據(jù)進(jìn)行平滑化，將平滑化后的時(shí)序光強(qiáng)度數(shù)據(jù)上的吊鐘型的脈沖狀信號(hào)檢測為表示單個(gè)粒子的存在的信號(hào)?；蛘?，作為不同的、表示各個(gè)單個(gè)粒子的存在的信號(hào)的逐個(gè)檢測的其它方式，也可以對(duì)在時(shí)序光強(qiáng)度數(shù)據(jù)上出現(xiàn)的光強(qiáng)度值的時(shí)間變化的圖案計(jì)算其在光檢測區(qū)域內(nèi)存在單個(gè)粒子的情況和不存在單個(gè)粒子的情況的各情況下產(chǎn)生的概率，辨別該光強(qiáng)度值的時(shí)間變化的圖案是在光檢測區(qū)域內(nèi)存在單個(gè)粒子的情況和不存在單個(gè)粒子的情況的哪一個(gè)情況下容易產(chǎn)生的圖案，由此進(jìn)行單個(gè)粒子的信號(hào)的檢測。
[0041]并且，可以根據(jù)單個(gè)粒子的特性、樣本溶液中的數(shù)密度或濃度來適當(dāng)?shù)刈兏鈾z測區(qū)域的位置在樣本溶液內(nèi)的移動(dòng)速度，優(yōu)選的是，將光檢測區(qū)域的位置在樣本溶液內(nèi)的移動(dòng)速度設(shè)定得比作為檢測對(duì)象的單個(gè)粒子的擴(kuò)散移動(dòng)速度高?？梢酝ㄟ^任意的方式進(jìn)行光檢測區(qū)域的位置這樣本溶液內(nèi)的移動(dòng)，優(yōu)選的是，可以通過變更顯微鏡的光學(xué)系統(tǒng)的光路或者移動(dòng)樣本溶液的位置來變更光檢測區(qū)域的位置。可以任意地設(shè)定光檢測區(qū)域的位置的移動(dòng)軌跡，例如可以從圓形、橢圓形、矩形、直線以及曲線中選擇即可。
[0042]并且，在上述的計(jì)算機(jī)程序中也同樣，可以包括以下步驟:對(duì)逐個(gè)檢測出的單個(gè)粒子的信號(hào)的個(gè)數(shù)進(jìn)行計(jì)數(shù)來對(duì)在光檢測區(qū)域的位置的移動(dòng)過程中檢測出的單個(gè)粒子的個(gè)數(shù)進(jìn)行計(jì)數(shù)；和/或根據(jù)檢測出的單個(gè)粒子的個(gè)數(shù)來確定樣本溶液中的單個(gè)粒子的數(shù)密度或濃度。此外，在上述的計(jì)算機(jī)程序的情況下也同樣，在粒子的計(jì)數(shù)中，典型地是，對(duì)在任意設(shè)定的測量時(shí)間中獲得的單個(gè)粒子的信號(hào)的個(gè)數(shù)進(jìn)行計(jì)數(shù)，但是也可以執(zhí)行測量直到單個(gè)粒子的信號(hào)數(shù)達(dá)到任意設(shè)定的個(gè)數(shù)為止，根據(jù)測量時(shí)間估算單個(gè)粒子濃度值。因而，上述的計(jì)算機(jī)程序也可以包括以下步驟:重復(fù)進(jìn)行光檢測區(qū)域的位置的移動(dòng)、來自光檢測區(qū)域的光的檢測以及表示單個(gè)粒子的存在的信號(hào)的檢測直到表示單個(gè)粒子的存在的信號(hào)的個(gè)數(shù)達(dá)到預(yù)先決定的個(gè)數(shù)為止，根據(jù)表示單個(gè)粒子的存在的信號(hào)的個(gè)數(shù)達(dá)到預(yù)先決定的個(gè)數(shù)所需要的時(shí)間來確定樣本溶液中的單個(gè)粒子的濃度。
[0043]根據(jù)上述本發(fā)明的裝置或計(jì)算機(jī)程序，實(shí)現(xiàn)一邊使光檢測區(qū)域的位置在發(fā)光粒子和非發(fā)光粒子混合存在的樣本溶液內(nèi)移動(dòng)一邊在背景光的存在下進(jìn)行光檢測并將光強(qiáng)度或光量的增大或下降分別逐次地檢測為發(fā)光粒子或非發(fā)光粒子的信號(hào)的新的方法。這樣，根據(jù)本發(fā)明，還提供一種單個(gè)粒子檢測方法，使用共焦顯微鏡或多光子顯微鏡的光學(xué)系統(tǒng)檢測在樣本溶液中分散且隨機(jī)運(yùn)動(dòng)的單個(gè)粒子，該單個(gè)粒子檢測方法的特征在于，包括以下過程:使顯微鏡的光學(xué)系統(tǒng)的光檢測區(qū)域的位置在樣本溶液內(nèi)移動(dòng)；一邊使光檢測區(qū)域的位置在樣本溶液內(nèi)移動(dòng)一邊檢測來自光檢測區(qū)域的光并生成按時(shí)間序列的光強(qiáng)度數(shù)據(jù)；以及在按時(shí)間序列的光強(qiáng)度數(shù)據(jù)中逐個(gè)檢測表示各個(gè)單個(gè)粒子的存在的信號(hào)，其中，檢測出的來自光檢測區(qū)域的光包含實(shí)質(zhì)固定的背景光，單個(gè)粒子包含具有比背景光的發(fā)光強(qiáng)度高的發(fā)光強(qiáng)度的第一單個(gè)粒子和具有比背景光的發(fā)光強(qiáng)度低的發(fā)光強(qiáng)度的第二單個(gè)粒子，第一單個(gè)粒子的上述信號(hào)為在第一單個(gè)粒子進(jìn)入到光檢測區(qū)域內(nèi)時(shí)產(chǎn)生的、被檢測出的光強(qiáng)度的增大，第二單個(gè)粒子的上述信號(hào)為在第二單個(gè)粒子進(jìn)入到光檢測區(qū)域內(nèi)時(shí)產(chǎn)生的、被檢測出的光強(qiáng)度的下降。
[0044]在所述結(jié)構(gòu)中也同樣，背景光可以是分散在樣本溶液內(nèi)的物質(zhì)產(chǎn)生的突光、磷光、化學(xué)發(fā)光、生物發(fā)光或散射光、或者是照明光。另外，優(yōu)選的是，調(diào)整背景光強(qiáng)度以及發(fā)光粒子和非發(fā)光粒子的發(fā)光強(qiáng)度，使得在發(fā)光粒子的發(fā)光強(qiáng)度與背景光強(qiáng)度之間的關(guān)系中，從每單位體積的發(fā)光粒子(第一單個(gè)粒子)釋放的發(fā)光強(qiáng)度超過從每單位體積的光檢測區(qū)域內(nèi)發(fā)出的背景光強(qiáng)度，并且在非發(fā)光粒子的發(fā)光強(qiáng)度與背景光強(qiáng)度之間的關(guān)系中，從每單位體積的非發(fā)光粒子(第二單個(gè)粒子)釋放的發(fā)光強(qiáng)度低于從每單位體積的光檢測區(qū)域內(nèi)發(fā)出的背景光強(qiáng)度。特別地，非發(fā)光粒子的外徑優(yōu)選為光檢測區(qū)域的直徑的15%以上，更優(yōu)選為光檢測區(qū)域的直徑的35%以上。
[0045]另外，在上述的方法中也同樣，可以根據(jù)按時(shí)間序列的信號(hào)的形狀來進(jìn)行表示各個(gè)單個(gè)粒子的存在的信號(hào)的逐個(gè)檢測。在實(shí)施方式中，典型地是，在逐個(gè)檢測表示單個(gè)粒子的存在的信號(hào)的過程中，可以在檢測出從背景光的強(qiáng)度起進(jìn)行計(jì)量而具有高于規(guī)定的閾值的光強(qiáng)度的信號(hào)時(shí)，判斷為一個(gè)發(fā)光粒子進(jìn)入到了光檢測區(qū)域，在檢測出從背景光的強(qiáng)度起進(jìn)行計(jì)量而具有低于規(guī)定的閾值的光強(qiáng)度的信號(hào)時(shí)，判斷為一個(gè)非發(fā)光粒子進(jìn)入到了光檢測區(qū)域。具體地說，在逐個(gè)檢測表示單個(gè)粒子的存在的信號(hào)的過程中，將時(shí)序光強(qiáng)度數(shù)據(jù)上從背景光的強(qiáng)度起進(jìn)行計(jì)量而具有超過規(guī)定閾值的強(qiáng)度的向上凸的吊鐘型的脈沖狀信號(hào)檢測為表示發(fā)光粒子的存在的信號(hào)，將從背景光的強(qiáng)度起進(jìn)行計(jì)量而具有低于規(guī)定閾值的強(qiáng)度的向下凸的吊鐘型的脈沖狀信號(hào)檢測為表示非發(fā)光粒子的存在的信號(hào)，此時(shí)，可以使時(shí)序光強(qiáng)度數(shù)據(jù)平滑化，將平滑化后的時(shí)序光強(qiáng)度數(shù)據(jù)上的吊鐘型的脈沖狀信號(hào)檢測為表示單個(gè)粒子的存在的信號(hào)。或者，作為表示各個(gè)單個(gè)粒子的存在的信號(hào)的逐個(gè)檢測的其它方式，也可以對(duì)在時(shí)序光強(qiáng)度數(shù)據(jù)上出現(xiàn)的光強(qiáng)度值的時(shí)間變化的圖案計(jì)算其在光檢測區(qū)域內(nèi)存在單個(gè)粒子的情況和不存在單個(gè)粒子的情況的各情況下產(chǎn)生的概率，辨別該光強(qiáng)度值的時(shí)間變化的圖案是在光檢測區(qū)域內(nèi)存在單個(gè)粒子的情況和不存在單個(gè)粒子的情況的哪一個(gè)情況下容易產(chǎn)生的圖案，由此進(jìn)行單個(gè)粒子的信號(hào)的檢測。
[0046]并且，可以根據(jù)單個(gè)粒子的特性、樣本溶液中的數(shù)密度或濃度適當(dāng)?shù)刈兏鈾z測區(qū)域的位置在樣本溶液內(nèi)的移動(dòng)速度，優(yōu)選的是，將光檢測區(qū)域的位置在樣本溶液內(nèi)的移動(dòng)速度設(shè)定得比作為檢測對(duì)象的單個(gè)粒子的擴(kuò)散移動(dòng)速度高?？梢酝ㄟ^任意的方式進(jìn)行光檢測區(qū)域的位置在樣本溶液內(nèi)的移動(dòng)，優(yōu)選的是，可以通過變更顯微鏡的光學(xué)系統(tǒng)的光路或者移動(dòng)樣本溶液的位置來變更光檢測區(qū)域的位置?？梢匀我獾卦O(shè)定光檢測區(qū)域的位置的移動(dòng)軌跡，例如可以從圓形、橢圓形、矩形、直線以及曲線中選擇即可。
[0047]并且，在上述的方法中也可以包含以下過程:對(duì)逐個(gè)檢測出的單個(gè)粒子的信號(hào)的個(gè)數(shù)進(jìn)行計(jì)數(shù)來對(duì)在光檢測區(qū)域的位置的移動(dòng)過程中檢測出的單個(gè)粒子的個(gè)數(shù)進(jìn)行計(jì)數(shù)；和/或根據(jù)檢測出的單個(gè)粒子的個(gè)數(shù)來確定樣本溶液中的單個(gè)粒子的數(shù)密度或濃度。此夕卜，在上述的方法的情況下也同樣，在粒子的計(jì)數(shù)中，典型地是，對(duì)在任意設(shè)定的測量時(shí)間中獲得的單個(gè)粒子的信號(hào)的個(gè)數(shù)進(jìn)行計(jì)數(shù)，但是也可以執(zhí)行測量直到單個(gè)粒子的信號(hào)數(shù)達(dá)到任意設(shè)定的個(gè)數(shù)為止，根據(jù)測量時(shí)間估算單個(gè)粒子濃度值。因而，上述的方法也可以包括以下過程:重復(fù)進(jìn)行光檢測區(qū)域的位置的移動(dòng)、來自光檢測區(qū)域的光的檢測以及表示單個(gè)粒子的存在的信號(hào)的檢測直到表示單個(gè)粒子的存在的信號(hào)的個(gè)數(shù)達(dá)到預(yù)先決定的個(gè)數(shù)為止，根據(jù)表示單個(gè)粒子的存在的信號(hào)的個(gè)數(shù)達(dá)到預(yù)先決定的個(gè)數(shù)所需要的時(shí)間來確定樣本溶液中的單個(gè)粒子的濃度。
[0048]上述本發(fā)明的單個(gè)粒子檢測技術(shù)典型地用于分析或解析蛋白質(zhì)、肽、核酸、月旨質(zhì)、糖鏈、氨基酸或它們的聚合體等生物體分子、病毒、細(xì)胞等粒子狀的生物學(xué)對(duì)象物在溶液中的狀態(tài)的用途，但是也可以用于分析或解析非生物學(xué)粒子(例如原子、分子、膠束(micelles)、脂質(zhì)體、金屬膠體、微珠(磁珠、聚苯乙烯珠、膠乳珠等)、消光劑(偶氮苯類(dabcyl、BHQ等))、金屬粒子等)在溶液中的狀態(tài)，應(yīng)該理解為這種情況也屬于本發(fā)明的范圍。
[0049]發(fā)明的效果
[0050]如果清楚地進(jìn)行描述，本發(fā)明的單個(gè)粒子檢測技術(shù)是依照掃描分子計(jì)數(shù)法來在溶液中分散有發(fā)光粒子和非發(fā)光粒子的情況下進(jìn)行這些單個(gè)粒子的檢測的技術(shù)。應(yīng)該理解的是，根據(jù)本發(fā)明的技術(shù)，通過一個(gè)檢測光波長頻帶下的光測量能夠同時(shí)檢測發(fā)光粒子和非發(fā)光粒子的存在。因而，在本發(fā)明的技術(shù)中，通過將發(fā)光粒子和非發(fā)光粒子調(diào)制為不同種類的觀測對(duì)象粒子，能夠通過一次測量來針對(duì)兩種觀測對(duì)象粒子進(jìn)行各個(gè)種類的存在檢測、粒子的計(jì)數(shù)、濃度檢測等。
[0051]通過本發(fā)明的以下優(yōu)選實(shí)施方式的說明可清楚本發(fā)明的其它目的和優(yōu)點(diǎn)。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0052]圖1的(A)是本發(fā)明的執(zhí)行掃描分子計(jì)數(shù)法的單個(gè)粒子檢測裝置的內(nèi)部構(gòu)造的示意圖。圖1的(B)是共焦區(qū)組織(共焦顯微鏡的光檢測區(qū)域)的示意圖。圖1的(C)是變更反射鏡7的朝向使光檢測區(qū)域的位置在樣本溶液內(nèi)移動(dòng)的機(jī)構(gòu)的示意圖。圖1的(D)是移動(dòng)微板的水平方向位置來移動(dòng)樣本溶液內(nèi)的光檢測區(qū)域的位置的機(jī)構(gòu)的示意圖。
[0053]圖2的(A)、⑶分別是說明本發(fā)明的掃描分子計(jì)數(shù)法中的檢測單個(gè)粒子的存在的原理的示意圖以及所測量的光強(qiáng)度的時(shí)間變化的示意圖。
[0054]圖3是以流程圖的形式表示依照本發(fā)明執(zhí)行的掃描分子計(jì)數(shù)法的處理步驟的一個(gè)方式(時(shí)序光強(qiáng)度數(shù)據(jù)的平滑化以及利用吊鐘型函數(shù)的擬合進(jìn)行的單個(gè)粒子信號(hào)的檢測)的圖。
[0055]圖4的(A)、(B)分別是表示在單個(gè)粒子一邊進(jìn)行布朗運(yùn)動(dòng)一邊橫穿光檢測區(qū)域時(shí)以及在通過以比單個(gè)粒子的擴(kuò)散移動(dòng)速度快的速度使樣本溶液內(nèi)的光檢測區(qū)域的位置移動(dòng)而粒子橫穿光檢測區(qū)域時(shí)的粒子的運(yùn)動(dòng)方式的模型圖。圖4的(C)是說明用于依照?qǐng)D3的處理根據(jù)所測量的時(shí)序光強(qiáng)度數(shù)據(jù)(光子計(jì)數(shù)的時(shí)間變化)檢測單個(gè)粒子的存在的處理步驟中的檢測信號(hào)的信號(hào)處理過程的例子的圖。
[0056]圖5是說明基于時(shí)序光強(qiáng)度數(shù)據(jù)上的光強(qiáng)度變化的產(chǎn)生概率的單個(gè)粒子信號(hào)的檢測原理的圖。(A)表示時(shí)序光強(qiáng)度數(shù)據(jù)的示意性的例子。(左)圖是存在亮度大的發(fā)光粒子的情況。(中)圖是存在亮度小的發(fā)光粒子的情況。(右)圖是不存在發(fā)光粒子的情況。(B)是說明在本發(fā)明中在時(shí)序光強(qiáng)度數(shù)據(jù)上設(shè)定的解析窗的圖。
[0057]圖6是以流程圖的形式表示依照本發(fā)明執(zhí)行的掃描分子計(jì)數(shù)法的處理過程的另一方式(基于時(shí)序光強(qiáng)度數(shù)據(jù)上的光強(qiáng)度變化的產(chǎn)生概率檢測單個(gè)粒子信號(hào))的圖。
[0058]圖7是以流程圖的形式表示依照本發(fā)明執(zhí)行的掃描分子計(jì)數(shù)法的處理過程的另一方式(執(zhí)行單個(gè)粒子信號(hào)的檢測直到計(jì)數(shù)出規(guī)定的粒子數(shù)為止的情況)的圖。
[0059]圖8的(A)示出依照本發(fā)明的掃描分子計(jì)數(shù)法獲得的時(shí)序光強(qiáng)度數(shù)據(jù)(光子計(jì)數(shù)數(shù)據(jù))的一部分。圖8的(B)示出分別假定(A)的數(shù)據(jù)中存在非發(fā)光粒子的情況和不存在非發(fā)光粒子的情況而計(jì)算出的產(chǎn)生概率的比值比，圖8的(C)示出分別假定(A)的數(shù)據(jù)中存在發(fā)光粒子的情況和不存在發(fā)光粒子的情況而計(jì)算出的產(chǎn)生概率的比值比。
[0060]圖9表示對(duì)不含粒子的溶液(0:0)、僅含非發(fā)光粒子的溶液(2:0)、僅含發(fā)光粒子的溶液(0:2)、包含發(fā)光粒子和非發(fā)光粒子的溶液(1:1)依照本發(fā)明的掃描分子計(jì)數(shù)法檢測出的脈沖數(shù)的平均值(直方圖表)和標(biāo)準(zhǔn)偏差(誤差條)。
[0061]附圖標(biāo)記說明
[0062]1:光分析裝置(共焦顯微鏡)；2:光源；3:單模光纖(single-mode opticalfiber) ；4:準(zhǔn)直透鏡；5:分色鏡；6、7、11:反射鏡；8:物鏡；9:微板；10:皿(樣本溶液容器)；12:聚光鏡(condenser lens) ；13:針孔；14:屏蔽濾波器；14a:分色鏡或偏振分束器；15:多模光纖(mult1-mode optical fiber) ；16:光檢測器；17:反射鏡偏轉(zhuǎn)器；17a:臺(tái)位置變更裝置；18:計(jì)算機(jī)。

【具體實(shí)施方式】
[0063]下面，詳細(xì)說明本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式。
_4] 單個(gè)粒子檢測裝置的結(jié)構(gòu)
[0065]實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的單個(gè)粒子檢測技術(shù)的單個(gè)粒子檢測裝置可以是如下的裝置:在基本結(jié)構(gòu)中，如圖1的(A)示意性地例示那樣，組合能夠執(zhí)行FCS、FIDA等的共焦顯微鏡的光學(xué)系統(tǒng)和光檢測器而成。參照該圖，單個(gè)粒子檢測裝置I由光學(xué)系統(tǒng)2?17以及用于控制光學(xué)系統(tǒng)的各部分的動(dòng)作并且獲取并解析數(shù)據(jù)的計(jì)算機(jī)18構(gòu)成。單個(gè)粒子檢測裝置I的光學(xué)系統(tǒng)可以與普通的共焦顯微鏡的光學(xué)系統(tǒng)相同，在此，使從光源2發(fā)射并在單模光纖3內(nèi)傳播的激光(Ex)在光纖的出射端成為以由固有的NA決定的角度發(fā)散的光而被發(fā)射，通過準(zhǔn)直器4成為平行光，被分色鏡5、反射鏡6、7反射，入射到物鏡8。
[0066]典型地是，在物鏡8的上方配置有微板9，該微板9排列有注入了 I μ L?幾十μ L的樣本溶液的樣本容器或皿10，從物鏡8射出的激光在樣本容器或皿10內(nèi)的樣本溶液中聚焦，形成光強(qiáng)度強(qiáng)的區(qū)域(激勵(lì)區(qū)域)。此外，在樣本溶液中典型地是分散或溶解有作為觀測對(duì)象物的發(fā)光粒子、非發(fā)光粒子以及產(chǎn)生背景光的任意的發(fā)光物質(zhì)，在觀測對(duì)象粒子未進(jìn)入激勵(lì)區(qū)域時(shí)，發(fā)光物質(zhì)被激勵(lì)而釋放出實(shí)質(zhì)固定的光成為背景光，當(dāng)非發(fā)光粒子進(jìn)入激勵(lì)區(qū)域時(shí)，背景光降低，當(dāng)發(fā)光粒子進(jìn)入激勵(lì)區(qū)域時(shí)，發(fā)光粒子釋放的光加上背景光而光強(qiáng)度增大。
[0067]這樣，從激勵(lì)區(qū)域釋放出的光(Em)通過物鏡8、分色鏡5，被反射鏡11反射而在聚光鏡12聚光，通過針孔13，透過屏蔽濾波器14 (在此，只選擇特定波長頻帶的光成分。)，被導(dǎo)入到多模光纖15，到達(dá)光檢測器16，在被變換為按時(shí)間序列的電信號(hào)之后輸入到計(jì)算機(jī)18，以后面說明的方式進(jìn)行用于單個(gè)粒子檢測的處理。此外，如本領(lǐng)域技術(shù)人員所了解的那樣，在上述結(jié)構(gòu)中，針孔13配置在與物鏡8的焦點(diǎn)位置共軛的位置，由此僅從如圖1的(B)示意性地表示的激光的焦點(diǎn)區(qū)域、即激勵(lì)區(qū)域內(nèi)發(fā)出的光通過針孔13，來自激勵(lì)區(qū)域以外的光被遮斷。圖1的(B)所例示的激光的焦點(diǎn)區(qū)域通常是具有IfL?1fL左右的有效體積的本光分析裝置中的光檢測區(qū)域(典型地是光強(qiáng)度以區(qū)域中心為頂點(diǎn)的高斯型分布。有效體積是以光強(qiáng)度為Ι/e2的面為邊界的大致橢圓球體的體積。)，被稱為共焦區(qū)組織。
[0068]另外，在本發(fā)明中，檢測由來自幾個(gè)分子左右的熒光色素分子的微弱光構(gòu)成的背景光存在下的、由于單個(gè)粒子的存在而引起的光量的增大或下降，因此作為光檢測器16，優(yōu)選使用能夠在光子計(jì)數(shù)中使用的超高靈敏度的光檢測器。在光的檢測是通過光子計(jì)數(shù)進(jìn)行的情況下，以在規(guī)定時(shí)間內(nèi)按每個(gè)規(guī)定的單位時(shí)間(BIN TIME)逐次測量來到光檢測器的光子的個(gè)數(shù)的方式執(zhí)行光強(qiáng)度的測量。因而，在這種情況下，按時(shí)間序列的光強(qiáng)度的數(shù)據(jù)是按時(shí)間序列的光子計(jì)數(shù)數(shù)據(jù)。另外，可以在顯微鏡的臺(tái)(未圖示)設(shè)置用于移動(dòng)微板9的水平方向位置以變更要觀察的皿10的臺(tái)位置變更裝置17a?？梢杂捎?jì)算機(jī)18控制臺(tái)位置變更裝置17a的動(dòng)作。根據(jù)所述結(jié)構(gòu)，在存在多個(gè)檢體的情況下也能夠達(dá)成迅速的測量。
[0069]并且，在上述的單個(gè)粒子檢測裝置的光學(xué)系統(tǒng)中，設(shè)置有用于通過光檢測區(qū)域掃描樣本溶液內(nèi)的、即用于使焦點(diǎn)區(qū)域即光檢測區(qū)域的位置在樣本溶液內(nèi)移動(dòng)的機(jī)構(gòu)。作為所述的用于使光檢測區(qū)域的位置移動(dòng)的機(jī)構(gòu)，例如圖1的(C)示意性地例示的那樣，可以采用變更反射鏡7的朝向的反射鏡偏轉(zhuǎn)器17 (移動(dòng)光檢測區(qū)域的絕對(duì)位置的方式)。所述反射鏡偏轉(zhuǎn)器17可以與在通常的激光掃描型顯微鏡中裝備的檢電鏡裝置相同?；蛘撸鳛槠渌姆绞?，如圖1的(D)所例示的那樣，也可以使臺(tái)位置變更裝置17a進(jìn)行動(dòng)作以移動(dòng)注入了樣本溶液的容器10(微板9)的水平方向的位置而使光檢測區(qū)域在樣本溶液內(nèi)的相對(duì)位置移動(dòng)(使樣本溶液的絕對(duì)位置移動(dòng)的方式)。無論在哪種方式的情況下，都在計(jì)算機(jī)18的控制下，與光檢測器16的光檢測協(xié)調(diào)地驅(qū)動(dòng)反射鏡偏轉(zhuǎn)器17或臺(tái)位置變更裝置17a以達(dá)成所期望的光檢測區(qū)域的位置的移動(dòng)圖案?？梢詮膱A形、橢圓形、矩形、直線、曲線或它們的組合中任意地選擇光檢測區(qū)域的位置的移動(dòng)軌跡(可以設(shè)為在計(jì)算機(jī)18中的程序中能夠選擇各種移動(dòng)圖案。)。另外，可以將使光檢測區(qū)域的絕對(duì)位置移動(dòng)的方式與使樣本溶液的絕對(duì)位置移動(dòng)的方式組合來使樣本溶液的位置移動(dòng)并執(zhí)行光檢測區(qū)域的絕對(duì)位置的移動(dòng)。在這種情況下，避免由于光檢測區(qū)域在短時(shí)間內(nèi)通過同一區(qū)域而反復(fù)檢測同一單個(gè)粒子?；蛘?，也可以通過使光檢測區(qū)域的絕對(duì)位置移動(dòng)的方式，有意地使光檢測區(qū)域反復(fù)通過同一區(qū)域，來周期性地多次檢測同一單個(gè)粒子而實(shí)現(xiàn)信號(hào)精度的提高。在這種情況下，可以在規(guī)定時(shí)間內(nèi)執(zhí)行光檢測區(qū)域的絕對(duì)位置的移動(dòng)之后，間歇地移動(dòng)樣本溶液的位置，在樣本溶液內(nèi)的其它場所執(zhí)行同一單個(gè)粒子的反復(fù)檢測而實(shí)現(xiàn)被檢測的單個(gè)粒子的個(gè)數(shù)的增大。此外，雖然沒有圖示，但也可以通過使物鏡8或臺(tái)上下移動(dòng)來使光檢測區(qū)域的位置在上下方向上移動(dòng)，從而將光檢測區(qū)域的位置的軌跡在樣本溶液內(nèi)三維地展開。
[0070]在作為觀測對(duì)象粒子的發(fā)光粒子以及生成背景光的發(fā)光物質(zhì)通過多光子吸收而發(fā)光的情況下，上述光學(xué)系統(tǒng)被用作多光子顯微鏡。在這種情況下，只在激勵(lì)光的焦點(diǎn)區(qū)域(光檢測區(qū)域)釋放光，因此可以去除針孔13。另外，在生成背景光的發(fā)光物質(zhì)不通過激勵(lì)光而通過化學(xué)發(fā)光、生物發(fā)光現(xiàn)象發(fā)光的情況下，可以省略用于生成激勵(lì)光的光學(xué)系統(tǒng)2?5。在生成背景光的發(fā)光物質(zhì)通過磷光或散射而發(fā)光的情況下，能夠直接使用上述的共焦顯微鏡的光學(xué)系統(tǒng)。并且，也可以通過照明光來提供背景光。在這種情況下，從物鏡的上方，通過透射照明(可以是庫勒照明(Kohler illuminat1n)。)來對(duì)樣本溶液進(jìn)行照明。
[0071]并且，在光分析裝置I中，如圖示那樣，可以設(shè)置多個(gè)激勵(lì)光源2，可以根據(jù)發(fā)光粒子或提供背景光的物質(zhì)的激勵(lì)波長來適當(dāng)?shù)剡x擇激勵(lì)光的波長。另外，也可以構(gòu)成為具備多個(gè)光檢測器16，各個(gè)光檢測器16分別檢測來自光檢測區(qū)域的光中的互不相同的成分。在這種情況下，在通過針孔13后的檢測光光路中設(shè)置用于以任意方式分割光路的機(jī)構(gòu)。例如，在檢測光光路的部位14a處，通過在檢測光光路上插入對(duì)特定波長頻帶的光進(jìn)行反射并使其它的波長頻帶透過的分色鏡14a，能夠分別檢測波長頻帶互不相同的光成分。
[0072]計(jì)算機(jī)18具備CPU以及存儲(chǔ)器，通過CPU執(zhí)行各種運(yùn)算處理來執(zhí)行本發(fā)明的過程。此外，各過程也可以通過硬件構(gòu)成。在本實(shí)施方式中說明的處理的全部或一部分可以由計(jì)算機(jī)18使用存儲(chǔ)有實(shí)現(xiàn)這些處理的程序的計(jì)算機(jī)能夠讀取的存儲(chǔ)介質(zhì)來執(zhí)行。即，計(jì)算機(jī)18可以通過讀出存儲(chǔ)在存儲(chǔ)介質(zhì)中的程序執(zhí)行信息的加工、運(yùn)算處理來實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的處理過程。在此，計(jì)算機(jī)能夠讀取的記錄介質(zhì)可以是磁盤、磁光盤、⑶_R0M、DVD-R0M、半導(dǎo)體存儲(chǔ)器等，或者也可以將上述程序通過通信線路傳輸?shù)接?jì)算機(jī)，由接受該傳輸?shù)挠?jì)算機(jī)來執(zhí)行程序。
[0073]本發(fā)明的單個(gè)粒子檢測技術(shù)的原理
[0074]如“
【發(fā)明內(nèi)容】
” 一欄所記載的那樣，如果清楚地進(jìn)行描述，則在本發(fā)明的單個(gè)粒子檢測技術(shù)中，在樣本溶液中包含有發(fā)光粒子和非發(fā)光粒子的情況下，在背景光存在下依照掃描分子計(jì)數(shù)法測量光檢測區(qū)域的光來獲得時(shí)序光強(qiáng)度數(shù)據(jù)，在所述的時(shí)序光強(qiáng)度數(shù)據(jù)上將光強(qiáng)度的有意義的增大檢測為發(fā)光粒子的信號(hào)，將光強(qiáng)度的有意義的下降檢測為非發(fā)光粒子的信號(hào)。根據(jù)所述結(jié)構(gòu)，在一個(gè)檢測光波長頻帶下的一次光測量中，能夠進(jìn)行作為觀測對(duì)象粒子的兩種互不相同的粒子的檢測、對(duì)這些粒子的計(jì)數(shù)、或者與樣本溶液中的濃度有關(guān)的信息的獲取等。下面，說明本發(fā)明的掃描分子計(jì)數(shù)法的原理。
[0075]在“掃描分子計(jì)數(shù)法”(專利文獻(xiàn)9?11)中，基本上是驅(qū)動(dòng)用于移動(dòng)光檢測區(qū)域的位置的機(jī)構(gòu)(反射鏡偏轉(zhuǎn)器17)來變更光路或者移動(dòng)注入了樣本溶液的容器10(微板9)的水平方向的位置，如圖2的(A)示意性地描繪的那樣，一邊使光檢測區(qū)域CV的位置在樣本溶液內(nèi)移動(dòng)、即一邊通過光檢測區(qū)域CV掃描樣本溶液內(nèi)，一邊執(zhí)行光檢測。此時(shí),特別地，在本發(fā)明的情況下，使光檢測區(qū)域釋放背景光(或者，用照明光對(duì)光檢測區(qū)域進(jìn)行照明)，由此，在光檢測區(qū)域CV的移動(dòng)過程中(圖中為時(shí)間t0?t3)，大致一致地檢測到背景光。而且，在光檢測區(qū)域CV通過存在一個(gè)發(fā)光粒子的區(qū)域時(shí)(tl)，除了背景光以外，還從發(fā)光粒子釋放出光，因此如圖2的(B)所描繪的那樣在按時(shí)間序列的光強(qiáng)度數(shù)據(jù)上出現(xiàn)吊鐘型的脈沖狀的有意義的光強(qiáng)度的增大。另外，在光檢測區(qū)域CV通過存在一個(gè)非發(fā)光粒子的區(qū)域時(shí)(t2)，來自光檢測區(qū)域CV的光量減少，因此如圖2的(B)所描繪的那樣在按時(shí)間序列的光強(qiáng)度數(shù)據(jù)上出現(xiàn)吊鐘型的脈沖狀的有意義的光強(qiáng)度的下降。因此，執(zhí)行上述的光檢測區(qū)域CV的位置的移動(dòng)和光檢測，逐一檢測在該期間出現(xiàn)的如圖2的(B)所例示的那樣的脈沖狀的信號(hào)(有意義的光強(qiáng)度的增大和下降)，由此一邊逐個(gè)地且分別識(shí)別發(fā)光粒子和非發(fā)光粒子一邊進(jìn)行檢測，通過對(duì)發(fā)光粒子和非發(fā)光粒子各自的個(gè)數(shù)進(jìn)行計(jì)數(shù)，能夠獲取存在于所測量的區(qū)域內(nèi)的發(fā)光粒子的個(gè)數(shù)或者與濃度或數(shù)密度有關(guān)的信息以及非發(fā)光粒子的個(gè)數(shù)或者與濃度或數(shù)密度有關(guān)的信息。
[0076]如上所述，為了達(dá)成背景光存在下的發(fā)光粒子的信號(hào)和非發(fā)光粒子的信號(hào)的檢測，需要適當(dāng)?shù)卣{(diào)整發(fā)光粒子的發(fā)光強(qiáng)度與背景光強(qiáng)度之間的關(guān)系以及非發(fā)光粒子的發(fā)光強(qiáng)度與背景光強(qiáng)度之間的關(guān)系。關(guān)于發(fā)光粒子的發(fā)光強(qiáng)度與背景光強(qiáng)度之間的關(guān)系，如果清楚地進(jìn)行描述，則只要光檢測區(qū)域中存在發(fā)光粒子時(shí)、即發(fā)光粒子占有光檢測區(qū)域內(nèi)的一部分空間時(shí)的整個(gè)光檢測區(qū)域內(nèi)的檢測光波長頻帶下的光強(qiáng)度大于光檢測區(qū)域中不存在發(fā)光粒子時(shí)的整個(gè)光檢測區(qū)域內(nèi)的檢測光波長頻帶下的光強(qiáng)度即可，因此在檢測光波長頻帶，使每單位體積的發(fā)光粒子的發(fā)光量大于每單位體積的背景光的光量。然而，實(shí)際上，背景光強(qiáng)度并不完全固定，因此調(diào)整發(fā)光粒子的發(fā)光強(qiáng)度和/或背景光強(qiáng)度以使每單位體積的發(fā)光粒子的發(fā)光量充分大于每單位體積的背景光的光量。(具體地說，可以通過實(shí)驗(yàn)調(diào)整兩者的光強(qiáng)度。)
[0077]另一方面，關(guān)于非發(fā)光粒子的發(fā)光強(qiáng)度與背景光強(qiáng)度之間的關(guān)系，只要光檢測區(qū)域中存在非發(fā)光粒子時(shí)、即非發(fā)光粒子占有光檢測區(qū)域內(nèi)的一部分空間時(shí)的整個(gè)光檢測區(qū)域內(nèi)的檢測光波長頻帶下的光強(qiáng)度小于光檢測區(qū)域中不存在非發(fā)光粒子時(shí)的整個(gè)光檢測區(qū)域內(nèi)的檢測光波長頻帶下的光強(qiáng)度即可。因而，調(diào)整非發(fā)光粒子的發(fā)光強(qiáng)度和背景光強(qiáng)度使得檢測光波長頻帶下的非發(fā)光粒子的每單位體積的發(fā)光量小于每單位體積的背景光的光量。(即，應(yīng)該理解為，非發(fā)光粒子只要在檢測光波長頻帶下的發(fā)光強(qiáng)度低于背景光的發(fā)光強(qiáng)度即可，也可以不是完全不發(fā)光的粒子。)
[0078]此外，關(guān)于非發(fā)光粒子，能夠根據(jù)非發(fā)光粒子的直徑與光檢測區(qū)域的直徑之間的關(guān)系來估計(jì)光強(qiáng)度下降的程度。典型地是，光檢測區(qū)域內(nèi)的光強(qiáng)度分布具有在中心具有最大強(qiáng)度Imax并向半徑r方向強(qiáng)度降低的吊鐘型的輪廓f(r)(參照?qǐng)D5的(C))。因而，使用使f (r)大致為O的光檢測區(qū)域的半徑a，通過下式給出在光檢測區(qū)域內(nèi)不存在非發(fā)光粒子時(shí)從光檢測區(qū)域內(nèi)釋放出的光的總量α。
[0079]α = 4 π / r2f (r) dr [積分區(qū)間為 O ?a]
[0080]另一方面，在半徑b的非發(fā)光粒子進(jìn)入光檢測區(qū)域內(nèi)并位于光檢測區(qū)域的中心時(shí)，由于提供該區(qū)域的背景光的空間(以下稱為“發(fā)光空間”。)被排除，因此降低與被排除的發(fā)光空間相當(dāng)?shù)墓饬?。與該被排除的發(fā)光空間相當(dāng)?shù)墓饬俊⒓聪陆盗喀峦ㄟ^下式給出。
[0081]β = 4 π / r2f(r) dr [積分區(qū)間為 O ?b]
[0082]這樣，能夠通過β/α估計(jì)光強(qiáng)度的下降比例。在此，f(r)為高斯函數(shù)，在α =
1、a = I時(shí)，成為
[0083]f (r) = 0.684exp (~2r2)。
[0084]典型地是，背景光的變動(dòng)率為1%左右，當(dāng)非發(fā)光粒子所引起的光強(qiáng)度的下降比例為I %以下時(shí)，不能檢測信號(hào)，因此當(dāng)通過上述式子進(jìn)行運(yùn)算時(shí)，非發(fā)光粒子半徑相對(duì)于光檢測區(qū)域的半徑之比b/a應(yīng)該設(shè)為0.15以上。另外，在將非發(fā)光粒子所引起的光強(qiáng)度的下降比例設(shè)為10%以上的情況下，能夠檢測的非發(fā)光粒子半徑相對(duì)于光檢測區(qū)域的半徑之比b/a為0.35。此外，在要觀測的非發(fā)光粒子是消光劑、熒光能量轉(zhuǎn)移的受體的情況下，非發(fā)光粒子吸收周圍(例如1nm)的光，因此能夠檢測的非發(fā)光粒子半徑與上述例示的半徑相比能夠減小。另外，在非發(fā)光粒子發(fā)光的情況下，能夠檢測的非發(fā)光粒子半徑與上述例示的半徑相比能夠增大。
[0085]這樣，在如上所述的本發(fā)明的單個(gè)粒子檢測技術(shù)中，不進(jìn)行如熒光強(qiáng)度的波動(dòng)的計(jì)算那樣的統(tǒng)計(jì)性的運(yùn)算處理而是逐一檢測粒子，因此即使在要觀測的粒子的濃度低至通過以往的FCS、FIDA等無法以足夠的精度進(jìn)行分析的程度的樣本溶液中，也能夠獲取與粒子的濃度或數(shù)密度有關(guān)的信息。另外，特別地，根據(jù)存在有意義的背景光，具有降低雜散光、拉曼散射光的影響這樣的優(yōu)點(diǎn)。并且，重要的是，在本發(fā)明的單個(gè)粒子檢測技術(shù)中，在一個(gè)檢測光波長頻帶的光強(qiáng)度數(shù)據(jù)(Ich的光強(qiáng)度數(shù)據(jù))上能夠識(shí)別發(fā)光粒子的信號(hào)和非發(fā)光粒子的信號(hào)，因此達(dá)成同時(shí)檢測兩種互不相同的粒子且識(shí)別出其種類的方式。所述優(yōu)點(diǎn)在分子的相互作用等的分析中是非常有利的。
[0086]掃描分子計(jì)數(shù)法的處理操作過稈
[0087]在依照使用了圖1的(A)所例示的單個(gè)粒子檢測裝置I的本發(fā)明的掃描分子計(jì)數(shù)法的實(shí)施方式中，具體地說，執(zhí)行以下的處理:(1)包含單個(gè)粒子和生成背景光的發(fā)光物質(zhì)的樣本溶液的調(diào)制，(2)樣本溶液的光強(qiáng)度的測量處理，(3)測量出的光強(qiáng)度的分析處理。圖3以流程圖的形式示出一個(gè)實(shí)施方式中的處理。
[0088](I)樣本溶液的調(diào)制
[0089]作為本發(fā)明的光分析技術(shù)的觀測對(duì)象物的粒子，如果是溶解的分子等在樣本溶液中分散并在溶液中隨機(jī)運(yùn)動(dòng)的粒子，則可以是任意的粒子，例如可以是蛋白質(zhì)、肽、核酸、月旨質(zhì)、糖鏈、氨基酸或它們的聚合體等生物體分子、病毒、細(xì)胞、或金屬膠體、其它非生物學(xué)分子等。關(guān)于發(fā)光粒子，在觀測對(duì)象粒子原本不是發(fā)光粒子的情況下，使用以任意的方式對(duì)作為觀測對(duì)象物的粒子附加了發(fā)光標(biāo)識(shí)(熒光分子、磷光分子、化學(xué)、生物發(fā)光分子)的粒子。關(guān)于非發(fā)光粒子，與發(fā)光粒子的情況同樣地可以是任意的粒子。另外，背景光可以是熒光、自體熒光、散射(拉曼散射(溶劑(水)二硫化碳、異戊二烯、過渡金屬絡(luò)合物)、發(fā)光物質(zhì)所產(chǎn)生的光，或者也可以是均勻光源產(chǎn)生的照明光。在通過發(fā)光物質(zhì)的分散提供背景光的情況下，發(fā)光物質(zhì)可以是任意的發(fā)光分子，例如突光分子、磷光分子、化學(xué)、生物發(fā)光分子，以在光檢測區(qū)域內(nèi)始終存在幾個(gè)分子以上的濃度溶解或分散在樣本溶液中。此外，背景光的光量如上述那樣被適當(dāng)調(diào)整為在每單位體積中少于作為觀測對(duì)象的發(fā)光粒子的光量且多于作為觀測對(duì)象的非發(fā)光粒子的光量。樣本溶液典型地是水溶液，但是不限定于此，可以是有機(jī)溶劑及其它任意的液體。
[0090](2)樣本溶液的光強(qiáng)度的測量(圖3-步驟100)
[0091]本實(shí)施方式的利用掃描分子計(jì)數(shù)法的光分析中的光強(qiáng)度的測量除了在測量過程中驅(qū)動(dòng)反射鏡偏轉(zhuǎn)器17或臺(tái)位置變更裝置17a來進(jìn)行光檢測區(qū)域的位置在樣本溶液內(nèi)的移動(dòng)(樣本溶液內(nèi)的掃描)以外，可以通過與FCS或FIDA中的光強(qiáng)度的測量過程相同的方式執(zhí)行。在操作處理中，典型地是，在向微板9的皿10注入樣本溶液并載置在顯微鏡的臺(tái)上后，在使用者向計(jì)算機(jī)18輸入開始測量的指示時(shí)，計(jì)算機(jī)18依照存儲(chǔ)在存儲(chǔ)裝置(未圖示)中的程序(使光檢測區(qū)域的位置在樣本溶液內(nèi)移動(dòng)的過程和在光檢測區(qū)域的位置的移動(dòng)過程中檢測來自光檢測區(qū)域的光并生成按時(shí)間序列的光強(qiáng)度數(shù)據(jù)的過程)，開始樣本溶液內(nèi)的光檢測區(qū)域中的激勵(lì)光的照射以及光強(qiáng)度的測量。在所述測量中，在依照計(jì)算機(jī)18的程序的處理動(dòng)作的控制下，反射鏡偏轉(zhuǎn)器17或臺(tái)位置變更裝置17a驅(qū)動(dòng)反射鏡7 (檢電鏡)或顯微鏡的臺(tái)上的微板9，來執(zhí)行皿10內(nèi)的光檢測區(qū)域的位置的移動(dòng)，與此同時(shí)地，光檢測器16將逐次檢測出的光變換為電信號(hào)并發(fā)送到計(jì)算機(jī)18，在計(jì)算機(jī)18中，通過任意的方式，根據(jù)所發(fā)送的信號(hào)生成按時(shí)間序列的光強(qiáng)度數(shù)據(jù)并保存。光檢測器16典型地是能夠檢測有無單光子的到來的超高靈敏度光檢測器，因此在光的檢測是利用光子計(jì)數(shù)來進(jìn)行的情況下，時(shí)序光強(qiáng)度數(shù)據(jù)可以是按時(shí)間序列的光子計(jì)數(shù)數(shù)據(jù)。
[0092]光強(qiáng)度的測量過程中的光檢測區(qū)域的位置的移動(dòng)速度是任意地、例如是通過實(shí)驗(yàn)或?yàn)榱朔戏治瞿康亩O(shè)定的規(guī)定的速度。在根據(jù)所檢測出的單個(gè)粒子的個(gè)數(shù)獲取與其數(shù)密度或濃度有關(guān)的信息的情況下，需要光檢測區(qū)域所通過的區(qū)域的大小或體積，因此以能夠掌握移動(dòng)距離的方式執(zhí)行光檢測區(qū)域的位置的移動(dòng)。此外，測量過程中的經(jīng)過時(shí)間和光檢測區(qū)域的位置的移動(dòng)距離具有比例關(guān)系更容易解釋測量結(jié)果，因此優(yōu)選移動(dòng)速度基本上是固定速度，但是不限定于此。
[0093]另外，關(guān)于光檢測區(qū)域的位置的移動(dòng)速度，為了定量地高精度地執(zhí)行基于測量出的按時(shí)間序列的光強(qiáng)度數(shù)據(jù)的單個(gè)粒子的逐個(gè)檢測、或者單個(gè)粒子的個(gè)數(shù)的計(jì)數(shù)，優(yōu)選將所述移動(dòng)速度設(shè)定為比單個(gè)粒子的隨機(jī)運(yùn)動(dòng)、即布朗運(yùn)動(dòng)所引起的移動(dòng)速度快的值。本發(fā)明的單個(gè)粒子檢測技術(shù)的觀測對(duì)象粒子是在溶液中分散或溶解并自由且隨機(jī)運(yùn)動(dòng)的粒子，因此由于布朗運(yùn)動(dòng)，位置隨著時(shí)間而移動(dòng)。因而，在光檢測區(qū)域的位置的移動(dòng)速度比粒子的布朗運(yùn)動(dòng)所引起的移動(dòng)慢的情況下，如圖4的(A)示意性地描繪的那樣，粒子在區(qū)域內(nèi)隨機(jī)地移動(dòng)，由此光強(qiáng)度隨機(jī)地變化(如已經(jīng)提及的那樣，光檢測區(qū)域的激勵(lì)光強(qiáng)度以區(qū)域的中心為頂點(diǎn)向外方降低。)，難以確定與各個(gè)單個(gè)粒子對(duì)應(yīng)的有意義的光強(qiáng)度的變化。因此，優(yōu)選的是將光檢測區(qū)域的位置的移動(dòng)速度設(shè)定得比粒子的因布朗運(yùn)動(dòng)引起的平均移動(dòng)速度(擴(kuò)散移動(dòng)速度)快，使得如圖4的(B)所描繪的那樣粒子大致直線地橫穿光檢測區(qū)域，由此在按時(shí)間序列的光強(qiáng)度數(shù)據(jù)中，如圖4的(C)最上部所例示的那樣，與各個(gè)單個(gè)粒子對(duì)應(yīng)的光強(qiáng)度的變化的輪廓大致一致(在單個(gè)粒子大致直線地通過光檢測區(qū)域的情況下，光強(qiáng)度的變化的輪廓與將激勵(lì)光強(qiáng)度分布反轉(zhuǎn)得到的輪廓大致相同。)，從而能夠容易地確定各個(gè)粒子與光強(qiáng)度之間的對(duì)應(yīng)。
[0094]具體地說，具有擴(kuò)散系數(shù)D的粒子由于布朗運(yùn)動(dòng)而通過半徑Wo的光檢測區(qū)域(共焦區(qū)組織)時(shí)所需要的時(shí)間At根據(jù)以下的平均平方位移的關(guān)系式，
[0095](2ffo)2 = 6D.At
[0096]成為
[0097]At = (2ffo)2/6D,
[0098]因此，粒子因布朗運(yùn)動(dòng)而移動(dòng)的速度(擴(kuò)散移動(dòng)速度)Vdif大致為
[0099]Vdif = 2ffo/ At = 3D/Wo。
[0100]因此，光檢測區(qū)域的位置的移動(dòng)速度可以參照所述Vdif設(shè)定為與其相比充分快的值。例如在預(yù)想觀測對(duì)象粒子的擴(kuò)散系數(shù)是D = 2.0XlO^V/s左右的情況下，在設(shè)Wo為0.62 μ m左右時(shí)，Vdif為1.0X 10_3m/s，因此，可以將光檢測區(qū)域的位置的移動(dòng)速度設(shè)定為其10倍以上的15mm/s等。此外，在觀測對(duì)象粒子的擴(kuò)散系數(shù)未知的情況下，可以設(shè)定各種光檢測區(qū)域的位置的移動(dòng)速度，反復(fù)執(zhí)行用于找到使光強(qiáng)度的變化的輪廓為預(yù)想的輪廓(典型地是與激勵(lì)光強(qiáng)度分布大致相同)的條件的預(yù)備實(shí)驗(yàn)，來決定適合的光檢測區(qū)域的位置的移動(dòng)速度。
[0101](3)光強(qiáng)度的分析
[0102]當(dāng)通過上述處理得到時(shí)序光強(qiáng)度數(shù)據(jù)時(shí)，在計(jì)算機(jī)18中，通過依照存儲(chǔ)在存儲(chǔ)裝置中的程序的處理，執(zhí)行單個(gè)粒子的信號(hào)的檢測、單個(gè)粒子的計(jì)數(shù)、濃度計(jì)算等各種分析。
[0103](i)時(shí)序光強(qiáng)度數(shù)據(jù)的平滑化以及利用吊鐘型函數(shù)擬合的單個(gè)粒子信號(hào)的逐個(gè)檢測
[0104]在按時(shí)間序列的光強(qiáng)度數(shù)據(jù)中，在一個(gè)粒子通過光檢測區(qū)域時(shí)的軌跡如圖4的(B)所示那樣是大致直線狀的情況下，與該粒子對(duì)應(yīng)的信號(hào)中的光強(qiáng)度的變化具有反映(由光學(xué)系統(tǒng)決定的)光檢測區(qū)域內(nèi)的光強(qiáng)度分布的大致吊鐘狀的輪廓。參照?qǐng)D4的(C)最上部，特別地，在非發(fā)光粒子(α)通過光檢測區(qū)域的情況下，光強(qiáng)度的變化為向下凸，在發(fā)光粒子(β)通過光檢測區(qū)域的情況下，光強(qiáng)度的變化為向上凸。這樣，在單個(gè)粒子信號(hào)的逐個(gè)檢測的一個(gè)方式中，基本上，在從背景光起進(jìn)行計(jì)量的、低于適當(dāng)設(shè)定的閾值的光強(qiáng)度的下降所持續(xù)的時(shí)間寬度處于規(guī)定的范圍時(shí)，而且在從背景光起進(jìn)行計(jì)量的，超過適當(dāng)設(shè)定的閾值的光強(qiáng)度的增大所持續(xù)的時(shí)間寬度處于規(guī)定的范圍時(shí)，判斷為各個(gè)具有光強(qiáng)度的下降或增大的輪廓的信號(hào)對(duì)應(yīng)于一個(gè)粒子通過光檢測區(qū)域，可以進(jìn)行一個(gè)粒子的檢測。另外，在能夠?qū)⒐鈾z測區(qū)域的光強(qiáng)度分布假定為從背景光Ibg向下凸的或向上凸的高斯分布，即
[0105]I = Ibg-A-.exp(_2t2/a2)...(α )
[0106]I = Ibg+A+.exp(_2t2/a2)…(β)時(shí)，
[0107]在使式α或式β擬合有意義的光強(qiáng)度的下降或增大的輪廓(能夠明確地判斷為不是背景光的波動(dòng)的輪廓)而計(jì)算出的強(qiáng)度A-、A+以及寬度a處于規(guī)定的范圍內(nèi)時(shí)，判斷為該光強(qiáng)度的輪廓對(duì)應(yīng)于一個(gè)粒子通過光檢測區(qū)域，可以進(jìn)行一個(gè)粒子的檢測。(強(qiáng)度A-、A+以及寬度a處于規(guī)定的范圍外的信號(hào)被判斷為噪聲或異物的信號(hào)，在其后的分析等中可以忽略。)
[0108]作為從時(shí)序光強(qiáng)度數(shù)據(jù)中一并檢測單個(gè)粒子的處理方法的一個(gè)例子，首先，對(duì)時(shí)序光強(qiáng)度數(shù)據(jù)(圖4的(C)、最上部“檢測結(jié)果(未處理)”)進(jìn)行平滑(平滑化)處理(圖3-步驟110、圖4的(C)的中上部“平滑”)。作為觀測對(duì)象粒子的發(fā)光粒子及提供背景光的物質(zhì)等所發(fā)出的光是概率性地釋放的，并且，其光強(qiáng)度比較微弱，因此在產(chǎn)生細(xì)小的增加和減少時(shí)，所述光強(qiáng)度的細(xì)小的增加和減小(波動(dòng))使表示單個(gè)粒子的存在的信號(hào)的檢測精度變差。通過平滑處理能夠忽略所述數(shù)據(jù)上的細(xì)小的增加和減小。例如可以通過移動(dòng)平均法(例如鄰近平均法、Savinsky-golay法的算法)、百分比濾波器法、FFT濾波器法進(jìn)行平滑處理。可以根據(jù)獲取光強(qiáng)度數(shù)據(jù)時(shí)的光檢測區(qū)域的位置的移動(dòng)速度(掃描速度)、BIN--ΜΕ，適當(dāng)?shù)卦O(shè)定執(zhí)行平滑處理時(shí)的參數(shù)、例如在移動(dòng)平均法中進(jìn)行一次平均的數(shù)據(jù)個(gè)數(shù)、移動(dòng)平均的次數(shù)等。例如，可以通過移動(dòng)平均法等來進(jìn)行。
[0109]接著，在平滑處理后的時(shí)序光強(qiáng)度數(shù)據(jù)中，為了檢測有意義的脈沖狀的信號(hào)(以下稱為“脈沖信號(hào)”)所存在的時(shí)間區(qū)域(脈沖存在區(qū)域)，對(duì)平滑處理后的光時(shí)序強(qiáng)度數(shù)據(jù)的時(shí)間運(yùn)算一次微分值(步驟120)。時(shí)序光強(qiáng)度數(shù)據(jù)的時(shí)間微分值如圖4的(C)的中下部“時(shí)間微分”所例示的那樣，在信號(hào)值的變化時(shí)刻值的變化變大，因此通過參照所述時(shí)間微分值，能夠有利于確定有意義的信號(hào)的起點(diǎn)和終點(diǎn)。
[0110]然后，在時(shí)序光強(qiáng)度數(shù)據(jù)上，逐次檢測有意義的脈沖信號(hào)，判斷檢測出的信號(hào)是否為與單個(gè)粒子對(duì)應(yīng)的信號(hào)。具體地說，首先在時(shí)序光強(qiáng)度數(shù)據(jù)的按時(shí)間序列的時(shí)間微分值數(shù)據(jù)上，參照時(shí)間微分值逐次搜索并確定一個(gè)脈沖信號(hào)的起點(diǎn)和終點(diǎn)，確定脈沖存在區(qū)域(步驟130)。當(dāng)確定了一個(gè)脈沖存在區(qū)域時(shí)，針對(duì)該脈沖存在區(qū)域中的平滑后的時(shí)序光強(qiáng)度數(shù)據(jù)，在向上凸的光強(qiáng)度變化的區(qū)域進(jìn)行向上凸的吊鐘型函數(shù)的擬合，在向下凸的光強(qiáng)度變化的區(qū)域進(jìn)行向下凸的吊鐘型函數(shù)的擬合(圖4的(C)的下部的“吊鐘型函數(shù)擬合”)，計(jì)算吊鐘型函數(shù)的脈沖的峰值的強(qiáng)度(相對(duì)于背景光的最大下降量)Ipeak、脈沖寬度(半峰全寬)Wpeak、擬合時(shí)的(最小二乘法的)相關(guān)系數(shù)等參數(shù)(步驟140)。此外，擬合的吊鐘型函數(shù)典型地是高斯函數(shù)，但也可以是洛侖茲型函數(shù)。另外，在脈沖存在區(qū)域中的光強(qiáng)度變化的朝向以基于時(shí)間微分值的起點(diǎn)和終點(diǎn)處的增加和減少的順序進(jìn)行識(shí)別。然后，判斷計(jì)算出的吊鐘型函數(shù)的參數(shù)是否處于針對(duì)一個(gè)單個(gè)粒子通過光檢測區(qū)域時(shí)檢測出的脈沖信號(hào)所描繪的吊鐘型的輪廓的參數(shù)而設(shè)想的范圍內(nèi)，即判斷脈沖的峰值強(qiáng)度(式α的A-或式β的Α+、背景光的下降量或增大量的最大值)、脈沖寬度、相關(guān)系數(shù)是否分別處于規(guī)定范圍內(nèi)，例如判斷是否滿足下述的條件等(步驟150)，即
[0111]20 μ s〈脈沖寬度〈400 μ s
[0112]峰值強(qiáng)度>4.0 [pc/10 μ s]…(A)
[0113]相關(guān)系數(shù)>0.95。
[0114]這樣，將被判斷為計(jì)算出的吊鐘型函數(shù)的參數(shù)處于針對(duì)與一個(gè)粒子對(duì)應(yīng)的信號(hào)設(shè)想的范圍內(nèi)的信號(hào)判斷為是與一個(gè)粒子對(duì)應(yīng)的信號(hào)。另一方面，計(jì)算出的吊鐘型函數(shù)的參數(shù)不在設(shè)想的范圍內(nèi)的脈沖信號(hào)作為噪聲而被忽略。
[0115]可以在時(shí)序光強(qiáng)度數(shù)據(jù)的整個(gè)區(qū)域中反復(fù)執(zhí)行上述步驟130?150的處理中的脈沖信號(hào)的搜索和判斷(步驟160)。特別地，在本實(shí)施方式中，在進(jìn)行脈沖信號(hào)的搜索和判斷時(shí)，可以逐次識(shí)別信號(hào)是向上凸還是向下凸，來分別分開地對(duì)脈沖信號(hào)的個(gè)數(shù)進(jìn)行計(jì)數(shù)。
[0116](ii)基于時(shí)序光強(qiáng)度數(shù)據(jù)中的光強(qiáng)度變化的產(chǎn)生概率的單個(gè)粒子信號(hào)的逐個(gè)檢測
[0117]作為單個(gè)粒子信號(hào)的逐個(gè)檢測的其它方式，也可以計(jì)算在時(shí)序光強(qiáng)度數(shù)據(jù)上出現(xiàn)的光強(qiáng)度變化(光子數(shù)變化)的圖案的產(chǎn)生概率，根據(jù)所述產(chǎn)生概率檢測單個(gè)粒子的信號(hào)的存在(參照日本特愿2012-32421)。參照?qǐng)D5的(A)，一般地，在時(shí)序光強(qiáng)度數(shù)據(jù)是光子計(jì)數(shù)數(shù)據(jù)的情況下，光強(qiáng)度值為每BIN TIME的檢測光子數(shù)。因而，如圖示那樣，光強(qiáng)度值在時(shí)間軸方向上離散地分布。在這種情況下，亮度大的粒子信號(hào)受噪聲信號(hào)的影響少，具有大致吊鐘狀的輪廓(左圖)，但是亮度小的粒子信號(hào)的強(qiáng)度值與噪聲信號(hào)大致相同，進(jìn)一步由于噪聲信號(hào)疊加(中圖)而難以抽出大致吊鐘狀的輪廓，難以與沒有粒子的僅存在噪聲信號(hào)的時(shí)間區(qū)域(右圖)進(jìn)行區(qū)分。然而，在存在亮度小的粒子信號(hào)的時(shí)間區(qū)域和僅存在噪聲信號(hào)的時(shí)間區(qū)域中，檢測出光子的事件(光子數(shù)為I以上的事件)的產(chǎn)生頻率和圖案存在差異。在非發(fā)光粒子的信號(hào)與背景光的波動(dòng)之間也觀察到同樣的現(xiàn)象。因此，對(duì)于時(shí)序光強(qiáng)度數(shù)據(jù)上的每個(gè)規(guī)定的時(shí)間寬度的光強(qiáng)度值的時(shí)間變化(光子數(shù)列)，計(jì)算在假定為在光檢測區(qū)域內(nèi)存在粒子的情況下產(chǎn)生上述光強(qiáng)度值的時(shí)間變化的概率(產(chǎn)生概率(存在粒子時(shí)))以及在假定為在光檢測區(qū)域內(nèi)不存在粒子的情況下產(chǎn)生上述光強(qiáng)度值的時(shí)間變化的概率(產(chǎn)生概率(不存在粒子時(shí)))，將提供高的產(chǎn)生概率的狀態(tài)估計(jì)為是實(shí)際的狀態(tài)。
[0118]更具體地說，首先，參照?qǐng)D5的(B)，在時(shí)序光強(qiáng)度數(shù)據(jù)上設(shè)定任意的時(shí)間寬度的區(qū)間(以下稱為解析窗。)。該解析窗具有按每個(gè)單位時(shí)間(通常可以是BIN TIME。)ti(i=1，2，…以下相同)檢測出的光子數(shù)Ci。另外，考慮在各單位時(shí)間內(nèi)產(chǎn)生的光子檢測事件的數(shù)量依照具有該單位時(shí)間內(nèi)的預(yù)期值的泊松分布，因此通過下式給出在任意的單位時(shí)間ti中成為檢測光子數(shù)Ci的概率(單位時(shí)間產(chǎn)生概率)。
[0119][數(shù)I]

Fiu
[0120]Pi = -~cxp(-Ei)…(I)

Ci!
[0121]在此，Ei是單位時(shí)間ti內(nèi)的光子數(shù)的預(yù)期值。而且，在解析窗中包含n+1個(gè)單位時(shí)間時(shí)，通過下式給出解析窗內(nèi)產(chǎn)生檢測光子數(shù)列Ci的概率P (產(chǎn)生概率)。
[0122][數(shù)2]
[0123]P = ]~f Pi.■'」1

l-u
[0124]上述的各單位時(shí)間ti內(nèi)的光子檢測事件的產(chǎn)生數(shù)的預(yù)期值Ei根據(jù)在光測量中的與解析窗對(duì)應(yīng)的時(shí)間區(qū)域有無光檢測區(qū)域內(nèi)的粒子來確定。這樣，在光檢測區(qū)域內(nèi)不存在粒子的情況下，光子檢測事件總是隨機(jī)地產(chǎn)生，因此各測量單位時(shí)間ti內(nèi)的預(yù)期值Eni可以設(shè)定為
[0125]Eni = Bg...(3)
[0126]在此，Bg是背景光的時(shí)間平均值。因而，將式(3)的值代入到式(I)，來按時(shí)間序列估算各測量單位時(shí)間ti內(nèi)的單位時(shí)間產(chǎn)生概率Pni，再通過式(2)計(jì)算在假定為在光檢測區(qū)域內(nèi)不存在粒子的狀態(tài)的情況下產(chǎn)生實(shí)際的檢測光子數(shù)列的概率Pn。
[0127]另一方面，在光檢測區(qū)域內(nèi)存在粒子的情況下，由于光檢測區(qū)域CV的位置正在移動(dòng)，因此粒子如圖4的(B)示意性地描繪的那樣通過光檢測區(qū)域CV內(nèi)。在所述的過程中，從光檢測區(qū)域中的粒子釋放并被檢測出的光的強(qiáng)度值或因在光檢測區(qū)域內(nèi)存在粒子而減少的背景光的減少量如圖5的(C)所示那樣，粒子的位置距光檢測區(qū)域的大致中心越遠(yuǎn)則越低。因而，在光檢測區(qū)域內(nèi)存在粒子時(shí)的各單位時(shí)間ti內(nèi)的預(yù)期值Epi也表現(xiàn)為以時(shí)間為變量的吊鐘狀的函數(shù)。在此，當(dāng)假設(shè)通過高斯函數(shù)對(duì)該吊鐘狀的函數(shù)進(jìn)行近似時(shí)，通過下式給出預(yù)期值Epi。
[0128][數(shù)3]
?.? ( (11 — Ic ) _/ Λ \
[0129]Epi = Q.exp--— +Bg…(4)
I 2 W-
[0130]在此，高斯函數(shù)被假定為在解析窗內(nèi)的任意的時(shí)間tc (例如解析窗的中心)處具有峰值強(qiáng)度Q。另外，式(4)的高斯函數(shù)的半峰全寬等于移動(dòng)速度為V的光檢測區(qū)域通過半峰全寬d的時(shí)間d/v，該半峰全寬d是如圖5的(C)所例示的那樣從光檢測區(qū)域中的粒子釋放并檢測出的光的強(qiáng)度值或因在光檢測區(qū)域內(nèi)存在粒子而減少的背景光的減少量的半徑r方向的分布的半峰全寬，根據(jù)該條件，通過下式給出W。
[0131][數(shù)4]
_2] W = ( °
[0133]此外，圖5的(C)的半峰全寬d能夠由光學(xué)系統(tǒng)決定。
[0134]在觀測對(duì)象粒子是發(fā)光粒子的情況下，當(dāng)假定為解析窗內(nèi)的光子數(shù)的總計(jì)與式
(4)的預(yù)期值的總計(jì)一致時(shí)，通過下式給出式(4)中的峰值強(qiáng)度Q。
[0135][數(shù)5]
「 ? t (O-Bg)
[0136]q 1-ο__…C a )
Q- { }
[0137]另外，在觀測對(duì)象粒子是非發(fā)光粒子的情況下，依照式(4)設(shè)定光子數(shù)的減少量的絕對(duì)值的預(yù)期值，通過下式給出峰值強(qiáng)度Q。
[0138][數(shù)6]

η
T(Bg-Ci)
[0139]q _ ι=υ__...( 7 I

WyflTl
[0140]這樣，將式(4)的值代入到式(I)，按時(shí)間序列估算各測量單位時(shí)間ti內(nèi)的單位時(shí)間產(chǎn)生概率Ppi，再通過式(2)計(jì)算假定在光檢測區(qū)域內(nèi)存在粒子的狀態(tài)的情況下產(chǎn)生實(shí)際的檢測光子數(shù)列的概率Pp。而且，在假定存在粒子的狀態(tài)的情況下的檢測光子數(shù)列的產(chǎn)生概率Pp超過假定不存在粒子的狀態(tài)的情況下的檢測光子數(shù)列的產(chǎn)生概率Pn規(guī)定的程度時(shí)，判斷為在該解析窗中存在粒子的信號(hào)。
[0141]此外，在實(shí)施方式中，關(guān)于在解析窗內(nèi)是否存在粒子的信號(hào)的判斷，可以計(jì)算產(chǎn)生概率Pp與產(chǎn)生概率Pn的比值比0R，
[0142]OR = Pp (1-Pn) / (1-Pp) Pn...(8)
[0143]在其大小超過規(guī)定值時(shí)，判斷為在解析窗內(nèi)存在粒子的信號(hào)。
[0144]在上述的粒子的信號(hào)的檢測處理過程中，解析窗優(yōu)選設(shè)定為單個(gè)粒子通過光檢測區(qū)域內(nèi)所需要的時(shí)間以上。如果設(shè)為半徑r的光檢測區(qū)域以速度V移動(dòng)，則將解析窗的時(shí)間寬度設(shè)定得比
[0145]2r/v...(9)
[0146]長。另外，優(yōu)選的是，可以在時(shí)序光強(qiáng)度數(shù)據(jù)上針對(duì)每個(gè)單位時(shí)間依次設(shè)定解析窗。根據(jù)所述設(shè)定，能夠沿著時(shí)序光強(qiáng)度數(shù)據(jù)計(jì)算產(chǎn)生概率Pp、產(chǎn)生概率Pn和/或比值比0R。然而，在這種情況下，運(yùn)算量變多，因此也可以針對(duì)每多個(gè)單位時(shí)間設(shè)定解析窗。并且，也可以在時(shí)序光強(qiáng)度數(shù)據(jù)上以解析窗的時(shí)間寬度進(jìn)行分割來設(shè)定解析窗。在這種情況下，解析窗不會(huì)被相互重復(fù)地設(shè)定。
[0147]在針對(duì)每個(gè)單位時(shí)間設(shè)定解析窗的情況下，在存在一個(gè)粒子信號(hào)時(shí)，在連續(xù)的解析窗中持續(xù)作出存在粒子的信號(hào)的判斷。即，一個(gè)粒子的信號(hào)對(duì)應(yīng)于持續(xù)作出存在粒子的信號(hào)的判斷的一個(gè)區(qū)間。因而，通過對(duì)持續(xù)作出存在粒子的信號(hào)的判斷的區(qū)間數(shù)進(jìn)行計(jì)數(shù)，能夠進(jìn)行粒子的信號(hào)的計(jì)數(shù)。另外，在上述的粒子的信號(hào)的檢測處理過程中，BIN --ΜΕ被設(shè)定為單個(gè)粒子通過光檢測區(qū)域內(nèi)所需要的時(shí)間(式9)以下。這是為了通過多個(gè)BIN TIME捕捉單個(gè)粒子通過時(shí)的信號(hào)而能夠檢測單個(gè)粒子通過期間的光強(qiáng)度值的時(shí)間變化的圖案。(如果BIN TIME比式9的時(shí)間長，則無法捕捉單個(gè)粒子通過期間的光強(qiáng)度值的時(shí)間變化的圖案。)
[0148]圖6是以流程圖的方式表示利用上述產(chǎn)生檢測光子數(shù)列的概率Pp、Pn檢測單個(gè)粒子信號(hào)的處理。參照該圖，首先，在生成時(shí)序光強(qiáng)度數(shù)據(jù)之后(步驟100)，在時(shí)序光強(qiáng)度數(shù)據(jù)上進(jìn)行背景光的強(qiáng)度值的計(jì)算(步驟310)。背景光的強(qiáng)度值可以是時(shí)序光強(qiáng)度數(shù)據(jù)上不存在粒子的信號(hào)的區(qū)域的強(qiáng)度值(光子數(shù))的平均值。這樣，在背景光的強(qiáng)度值計(jì)算的一個(gè)方法中，可以采用所獲得的時(shí)序光強(qiáng)度數(shù)據(jù)上的光強(qiáng)度值中的、從高值起去除規(guī)定比例(例如20% )的數(shù)據(jù)和從低值起去除規(guī)定比例(例如20% )的數(shù)據(jù)后的總強(qiáng)度值的平均值作為背景光的強(qiáng)度值。這是因?yàn)榭紤]為從光強(qiáng)度值的高值起的規(guī)定比例的數(shù)據(jù)是發(fā)光粒子的信號(hào)，從光強(qiáng)度值的低值起的規(guī)定比例的數(shù)據(jù)是非發(fā)光粒子的信號(hào)。此外，也可以采用利用不包含觀測對(duì)象的粒子的樣本溶液獲得的時(shí)序光強(qiáng)度數(shù)據(jù)上的光強(qiáng)度值的平均作為背景光的強(qiáng)度值。
[0149]接著，在本實(shí)施方式的處理過程中，在時(shí)序光強(qiáng)度數(shù)據(jù)上執(zhí)行解析窗的設(shè)定(步驟320)。如已經(jīng)提及的那樣，一個(gè)解析窗的長度可以根據(jù)光檢測區(qū)域的大小和移動(dòng)速度來決定(參照式(9))。另外，優(yōu)選的是，可以按時(shí)間序列針對(duì)每個(gè)BIN TIME設(shè)定解析窗。然而，為了減少運(yùn)算量，也可以針對(duì)每多個(gè)BIN --ΜΕ進(jìn)行設(shè)定，或者也可以以解析窗相互不重疊的方式進(jìn)行設(shè)定。
[0150]這樣，當(dāng)進(jìn)行了解析窗的設(shè)定時(shí)，依照上述說明過的原理，分別計(jì)算假定為在光檢測區(qū)域內(nèi)沒有粒子的情況下的解析窗內(nèi)的光強(qiáng)度值列或光子數(shù)列的產(chǎn)生概率Pn(步驟130)、假定為在光檢測區(qū)域內(nèi)存在粒子的情況下的解析窗內(nèi)的光強(qiáng)度值列或光子數(shù)列的產(chǎn)生概率Pp (步驟140)。關(guān)于該點(diǎn)，特別地，在本發(fā)明中，在一個(gè)時(shí)序光強(qiáng)度數(shù)據(jù)上可能存在發(fā)光粒子的信號(hào)和非發(fā)光粒子的信號(hào)。因而，關(guān)于假定為在光檢測區(qū)域內(nèi)存在粒子的情況下的產(chǎn)生概率Pp，分別計(jì)算假定為在光檢測區(qū)域內(nèi)存在發(fā)光粒子的情況下的產(chǎn)生概率Pp+以及假定為在檢測區(qū)域內(nèi)存在非發(fā)光粒子的情況下的產(chǎn)生概率Pp_(Pp+是使用式(6)計(jì)算出的概率，Pp-是使用式(7)計(jì)算出的概率。)然后，將計(jì)算出的產(chǎn)生概率Pp+、Pp-、Pn相互比較，判斷在解析窗內(nèi)是否存在發(fā)光粒子或非發(fā)光粒子(步驟150)。在所述判斷中，計(jì)算產(chǎn)生概率Pp+或Pp-與產(chǎn)生概率Pn的比值比(參照式(8))，在發(fā)光粒子的比值比為規(guī)定值以上時(shí)，可以判斷為存在發(fā)光粒子，在非發(fā)光粒子的比值比為規(guī)定值以上時(shí)，可以判斷為存在非發(fā)光粒子。此為，在假定為在光檢測區(qū)域內(nèi)存在粒子的情況下的產(chǎn)生概率Pp+、Pp-的計(jì)算中，可以假定為強(qiáng)度值的預(yù)期值在解析窗的中心存在強(qiáng)度的峰值。實(shí)際上，粒子的信號(hào)的峰值幾乎不存在于解析窗的中心，實(shí)際的粒子的信號(hào)的峰值的位置距解析窗的中心越遠(yuǎn)，產(chǎn)生概率Pp+、Pp-的值越低，但是相比于不存在實(shí)際的粒子的信號(hào)時(shí)的產(chǎn)生概率Pn的值而言是高的值。
[0151]上述步驟130?150的處理中的解析窗內(nèi)的產(chǎn)生概率Pp、Pn的計(jì)算以及粒子信號(hào)的檢測可以在光強(qiáng)度數(shù)據(jù)上設(shè)定的所有解析窗中執(zhí)行(步驟160)。
[0152](iii)粒子濃度的確定
[0153]并且，也可以對(duì)檢測出的單個(gè)粒子的信號(hào)的個(gè)數(shù)進(jìn)行計(jì)數(shù)來確定粒子的個(gè)數(shù)(粒子的計(jì)數(shù))。另外，如果通過任意的方法能夠確定光檢測區(qū)域所通過的區(qū)域的總體積，則能夠根據(jù)其體積值和粒子的個(gè)數(shù)確定樣本溶液中的粒子的數(shù)密度或濃度(步驟170)。
[0154]光檢測區(qū)域所通過的區(qū)域的總體積可以根據(jù)激勵(lì)光或檢測光的波長、透鏡的數(shù)值孔徑、光學(xué)系統(tǒng)的調(diào)整狀態(tài)在理論上進(jìn)行估算，但是也可以通過實(shí)驗(yàn)，例如根據(jù)針對(duì)粒子濃度已知的溶液(對(duì)照溶液)以與要檢查的樣本溶液的測量條件相同的條件進(jìn)行上述所說明的光強(qiáng)度的測量、粒子的檢測以及計(jì)數(shù)所檢測出的粒子的個(gè)數(shù)和對(duì)照溶液的粒子的濃度來確定。具體地說，例如當(dāng)針對(duì)粒子濃度C的對(duì)照溶液，將對(duì)照溶液的單個(gè)粒子的檢測數(shù)設(shè)為N時(shí)，光檢測區(qū)域所通過的區(qū)域的總體積Vt通過下式給出。
[0155]Vt = N/C...(10)
[0156]另外，例如可以準(zhǔn)備單個(gè)粒子的濃度不同的多個(gè)溶液作為對(duì)照溶液，針對(duì)多個(gè)溶液分別執(zhí)行測量，采用計(jì)算出的Vt的平均值作為光檢測區(qū)域所通過的區(qū)域的總體積vt。而且，當(dāng)給出Vt時(shí)，單個(gè)粒子的計(jì)數(shù)結(jié)果為η的樣本溶液的粒子濃度C通過下式給出。
[0157]c = n/Vt...(11)
[0158]此外，可以不依據(jù)上述的方法而通過任意的方法、例如通過利用FCS、FIDA等給出光檢測區(qū)域的體積、光檢測區(qū)域所通過的區(qū)域的總體積。另外，在本實(shí)施方式的裝置中，可以針對(duì)所設(shè)想的光檢測區(qū)域的移動(dòng)圖案，將針對(duì)各種標(biāo)準(zhǔn)的粒子的濃度C與粒子的個(gè)數(shù)N之間的關(guān)系(式(10))的信息預(yù)先存儲(chǔ)到計(jì)算機(jī)18的存儲(chǔ)裝置中，在裝置的使用者實(shí)施單個(gè)粒子檢測時(shí)能夠適當(dāng)?shù)乩盟鎯?chǔ)的關(guān)系的信息。
[0159]這樣，在通過光檢測區(qū)域在樣本溶液中進(jìn)行掃描來逐個(gè)檢測粒子的反轉(zhuǎn)型掃描分子計(jì)數(shù)法中，通過上述的處理過程，能夠進(jìn)行樣本溶液中的粒子的計(jì)數(shù)、濃度的確定等。特別地，在本發(fā)明的情況下，分別進(jìn)行發(fā)光粒子和非發(fā)光粒子的計(jì)數(shù)，確定各自的粒子濃度，由此能夠確定每個(gè)種類的粒子的濃度。
[0160](4)檢測固定信號(hào)數(shù)的單個(gè)粒子檢測處理
[0161]在上述的單個(gè)粒子檢測處理中，在某設(shè)定的時(shí)間內(nèi)執(zhí)行光測量之后，在所獲得的光強(qiáng)度數(shù)據(jù)上檢測單個(gè)粒子的信號(hào)。在這種情況下，在樣本溶液中的粒子濃度未知時(shí)，在某固定的測量時(shí)間內(nèi)進(jìn)行光強(qiáng)度的測量的情況下，如果粒子的濃度低，則測量時(shí)間被設(shè)定得足夠長。另一方面，在樣本溶液中的粒子的濃度高的情況下，超過以可允許的或要滿足的精度確定濃度等特性所需要的時(shí)間地持續(xù)進(jìn)行光強(qiáng)度的測量。另外，在樣本溶液中的粒子濃度低于實(shí)驗(yàn)者所設(shè)想的濃度而所設(shè)定的測量時(shí)間不足的情況下，導(dǎo)致結(jié)果的誤差變大。因此，作為單個(gè)粒子檢測處理的另一方式，可以重復(fù)進(jìn)行一邊移動(dòng)光檢測區(qū)域一邊進(jìn)行的光強(qiáng)度的測量和單個(gè)粒子的信號(hào)的檢測直到信號(hào)的個(gè)數(shù)達(dá)到預(yù)先決定的個(gè)數(shù)為止，測量信號(hào)的個(gè)數(shù)達(dá)到預(yù)先決定的個(gè)數(shù)所需要的時(shí)間，根據(jù)所述單個(gè)粒子的信號(hào)的個(gè)數(shù)達(dá)到預(yù)先決定的個(gè)數(shù)所需要的時(shí)間來確定粒子濃度。根據(jù)所述結(jié)構(gòu)，在樣本溶液中的粒子濃度高的情況下，光強(qiáng)度的測量所需要的時(shí)間縮短，在樣本溶液中的粒子濃度低的情況下，能夠持續(xù)進(jìn)行光強(qiáng)度的測量直到獲得達(dá)成結(jié)果(即，粒子濃度)所要求的精度為止。而且，通過將單個(gè)粒子的信號(hào)的個(gè)數(shù)要達(dá)到的預(yù)先決定的個(gè)數(shù)設(shè)定為達(dá)成結(jié)果所要求的精度的粒子數(shù)，將達(dá)成結(jié)果所要求的精度的粒子數(shù)反映到單個(gè)粒子的信號(hào)的個(gè)數(shù)達(dá)到預(yù)先決定的個(gè)數(shù)所需要的時(shí)間，因此可以期待基于該時(shí)間確定的粒子的濃度值具有可允許的或要滿足的精度。此外，在所述結(jié)構(gòu)中也同樣，在本發(fā)明的情況下，針對(duì)多個(gè)檢測波長中的每個(gè)檢測波長執(zhí)行從光測量至粒子濃度的估算的處理。
[0162]⑴基本原理
[0163]粒子的濃度值與信號(hào)數(shù)達(dá)到預(yù)先決定的個(gè)數(shù)所需要的時(shí)間被賦予如下的關(guān)系。即，在某粒子濃度C的樣本溶液中，在時(shí)間τ內(nèi)使光檢測區(qū)域以掃描速度U移動(dòng)的情況下，當(dāng)將光檢測區(qū)域的截面積設(shè)為S時(shí)，檢測的粒子信號(hào)的個(gè)數(shù)X為
[0164]X = CSutNa...(12)。
[0165]在此，Na是阿伏伽德羅數(shù)。因而，當(dāng)設(shè)信號(hào)數(shù)達(dá)到預(yù)先決定的個(gè)數(shù)XE需要時(shí)間T時(shí)，粒子濃度C作為時(shí)間T的函數(shù)而通過下式給出。
[0166]C = XE/ (STuNa)...(13)
[0167]此外，每單位時(shí)間的粒子的檢測速度V根據(jù)信號(hào)數(shù)達(dá)到預(yù)先決定的個(gè)數(shù)XE所需要的時(shí)間T和粒子檢測數(shù)XE，通過下式給出，
[0168]V = ΧΕ/Τ …(14)
[0169]因此，粒子濃度C表示為
[0170]C = V/ (SuNa)...(15)。
[0171]在該式(15)中，粒子濃度C與檢測速度V成線性比例，容易獲知粒子濃度C與檢測速度V的對(duì)應(yīng)關(guān)系，因此在實(shí)際的實(shí)驗(yàn)中，也可以使用檢測速度V來確定粒子濃度C。
[0172](?)處理操作過程
[0173]例如可以通過圖7的流程圖所示的處理過程來執(zhí)行檢測固定信號(hào)數(shù)的單個(gè)粒子檢測處理。在該圖的例子中，如果清楚地進(jìn)行描述，則光檢測區(qū)域的位置的移動(dòng)、來自光檢測區(qū)域的光的檢測、單個(gè)粒子的信號(hào)的檢測以及所檢測出的粒子信號(hào)的計(jì)數(shù)的一系列處理按解析時(shí)間間隔t (規(guī)定的時(shí)間間隔)反復(fù)執(zhí)行直到所檢測出的粒子數(shù)X達(dá)到結(jié)束粒子數(shù)XE(單個(gè)粒子數(shù)要達(dá)到的預(yù)先決定的個(gè)數(shù))為止。此外，應(yīng)該理解為通過計(jì)算機(jī)18的處理動(dòng)作實(shí)現(xiàn)下面記述的一系列的處理和結(jié)構(gòu)。
[0174](a)初始設(shè)定
[0175]參照?qǐng)D7，在操作處理中，具體地說，首先，在向微板9的皿10注入樣本溶液并載置在顯微鏡的臺(tái)上后，當(dāng)使用者向計(jì)算機(jī)18輸入開始光強(qiáng)度的測量和粒子的檢測、計(jì)數(shù)的處理的指示時(shí)，作為初始設(shè)定，計(jì)算機(jī)18進(jìn)行結(jié)束粒子數(shù)XE的設(shè)定(步驟10)和解析時(shí)間間隔t的設(shè)定(步驟20)?？梢杂墒褂谜呷我獾卦O(shè)定結(jié)束粒子數(shù)XE和解析時(shí)間間隔t。能夠參考使用粒子濃度已知的溶液通過預(yù)備實(shí)驗(yàn)得到的結(jié)果來適當(dāng)決定結(jié)束粒子數(shù)XE以能夠達(dá)成粒子濃度的結(jié)果值所要求的精度。作為解析時(shí)間間隔t，可以考慮裝置I的處理速度等適當(dāng)?shù)卦O(shè)定與從處理開始后起至粒子數(shù)(X)達(dá)到結(jié)束粒子數(shù)(XE)為止的時(shí)間相比充分短的任意的時(shí)間間隔。另外，結(jié)束粒子數(shù)XE和解析時(shí)間間隔t也可以分別為參考使用粒子濃度已知的溶液通過預(yù)備實(shí)驗(yàn)得到的結(jié)果而預(yù)先決定的值，將其存儲(chǔ)在裝置I中，自動(dòng)地或者通過使用者的選擇來使用所述存儲(chǔ)值。
[0176](b)粒子數(shù)的檢測
[0177]當(dāng)如上述那樣設(shè)定結(jié)束粒子數(shù)XE和解析時(shí)間間隔t時(shí)，如下述那樣按解析時(shí)間間隔t，反復(fù)執(zhí)行在整個(gè)解析時(shí)間間隔t內(nèi)利用掃描分子計(jì)數(shù)法進(jìn)行的光強(qiáng)度的測量處理及基于所測量出的光強(qiáng)度數(shù)據(jù)的粒子信號(hào)的檢測和粒子數(shù)X的檢測(步驟30)以及對(duì)在步驟30中檢測出的粒子數(shù)X進(jìn)行累加來估算粒子的總數(shù)X(tn)的處理(步驟40)，直到粒子的總數(shù)X(tn)達(dá)到結(jié)束粒子數(shù)XE為止(步驟50)。此外，可以在反復(fù)執(zhí)行步驟30?50的處理之前存儲(chǔ)一系列處理的開始時(shí)間Ts (步驟25)。
[0178]步驟30中的光檢測、粒子數(shù)檢測的處理可以與圖3或圖6所示的處理相同。如果清楚地進(jìn)行描述，則一邊使光檢測區(qū)域的位置在樣本溶液內(nèi)移動(dòng)(樣本溶液內(nèi)的掃描)，一邊在整個(gè)解析時(shí)間間隔t內(nèi)進(jìn)行光強(qiáng)度的測量，然后，計(jì)算機(jī)18通過依照存儲(chǔ)在存儲(chǔ)裝置中的程序的處理，來執(zhí)行所獲得的解析時(shí)間間隔t的時(shí)序光強(qiáng)度數(shù)據(jù)中的表示單個(gè)粒子的存在的信號(hào)的檢測以及檢測數(shù)的計(jì)數(shù)。
[0179]這樣，當(dāng)對(duì)整個(gè)解析時(shí)間間隔t內(nèi)的時(shí)序光強(qiáng)度數(shù)據(jù)的粒子數(shù)X進(jìn)行了檢測時(shí)，通過下式計(jì)算單個(gè)粒子的檢測總數(shù)X (tn)(圖7-步驟40)。
[0180]X(tn) = X (V1) +X...(16)
[0181]此外，X(V1)為直到前一次的解析時(shí)間間隔t為止檢測出的粒子的檢測總數(shù)，其初始值為O。而且，按解析時(shí)間間隔t反復(fù)進(jìn)行步驟30?40直到單個(gè)粒子的檢測總數(shù)X (tn)達(dá)到結(jié)束粒子數(shù)XE為止、SP
[0182]X(tn)彡 XE...(17)
[0183]成立為止(步驟50)。而且，當(dāng)在反復(fù)進(jìn)行步驟30?50的期間式(17)成立時(shí)，結(jié)束樣本溶液的光強(qiáng)度的測量和粒子的檢測、計(jì)數(shù)的處理。當(dāng)步驟30?50的反復(fù)處理結(jié)束時(shí)，可以存儲(chǔ)結(jié)束時(shí)間TE (步驟60)。
[0184](c)粒子數(shù)和測量結(jié)束時(shí)間的顯示
[0185]另外，在按解析時(shí)間間隔t反復(fù)執(zhí)行步驟30?50的期間(式(17)成立之前)，可以在計(jì)算機(jī)18的監(jiān)視器上等顯示器上顯示粒子的檢測總數(shù)X(tn)和/或測量結(jié)束時(shí)間TE或者測量剩余時(shí)間Tr。根據(jù)所述結(jié)構(gòu)，使用者通過查看這些顯示能夠預(yù)測正在執(zhí)行的測量何時(shí)結(jié)束，在這一點(diǎn)上是有利的。
[0186]在執(zhí)行如上所述的顯示的情況下，在圖7的步驟50的判斷中式(17)沒有成立的情況下，執(zhí)行圖中虛線所示的各處理。具體地說，首先，在顯示器上顯示在步驟40中估算出的最新的粒子的檢測總數(shù)X(tn)(步驟52)。此外，在已經(jīng)反復(fù)執(zhí)行了步驟30?50的情況下，更新到目前為止的粒子的檢測總數(shù)X(tn)的值。接著，為了計(jì)算測量結(jié)束時(shí)間TE或測量剩余時(shí)間Tr而計(jì)算步驟30?50的處理開始后的粒子的檢測速度V(步驟54)。當(dāng)前的粒子的檢測速度V可以通過下式給出。
[0187]V = X(tn)/ (Tp-Ts)...(18)
[0188]在此，Tp是當(dāng)前的時(shí)刻。這樣，使用粒子的檢測速度V，通過下式來估計(jì)測量剩余時(shí)間Tr (直到步驟30?50的處理結(jié)束為止的時(shí)間)，
[0189]Tr= (XE-X (tn)) /v...(19)
[0190]另外，通過下式估計(jì)測量結(jié)束時(shí)間TE (步驟30?50的處理結(jié)束的時(shí)間)(步驟56)。
[0191]TE = Tp+Tr...(20)
[0192]然后，將所估計(jì)出的測量結(jié)束時(shí)間TE或測量剩余時(shí)間Tr顯示在顯示器上(步驟58)。此外，在已經(jīng)反復(fù)執(zhí)行了步驟30?50的情況下，更新已經(jīng)顯示的值。另外，在X(tn)=0時(shí)，式(18)或(19)運(yùn)算不出，可以顯示為Tr和TE不明。
[0193]如已經(jīng)記述的那樣，按解析時(shí)間間隔t反復(fù)進(jìn)行上述圖7的步驟30?50的處理。關(guān)于該點(diǎn)，可以從測量開始至結(jié)束為止在圖3或圖6的步驟100以外的信號(hào)處理步驟的執(zhí)行過程中也連續(xù)地執(zhí)行步驟100的光強(qiáng)度的測量。即，當(dāng)在光檢測、粒子數(shù)檢測的處理中一個(gè)循環(huán)的整個(gè)解析時(shí)間間隔t內(nèi)的光強(qiáng)度的測量完成時(shí)，直接連續(xù)地執(zhí)行下一個(gè)循環(huán)的整個(gè)解析時(shí)間間隔t內(nèi)的光強(qiáng)度的測量，同時(shí)在計(jì)算機(jī)18中基于在已完成的循環(huán)的整個(gè)解析時(shí)間間隔t內(nèi)獲取到的光強(qiáng)度數(shù)據(jù)檢測粒子的信號(hào)、執(zhí)行計(jì)數(shù)處理。由此，實(shí)時(shí)地進(jìn)行粒子的檢測、計(jì)數(shù)。
[0194](d)濃度計(jì)算等分析
[0195]這樣，當(dāng)粒子數(shù)達(dá)到結(jié)束粒子數(shù)時(shí)，可以使用粒子數(shù)達(dá)到結(jié)束粒子數(shù)為止的時(shí)間T( = TE-Ts)或者根據(jù)所檢測出的粒子的信號(hào)而獲得的其它信息，來執(zhí)行濃度計(jì)算等分析(步驟70)。如已經(jīng)記述的那樣，利用式(12)，根據(jù)達(dá)到結(jié)束粒子數(shù)為止的時(shí)間T和結(jié)束粒子數(shù)XE來計(jì)算粒子的檢測速度V，根據(jù)粒子的檢測速度V，利用式(13)的關(guān)系來確定粒子濃度。
[0196]此外，式(12)?(15)中的光檢測區(qū)域的通過區(qū)域的截面積S可以根據(jù)激勵(lì)光或檢測光的波長、透鏡的數(shù)值孔徑、光學(xué)系統(tǒng)的調(diào)整狀態(tài)在理論上進(jìn)行估算，但是也可以根據(jù)通過實(shí)驗(yàn)、例如針對(duì)粒子濃度已知的溶液(對(duì)照溶液)以與要檢查的樣本溶液的測量條件相同的條件進(jìn)行上述所說明的光強(qiáng)度的測量、粒子的檢測、計(jì)數(shù)而檢測出的粒子的個(gè)數(shù)和對(duì)照溶液的單個(gè)粒子的濃度來決定。具體地說，例如當(dāng)針對(duì)粒子濃度C的對(duì)照溶液，將以移動(dòng)速度UO在某個(gè)時(shí)間τ O中執(zhí)行的光強(qiáng)度的測量中的粒子的檢測數(shù)設(shè)為N時(shí)，光檢測區(qū)域的通過區(qū)域的截面積S通過下式給出。
[0197]S = N/ (C.Na.U0.το)...(21)
[0198]另外，可以準(zhǔn)備粒子的濃度不同的多個(gè)溶液作為對(duì)照溶液，針對(duì)多個(gè)溶液分別執(zhí)行測量，采用計(jì)算出的S的平均值作為光檢測區(qū)域的截面積S。
[0199]為了驗(yàn)證上述所說明的本發(fā)明的有效性而進(jìn)行了如下的實(shí)驗(yàn)。此外，下面的實(shí)施例例示本發(fā)明的有效性，應(yīng)該理解不是限定本發(fā)明的范圍。
[0200]實(shí)施例1
[0201]驗(yàn)證了在通過本發(fā)明的掃描分子計(jì)數(shù)法的光測量獲得的時(shí)序光強(qiáng)度數(shù)據(jù)中能夠識(shí)別并檢測表示發(fā)光粒子的存在的信號(hào)以及表示非發(fā)光粒子的存在的信號(hào)。
[0202]作為樣本溶液，調(diào)制出使2fM的非熒光微珠(CP-40-10:spherotec(D:4000nm))作為非發(fā)光粒子分散在包含3.25nM的熒光色素ATT0488的20%聚乙二醇溶液中得到的溶液、使2fM的熒光微珠(FP-4052-2:spherotec(D:4000nm))作為發(fā)光粒子分散在上述聚乙二醇溶液中得到的溶液以及使IfM的非熒光微珠和IfM的熒光微珠分散在上述聚乙二醇溶液中得到的溶液。在光的測量中，作為光分析裝置，利用具備共焦熒光顯微鏡的光學(xué)系統(tǒng)和光子計(jì)數(shù)系統(tǒng)的單分子熒光測量裝置MF20 (奧林巴斯株式會(huì)社)，依照在上述的“(2)樣本溶液的光強(qiáng)度的測量”中所說明的方式，針對(duì)上述各個(gè)樣本溶液獲取了時(shí)序光強(qiáng)度數(shù)據(jù)(光子計(jì)數(shù)數(shù)據(jù))。此時(shí)，激勵(lì)光使用50 μ W的488nm的激光，利用帶通光學(xué)濾波器535BP測量510nm-560nm的波長頻帶的光，生成了時(shí)序光子計(jì)數(shù)數(shù)據(jù)。此外，共焦區(qū)組織的直徑設(shè)定為大約4μπι。樣本溶液中的光檢測區(qū)域的位置的移動(dòng)速度設(shè)為9000rpm(67.5mm/秒)JfBINTIME設(shè)為50 μ s，關(guān)于各溶液各進(jìn)行了三次100秒的測量。
[0203]以與圖6關(guān)聯(lián)說明的基于光強(qiáng)度變化的產(chǎn)生概率的單個(gè)粒子信號(hào)的逐個(gè)檢測的方式進(jìn)行了單個(gè)粒子信號(hào)的檢測。圖8的(A)是獲得的時(shí)序光強(qiáng)度數(shù)據(jù)的一部分，圖8的(B)是假定為存在非發(fā)光粒子的情況下的產(chǎn)生概率的比值比，圖8的(C)表示假定為存在發(fā)光粒子的情況下的比值比。如從圖中理解的那樣，在(A)中，觀察到認(rèn)為是非發(fā)光粒子(α)通過的光強(qiáng)度的下降以及認(rèn)為是發(fā)光粒子(β)通過的光強(qiáng)度的增加，與這些對(duì)應(yīng)地，各自的比值比增大。當(dāng)觀察時(shí)序光強(qiáng)度數(shù)據(jù)整體時(shí)，觀察到具有背景光的-87%?-2%的峰值強(qiáng)度的非發(fā)光粒子的信號(hào)和具有背景光的8%?720%的峰值強(qiáng)度的發(fā)光粒子的信號(hào)。
[0204]圖9示出對(duì)于不含粒子的溶液(0:0)、僅含非發(fā)光粒子的溶液(2:0)、僅含發(fā)光粒子的溶液(0:2)、包含發(fā)光粒子和非發(fā)光粒子的溶液(1:1)通過上述的處理檢測出的發(fā)光粒子的信號(hào)數(shù)(凸)和非發(fā)光粒子的信號(hào)數(shù)(凹)各自的平均值(直方圖)和標(biāo)準(zhǔn)偏差(誤差條)。如從圖中理解的那樣，分別檢測出與樣本溶液中包含的粒子的比對(duì)應(yīng)的個(gè)數(shù)的發(fā)光粒子的信號(hào)和非發(fā)光粒子的信號(hào)。該情形表示，根據(jù)本發(fā)明的光分析技術(shù)、即在發(fā)光粒子和非發(fā)光粒子包含在同一樣本溶液中的情況下在適當(dāng)?shù)谋尘肮獯嬖谙聢?zhí)行掃描分子計(jì)數(shù)法，能夠分別識(shí)別并檢測出樣本溶液中的發(fā)光粒子和非發(fā)光粒子。另外，示出了還能夠估計(jì)各粒子的含有量。
[0205]這樣，如從上述實(shí)施例的結(jié)果理解的那樣，根據(jù)依照本發(fā)明的教導(dǎo)的掃描分子計(jì)數(shù)法，能夠按粒子的種類進(jìn)行分散于樣本溶液中的發(fā)光粒子和非發(fā)光粒子的檢測以及與其濃度有關(guān)的信息的獲取。特別地，本發(fā)明逐個(gè)檢測單個(gè)粒子的信號(hào)，因此即使樣本溶液中的粒子濃度低于FCS等光分析技術(shù)所要求的濃度區(qū)域，也能夠檢測粒子，所述特征在對(duì)醫(yī)學(xué)、生物學(xué)的研究開發(fā)領(lǐng)域中經(jīng)常使用的稀少或昂貴的樣本進(jìn)行分析的情況下是有利的。
【權(quán)利要求】
1.一種單個(gè)粒子檢測裝置，使用共焦顯微鏡或多光子顯微鏡的光學(xué)系統(tǒng)檢測在樣本溶液中分散且隨機(jī)運(yùn)動(dòng)的單個(gè)粒子，該單個(gè)粒子檢測裝置的特征在于，包括: 光檢測區(qū)域移動(dòng)部，其使上述光學(xué)系統(tǒng)的光檢測區(qū)域的位置在上述樣本溶液內(nèi)移動(dòng)； 光檢測部，其檢測來自上述光檢測區(qū)域的光；以及 信號(hào)處理部，其生成一邊使上述光檢測區(qū)域的位置在上述樣本溶液內(nèi)移動(dòng)一邊由上述光檢測部檢測出的來自上述光檢測區(qū)域的光的按時(shí)間序列的光強(qiáng)度數(shù)據(jù)，在上述按時(shí)間序列的光強(qiáng)度數(shù)據(jù)中逐個(gè)檢測表示各個(gè)上述單個(gè)粒子的存在的信號(hào)， 其中，由上述光檢測部檢測出的來自上述光檢測區(qū)域的光包含實(shí)質(zhì)固定的背景光，上述單個(gè)粒子包含具有比上述背景光的發(fā)光強(qiáng)度高的發(fā)光強(qiáng)度的第一單個(gè)粒子和具有比上述背景光的發(fā)光強(qiáng)度低的發(fā)光強(qiáng)度的第二單個(gè)粒子，上述第一單個(gè)粒子的上述信號(hào)為在上述第一單個(gè)粒子進(jìn)入到上述光檢測區(qū)域內(nèi)時(shí)產(chǎn)生的、由上述光檢測部檢測出的光強(qiáng)度的增大，上述第二單個(gè)粒子的上述信號(hào)為在上述第二單個(gè)粒子進(jìn)入到上述光檢測區(qū)域內(nèi)時(shí)產(chǎn)生的、由上述光檢測部檢測出的光強(qiáng)度的下降。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的單個(gè)粒子檢測裝置，其特征在于， 上述信號(hào)處理部對(duì)逐個(gè)檢測出的表示上述第一單個(gè)粒子和上述第二單個(gè)粒子的存在的信號(hào)的個(gè)數(shù)分別進(jìn)行計(jì)數(shù)，來對(duì)在上述光檢測區(qū)域的位置移動(dòng)的過程中檢測出的上述第一單個(gè)粒子和上述第二單個(gè)粒子的個(gè)數(shù)進(jìn)行計(jì)數(shù)。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的單個(gè)粒子檢測裝置，其特征在于， 從每單位體積的上述第一單個(gè)粒子釋放的發(fā)光強(qiáng)度超過從上述每單位體積的上述光檢測區(qū)域內(nèi)發(fā)出的背景光強(qiáng)度，從每單位體積的上述第二單個(gè)粒子釋放的發(fā)光強(qiáng)度低于從上述每單位體積的上述光檢測區(qū)域內(nèi)發(fā)出的背景光強(qiáng)度。
4.根據(jù)權(quán)利要求1?3中的任一項(xiàng)所述的單個(gè)粒子檢測裝置，其特征在于， 上述背景光是由在上述樣本溶液內(nèi)分散的物質(zhì)產(chǎn)生的熒光、磷光、化學(xué)發(fā)光、生物發(fā)光或散射光，或是照明光。
5.一種單個(gè)粒子檢測方法，使用共焦顯微鏡或多光子顯微鏡的光學(xué)系統(tǒng)檢測在樣本溶液中分散且隨機(jī)運(yùn)動(dòng)的單個(gè)粒子，該單個(gè)粒子檢測方法的特征在于，包括以下過程: 使上述光學(xué)系統(tǒng)的光檢測區(qū)域的位置在上述樣本溶液內(nèi)移動(dòng)； 一邊使上述光檢測區(qū)域的位置在上述樣本溶液內(nèi)移動(dòng)一邊檢測來自上述光檢測區(qū)域的光并生成按時(shí)間序列的光強(qiáng)度數(shù)據(jù)；以及 在上述按時(shí)間序列的光強(qiáng)度數(shù)據(jù)中逐個(gè)檢測表示各個(gè)上述單個(gè)粒子的存在的信號(hào)， 其中，檢測出的來自上述光檢測區(qū)域的上述光包含實(shí)質(zhì)固定的背景光，上述單個(gè)粒子包含具有比上述背景光的發(fā)光強(qiáng)度高的發(fā)光強(qiáng)度的第一單個(gè)粒子和具有比上述背景光的發(fā)光強(qiáng)度低的發(fā)光強(qiáng)度的第二單個(gè)粒子，上述第一單個(gè)粒子的上述信號(hào)為在上述第一單個(gè)粒子進(jìn)入到上述光檢測區(qū)域內(nèi)時(shí)產(chǎn)生的、被檢測出的光強(qiáng)度的增大，上述第二單個(gè)粒子的上述信號(hào)為在上述第二單個(gè)粒子進(jìn)入到上述光檢測區(qū)域內(nèi)時(shí)產(chǎn)生的、被檢測出的光強(qiáng)度的下降。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的單個(gè)粒子檢測方法，其特征在于， 還包括以下過程:對(duì)逐個(gè)檢測出的表示上述第一單個(gè)粒子和上述第二單個(gè)粒子的存在的信號(hào)的個(gè)數(shù)分別進(jìn)行計(jì)數(shù)，來對(duì)在上述光檢測區(qū)域的位置移動(dòng)的過程中檢測出的上述第一單個(gè)粒子和上述第二單個(gè)粒子的個(gè)數(shù)進(jìn)行計(jì)數(shù)。
7.根據(jù)權(quán)利要求5或6所述的單個(gè)粒子檢測方法，其特征在于， 從每單位體積的上述第一單個(gè)粒子釋放的發(fā)光強(qiáng)度超過從上述每單位體積的上述光檢測區(qū)域內(nèi)發(fā)出的背景光強(qiáng)度，從每單位體積的上述第二單個(gè)粒子釋放的發(fā)光強(qiáng)度低于從上述每單位體積的上述光檢測區(qū)域內(nèi)發(fā)出的背景光強(qiáng)度。
8.根據(jù)權(quán)利要求5?7中的任一項(xiàng)所述的單個(gè)粒子檢測方法，其特征在于， 上述背景光是由在上述樣本溶液內(nèi)分散的物質(zhì)產(chǎn)生的熒光、磷光、化學(xué)發(fā)光、生物發(fā)光或散射光，或是照明光。
9.一種單個(gè)粒子檢測用計(jì)算機(jī)程序，用于使用共焦顯微鏡或多光子顯微鏡的光學(xué)系統(tǒng)檢測在樣本溶液中分散且隨機(jī)運(yùn)動(dòng)的單個(gè)粒子，該單個(gè)粒子檢測用計(jì)算機(jī)程序使計(jì)算機(jī)執(zhí)行以下步驟: 使上述光學(xué)系統(tǒng)的光檢測區(qū)域的位置在上述樣本溶液內(nèi)移動(dòng)； 一邊使上述光檢測區(qū)域的位置在上述樣本溶液內(nèi)移動(dòng)一邊檢測來自上述光檢測區(qū)域的光并生成按時(shí)間序列的光強(qiáng)度數(shù)據(jù)；以及 在上述按時(shí)間序列的光強(qiáng)度數(shù)據(jù)中逐個(gè)檢測表示各個(gè)上述單個(gè)粒子的存在的信號(hào)； 其中，檢測出的來自上述光檢測區(qū)域的上述光包含實(shí)質(zhì)固定的背景光，上述單個(gè)粒子包含具有比上述背景光的發(fā)光強(qiáng)度高的發(fā)光強(qiáng)度的第一單個(gè)粒子和具有比上述背景光的發(fā)光強(qiáng)度低的發(fā)光強(qiáng)度的第二單個(gè)粒子，上述第一單個(gè)粒子的上述信號(hào)為在上述第一單個(gè)粒子進(jìn)入到上述光檢測區(qū)域內(nèi)時(shí)產(chǎn)生的、被檢測出的光強(qiáng)度的增大，上述第二單個(gè)粒子的上述信號(hào)為在上述第二單個(gè)粒子進(jìn)入到上述光檢測區(qū)域內(nèi)時(shí)產(chǎn)生的、被檢測出的光強(qiáng)度的下降。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的單個(gè)粒子檢測用計(jì)算機(jī)程序，其特征在于， 還包含以下步驟:對(duì)逐個(gè)檢測出的表示上述第一單個(gè)粒子和上述第二單個(gè)粒子的存在的信號(hào)的個(gè)數(shù)分別進(jìn)行計(jì)數(shù)，來對(duì)在上述光檢測區(qū)域的位置移動(dòng)的過程中檢測出的上述第一單個(gè)粒子和上述第二單個(gè)粒子的個(gè)數(shù)進(jìn)行計(jì)數(shù)。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的單個(gè)粒子檢測用計(jì)算機(jī)程序，其特征在于， 從每單位體積的上述第一單個(gè)粒子釋放的發(fā)光強(qiáng)度超過從上述每單位體積的上述光檢測區(qū)域內(nèi)發(fā)出的背景光強(qiáng)度，從每單位體積的上述第二單個(gè)粒子釋放的發(fā)光強(qiáng)度低于從上述每單位體積的上述光檢測區(qū)域內(nèi)發(fā)出的背景光強(qiáng)度。
12.根據(jù)權(quán)利要求9?11中的任一項(xiàng)所述的單個(gè)粒子檢測用計(jì)算機(jī)程序，其特征在于， 上述背景光是由在上述樣本溶液內(nèi)分散的物質(zhì)產(chǎn)生的熒光、磷光、化學(xué)發(fā)光、生物發(fā)光或散射光，或是照明光。
【文檔編號(hào)】G01N21/64GK104246479SQ201380020726
【公開日】2014年12月24日 申請(qǐng)日期:2013年3月11日 優(yōu)先權(quán)日:2012年4月18日
【發(fā)明者】葉梨拓哉 申請(qǐng)人:奧林巴斯株式會(huì)社