一種可用于全血檢測(cè)的快捷去除紅細(xì)胞的方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及醫(yī)藥衛(wèi)生領(lǐng)域，提供了一種簡(jiǎn)單且快速的有效分離血紅細(xì)胞的方法。該方法結(jié)合免疫凝集與磁性分離技術(shù)，通過(guò)羊抗人血紅細(xì)胞抗體與血紅細(xì)胞形成抗原-抗體復(fù)合物，再與包被有鼠抗羊Fc端的單克隆抗體的磁性微球發(fā)生免疫吸附從而產(chǎn)生更為強(qiáng)烈的凝集反應(yīng)，進(jìn)而磁性分離達(dá)到去除紅細(xì)胞的目的。該發(fā)明通過(guò)簡(jiǎn)單快速的方法去除樣本中的紅細(xì)胞，可應(yīng)用于全自動(dòng)和半自動(dòng)化學(xué)發(fā)光儀，以便于實(shí)現(xiàn)普通試劑盒的全血檢測(cè)。
【專利說(shuō)明】-種可用于全血檢測(cè)的快捷去除紅細(xì)胞的方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及醫(yī)藥衛(wèi)生領(lǐng)域，提供了一種簡(jiǎn)單且快速有效分離血紅細(xì)胞的方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 目前臨床上血清分離的方法為采血后，采血管靜置30分鐘,通過(guò)離心將紅細(xì)胞、 白細(xì)胞、血小板與血清分開(kāi)。由于離心過(guò)程中產(chǎn)生一定的離心力，這種離心力會(huì)導(dǎo)致血紅細(xì) 胞堆積從而導(dǎo)致細(xì)胞的破裂造成溶血。離心是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程，尤其是在樣本量大的時(shí)候， 即使是熟練的操作人員很難保證操作每份樣本的均一性。相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，由離心分離操作 不當(dāng)導(dǎo)致的溶血，占溶血現(xiàn)象的41. 2%。
[0003] 紅細(xì)胞會(huì)干擾常規(guī)試劑盒中免疫磁珠捕獲抗原的性能，這也是諸多常規(guī)的化學(xué)發(fā) 光試劑無(wú)法檢測(cè)全血樣本的原因，此外紅細(xì)胞的破裂會(huì)造成大量的血紅蛋白、高濃度離子 或酶釋放，會(huì)引起測(cè)量誤差，從而極大降低了標(biāo)本檢測(cè)的準(zhǔn)確性。在檢測(cè)過(guò)程中，溶血現(xiàn)象 會(huì)增加假性的比例。
[0004] 此外，常規(guī)的血紅細(xì)胞分離手段耗時(shí)較長(zhǎng)，且操作復(fù)雜，一旦樣本量增大將會(huì)帶來(lái) 極大的人工成本。此外，某些項(xiàng)目的分子標(biāo)志物半衰期非常短，僅為十幾分鐘，此時(shí)快速的 檢測(cè)，可以更準(zhǔn)確、真實(shí)的反應(yīng)待測(cè)分子的含量；在心肌梗塞患者中，更會(huì)體現(xiàn)精短的測(cè)量 時(shí)間帶來(lái)的優(yōu)勢(shì)，有利于為患者爭(zhēng)取寶貴的時(shí)間以便在第一時(shí)間內(nèi)進(jìn)行治療。
[0005] 例如在PCT的檢測(cè)過(guò)程中發(fā)現(xiàn)它在細(xì)菌感染時(shí)升高，并且其升高程度與感染 嚴(yán)重程度、病情預(yù)后密切相關(guān)。近年來(lái)隨著研究的深入，發(fā)現(xiàn)在細(xì)菌感染初期，已經(jīng)有 PCT低水平的升高，文獻(xiàn)報(bào)道，健康人體內(nèi)PCT的含量不超過(guò)0.05ng/ml ;PCT含量介于 0. 05-0. 25ng/ml之間時(shí)預(yù)示著有輕微感染不推薦使用抗生素治療，需做進(jìn)一步觀察；當(dāng) PCT含量大于0. 25ng/ml且小于0. 5ng/ml時(shí)有局部感染，推薦使用抗生素。常規(guī)檢測(cè)全血 樣本雖然在強(qiáng)陽(yáng)性樣本存在的情況下有不錯(cuò)的相關(guān)性，但是斜率遠(yuǎn)小于1，表明了其準(zhǔn)確度 不夠，在0.05ng/ml以下的濃度時(shí)會(huì)產(chǎn)生很大程度上的假陽(yáng)性。因此對(duì)醫(yī)生的判斷造成了 干擾。該發(fā)明的全血處理試劑盒處理后檢測(cè)全血樣本中PCT含量的相關(guān)性和斜率均要優(yōu)于 常規(guī)測(cè)試，這一現(xiàn)象尤其在< 0. 5ng/ml的低值處尤為明顯，這給醫(yī)生對(duì)病人提供治療方案 起到了積極作用。本發(fā)明提供的這種利用免疫反應(yīng)及磁性分離快速去除紅細(xì)胞的方法，操 作簡(jiǎn)單，可大幅縮短紅細(xì)胞去除的時(shí)間，并大大減少了溶血現(xiàn)象的發(fā)生，且可應(yīng)用于全自動(dòng) 和半自動(dòng)化學(xué)發(fā)光儀，配合相應(yīng)的體外診斷試劑盒進(jìn)行全血樣本的檢測(cè)。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的是為克服現(xiàn)有技術(shù)的上述不足，提供了一種利用免疫反應(yīng)及磁性分 離快速去除紅細(xì)胞的方法。
[0007] 本發(fā)明的另一目的是提供一種樣本處理試劑盒，可以解決傳統(tǒng)的化學(xué)發(fā)光試劑無(wú) 法實(shí)現(xiàn)全血檢測(cè)的問(wèn)題。
[0008] 為解決上述問(wèn)題，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案予以實(shí)現(xiàn)：
[0009] -種利用免疫反應(yīng)及磁性分離快速去除紅細(xì)胞的方法。其通過(guò)羊抗人血紅細(xì)胞抗 體與血紅細(xì)胞發(fā)生抗原抗體反應(yīng)形成紅細(xì)胞-羊抗人血紅細(xì)胞抗體復(fù)合體產(chǎn)生凝集，這種 復(fù)合體被包被有鼠抗羊Fc端的單克隆抗體的磁性微球捕獲，進(jìn)而通過(guò)磁性分離達(dá)到去除 紅細(xì)胞的目的。該發(fā)明可應(yīng)用于全自動(dòng)和半自動(dòng)化學(xué)發(fā)光儀，以便于實(shí)現(xiàn)化學(xué)發(fā)光法體外 診斷試劑盒檢測(cè)全血樣本。
[0010] 所述的羊抗人血紅細(xì)胞的抗體為可特異性識(shí)別血紅細(xì)胞的單抗。
[0011] 所述的鼠抗羊Fc端的單克隆抗體為可特異性識(shí)別羊多抗的Fc端的鼠單克隆抗 體。
[0012] 所述用于包被鼠抗羊Fc端的單克隆抗體的磁性微球，是指粒徑在0. 2-50 μ m之 間，表面修飾羧基、氨基、氯甲基等化學(xué)功能基團(tuán)的聚苯乙烯或者二氧化硅超順磁性微粒。
[0013] 一種全血處理試劑盒，包括A液：含羊抗人血紅細(xì)胞抗體的緩沖液；B液：共價(jià)偶 聯(lián)了鼠抗羊Fc端的單克隆抗體的磁性微球懸浮液。
[0014] 所述的A液中儲(chǔ)存抗體緩沖液的組分為磷酸鹽緩沖液、Tris緩沖液、硼酸鹽緩沖 液等pH在5-9之間的緩沖液，其中氯化鈉的含量在lmM-300mM之間，防腐劑為P300、NaN 3、 硫柳萊中的一種或者幾種，保護(hù)蛋白為BSA、0VA、釀蛋白中的一種或者幾種。
[0015] 所述的B液中儲(chǔ)存磁珠的緩沖液組分為磷酸鹽緩沖液、Tris緩沖液、硼酸鹽緩沖 液等pH在5-9之間的緩沖液，其中氯化鈉的含量在lmM-300mM之間，防腐劑為P300、NaN3、 硫柳萊中的一種或者幾種，保護(hù)蛋白為BSA、0VA、釀蛋白中的一種或者幾種。
[0016] 上述檢測(cè)試劑盒的制備方法，包括如下步驟：
[0017] 1)配制 20mM PBS緩沖液，其中含氯化鈉 150mM，0. 1% 的P300,5mg/ml BSA，pH7. 4， 構(gòu)成抗體的儲(chǔ)存液。
[0018] 2)配制 50mM Tris 緩沖液，其中含氯化鈉 150mM，0. 1 % 的 P300,5mg/ml BSA， pH7. 6,構(gòu)成磁珠儲(chǔ)存液。
[0019] 3)制備共價(jià)偶聯(lián)了鼠抗羊Fc端的單克隆抗體的磁性微粒：用活化緩沖液活化納 米粒表面化學(xué)基團(tuán)，活化完成后使用偶聯(lián)緩沖液清洗磁性微粒，加入相當(dāng)于磁性微粒質(zhì)量 的1/20的單克隆抗體，反應(yīng)后使用封閉緩沖液封閉納米粒上空余的活化基團(tuán)，既得鼠抗羊 Fc磁性微粒。

【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0020] 圖1為常規(guī)方法檢測(cè)全血樣本PCT含量
[0021] 圖2為使用本發(fā)明方法檢測(cè)全血樣本PCT含量

【具體實(shí)施方式】
[0022] 下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步的描述，這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明 而不用于限制本發(fā)明的范圍。
[0023] 實(shí)施例
[0024] 1.實(shí)驗(yàn)?zāi)康模?br> [0025] 驗(yàn)證本發(fā)明所闡述的快捷去除紅細(xì)胞的方法輔助化學(xué)發(fā)光體外診斷試劑盒檢測(cè) 全血樣本中的應(yīng)用。
[0026] 2.實(shí)驗(yàn)器材和試劑：
[0027] 化學(xué)發(fā)光儀（深圳新產(chǎn)業(yè)maglumi)，恒溫水浴鍋（HH-60,常州國(guó)華電器有限公 司），微量移液器（Thermo公司），磁性分離架（天津倍思樂(lè)色譜技術(shù)開(kāi)發(fā)中心）。PCT校 準(zhǔn)品（Audit 公司），PBS-T 緩沖液（KH2P04 3. 35g/L，Na2HP04-12H20 17. 9g/L，KC1 0· 2g/L， NaC18. 77g/L，Tween-20 (λ 5g/L，ρΗ7· 2)，PCT 校準(zhǔn)品稀釋液為含 20%牛血清的 PBS-T 緩沖 液，PCT檢測(cè)試劑盒（深圳新產(chǎn)業(yè)），全血處理試劑盒的制備同說(shuō)明書(shū)中闡述的制備方法。
[0028] 3.實(shí)驗(yàn)步驟：
[0029] 3. 1收集50份已知PCT濃度的血液樣本，其中含20份陽(yáng)性血液標(biāo)本和30份陰性 血液標(biāo)本。
[0030] 3. 2. 1常規(guī)PCT試劑盒檢測(cè)全血樣本
[0031] 溫和的顛倒樣本使樣本里面的全血混勻，取100微升樣本，按照PCT檢測(cè)試劑盒說(shuō) 明書(shū)中的要求進(jìn)行操作。
[0032] 3. 2. 2樣本經(jīng)過(guò)該發(fā)明的全血處理試劑盒處理后檢測(cè)
[0033] 溫和的顛倒樣本使樣本里面的全血混勻，取100微升樣本，加入40微升A液，充分 混勻，37°C溫育1分鐘；加入10微升B液，充分混勻，37°C溫育5分鐘，進(jìn)行磁性分離，將上 清吸出，按照PCT檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)中的要求操作該上清。
【權(quán)利要求】
1. 一種有效分離血紅細(xì)胞的方法，該方法可快速有效的去除血液樣本中的紅細(xì)胞，并 減少溶血現(xiàn)象的發(fā)生。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的分離血紅細(xì)胞的方法，其特征在于涉及到免疫凝集、免疫吸 附及磁性分尚技術(shù)。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的免疫凝集，其特征在于羊抗人血紅細(xì)胞抗體與紅細(xì)胞發(fā)生抗 原抗體反應(yīng)形成紅細(xì)胞-羊抗人血紅細(xì)胞抗體復(fù)合體，產(chǎn)生凝集。
4. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的免疫吸附和磁性分離技術(shù)，其特征在于包被有鼠抗羊Fc端單 克隆抗體的磁性微球捕獲免疫凝集之后的復(fù)合體，在外加磁場(chǎng)的作用下將復(fù)合體從血漿中 分離出來(lái)。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的磁性微球，其特征在于直徑為0. 2-50 μ m，表面修飾羧基、氨 基、氯甲基等化學(xué)功能基團(tuán)的聚苯乙烯或者二氧化硅超順磁性微粒。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的快捷去除紅細(xì)胞的方法，其特征在于可大幅縮短紅細(xì)胞去除 時(shí)間，并可與全自動(dòng)及半自動(dòng)化學(xué)發(fā)光儀配合，實(shí)現(xiàn)普通試劑盒的全血檢測(cè)。
【文檔編號(hào)】G01N33/577GK104111333SQ201310571230
【公開(kāi)日】2014年10月22日 申請(qǐng)日期:2013年11月13日 優(yōu)先權(quán)日:2013年11月13日
【發(fā)明者】葉森 申請(qǐng)人:葉森