黃曲霉特異性單鏈抗體的制備方法和應(yīng)用的制作方法【專利摘要】本發(fā)明屬于食品有害生物分子檢測(cè)領(lǐng)域，涉及一種黃曲霉特異單鏈抗體的制備方法及應(yīng)用。將黃曲霉菌絲細(xì)胞壁蛋白分別免疫雞和小鼠，提取免疫后的雞脾臟淋巴細(xì)胞的信使RNA，構(gòu)建雞源單鏈抗體文庫(kù)，通過(guò)噬菌體表面展示技術(shù)篩選文庫(kù)后得到了對(duì)黃曲霉具有高親和力的曲霉屬特異性單鏈抗體基因。將該抗體基因亞克隆至堿性磷酸酶蛋白表達(dá)載體中并在大腸桿菌中表達(dá)純化，得到融合蛋白和分泌黃曲霉特異性單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞2A8。以單抗為捕獲抗體，AfSA4-AP融合蛋白為檢測(cè)抗體，建立SandWich?ELISA免疫學(xué)檢測(cè)系統(tǒng)可檢測(cè)作物及儲(chǔ)藏植物源產(chǎn)品中黃曲霉污染。【專利說(shuō)明】黃曲霉特異性單鏈抗體的制備方法和應(yīng)用【
技術(shù)領(lǐng)域：
】[0001]本發(fā)明屬于食品有害微生物分子檢測(cè)【
技術(shù)領(lǐng)域：
】，具體涉及一種黃曲霉特異單鏈抗體和單克隆抗體的制備方法及其在黃曲霉免疫學(xué)檢測(cè)中的應(yīng)用。【
背景技術(shù)：
】[0002]黃曲霉(Aspergillusflavus)和寄生曲霉(A.parasiticus)是廣泛分布的產(chǎn)生黃曲霉毒素的絲狀真菌,可以侵染花生(ArachishypogaeaL.)、玉米(ZeamaysL.)、棉花(Gossypiumspp.)等引起多種作物的病害,危害糧食和經(jīng)濟(jì)作物的生產(chǎn),造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。在糧食儲(chǔ)減以及食品和詞料的加工、運(yùn)輸?shù)拳h(huán)節(jié)也及易發(fā)生黃曲霉和寄生曲霉的污染，導(dǎo)致黃曲霉毒素的積累，從而嚴(yán)重威脅人畜健康及食品安全。黃曲霉毒素主要有AFB1,AFB2,AFG1,AFG2四種類型，主要由黃曲霉和寄生曲霉產(chǎn)生，在我國(guó)華南、華中、華北地區(qū)產(chǎn)毒菌株分布較廣。黃曲霉毒素是真菌生長(zhǎng)過(guò)程中的次級(jí)代謝產(chǎn)物，具有強(qiáng)烈的急性毒性和強(qiáng)烈的致癌、致畸作應(yīng)，被國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu)(IARC)認(rèn)定為I類致癌物。此外，黃曲霉菌是僅次于煙曲霉(A.fumigatus)的可引起人畜侵襲性曲霉病的第二大類病原菌，嚴(yán)重危害人畜健康。黃曲霉毒素非常穩(wěn)定，高溫(200°C)處理、紫外照射都不能使其分解，一旦發(fā)生污染很難進(jìn)行除去。因此，快速有效的對(duì)黃曲霉、寄生曲霉檢測(cè)方法對(duì)于監(jiān)測(cè)農(nóng)作物病害發(fā)生、從源頭上控制黃曲霉毒素的污染具有重要意義。本發(fā)明選用的抗原制備菌株是高產(chǎn)毒的黃曲霉囷株。[0003]目前對(duì)黃曲霉、寄生曲霉的監(jiān)測(cè)方法主要是傳統(tǒng)生物學(xué)方法(如:傳統(tǒng)培養(yǎng)基法)、分子檢測(cè)(如:PCR)、免疫學(xué)檢測(cè)(如:ELISA)。傳統(tǒng)培養(yǎng)基法耗時(shí)太長(zhǎng)，PCR分子檢測(cè)方法需要特殊的儀器和器材，需專門提取樣品的DNA，樣品前處理步驟繁瑣，操作人員需要具備專門技能。此外，這些傳統(tǒng)檢測(cè)方法的現(xiàn)場(chǎng)實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)及檢測(cè)方法的微型化都受到限制。酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測(cè)具有較高的特異性和靈敏度，樣品不需要復(fù)雜的前處理，便于微型化操作和進(jìn)行現(xiàn)場(chǎng)實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)，不受儀器設(shè)備和專業(yè)操作人員的限制。ELISA檢測(cè)中常用的酶標(biāo)二抗為辣根過(guò)氧化物酶(HRP)和堿性磷酸酶(AP)標(biāo)記的抗體，一般通過(guò)化學(xué)交聯(lián)的方法將催化酶標(biāo)記到抗體上。具有隨機(jī)反應(yīng)特點(diǎn)的化學(xué)交聯(lián)過(guò)程所產(chǎn)生的交聯(lián)位點(diǎn)可能會(huì)影響抗體與抗原的結(jié)合，導(dǎo)致抗體特異性和親和力下降，`對(duì)交聯(lián)反應(yīng)的優(yōu)化和酶標(biāo)抗體的質(zhì)量檢測(cè)也會(huì)導(dǎo)致生產(chǎn)成本的提高。利用生物技術(shù)得到的單鏈抗體(scFv)具有單克隆抗體的同質(zhì)性的特點(diǎn)并且基因編碼序列明確，同時(shí)可以通過(guò)微生物發(fā)酵進(jìn)行大量生產(chǎn)。此外，還可以通過(guò)基因工程手段對(duì)單鏈抗體進(jìn)行改造，可以得到抗體和酶的融合蛋白，這種同時(shí)具有抗原識(shí)別能力和酶催化活性的雙功能蛋白可以極大促進(jìn)ELISA檢測(cè)方法的應(yīng)用。本發(fā)明通過(guò)免疫雞，在克隆雞的抗體基因基礎(chǔ)上構(gòu)建了單鏈抗體噬菌體展示文庫(kù)，利用噬菌體展示方法對(duì)文庫(kù)進(jìn)行了篩選之后得到了可以識(shí)別黃曲霉和寄生曲霉的單鏈抗體基因。通過(guò)免疫小鼠制備了一株可分泌黃曲霉特異單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株。通過(guò)對(duì)單鏈抗體基因進(jìn)行基因工程改造得到了scFv-AP融合蛋白并在大腸桿菌中進(jìn)行大量表達(dá)。該scFv-AP融合蛋白可以與黃曲霉特異單克隆抗體配套使用在雙抗體夾心ELISA檢測(cè)當(dāng)中。該檢測(cè)方法靈敏度高，不需要額外的酶標(biāo)二抗操作簡(jiǎn)便迅速，可以應(yīng)用于農(nóng)作物種植、糧食儲(chǔ)藏、食品和飼料加工等領(lǐng)域中的對(duì)黃曲霉和寄生曲霉污染的檢測(cè)?！?br/>發(fā)明內(nèi)容】[0004]本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，其目的之一在于提供一種黃曲霉特異單鏈抗體基因，該基因利用噬菌體展示技術(shù)從免疫后的雞源單鏈抗體文庫(kù)中獲得，申請(qǐng)人:將該基因命名為AfSA4，其核苷酸序列如SEQIDNO:1所示(長(zhǎng)度為756bp)，其編碼的蛋白質(zhì)的氨基酸的序列如序列表SEQIDNO:2所示。本發(fā)明的黃曲霉特異單鏈抗體基因由輕鏈可變區(qū)和重鏈可變區(qū)組成，輕鏈可變區(qū)\由312個(gè)核苷酸編碼，其核苷酸序列如SEQIDNO:3所示(長(zhǎng)度為390bp);重鏈可變區(qū)V11由390個(gè)核苷酸編碼，其核苷酸序列如SEQIDNO:5所示(長(zhǎng)度為312bp)。[0005]本發(fā)明的目的之二在于提供了一種黃曲霉特異單鏈抗體蛋白，其蛋白質(zhì)的序列如SEQIDNO:2所示，其輕鏈可變區(qū)\由104個(gè)氨基酸編碼，序列如SEQIDNO:4所示；重鏈可變區(qū)V11由130個(gè)氨基酸編碼，其序列如SEQIDNO:6所示，輕鏈可變區(qū)和重鏈可變區(qū)由連接肽(GGSSRSSSSGGGGSGGGG)連接。[0006]本發(fā)明的目的之三在于提供了一種黃曲霉特異單鏈抗體蛋白與堿性磷酸酶的融合基因，申請(qǐng)人:將其命名為AfSA4-AP，其序列如SEQIDNO:7所示(長(zhǎng)度為2175bp)。[0007]本發(fā)明的目的之四在于提供了一種黃曲霉特異單鏈抗體蛋白與堿性磷酸酶的融合蛋白，其編碼序列如SEQIDNO:8所示(編碼725個(gè)氨基酸)。單鏈抗體和堿性磷酸酶之間通過(guò)連接肽(SSGSTSGSGKPGSGEGST)連接。[0008]本發(fā)明的目的之五在于提供了一種能夠分泌抗黃曲霉的單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株2A8。[0009]本發(fā)明的目的之六在于提供了一種新型的黃曲霉和寄生曲霉的雙抗體夾心酶聯(lián)免疫檢測(cè)方法(SandwichELISA)，以單克隆抗體2A8作為捕獲抗體，以融合蛋白AfSA4_AP作為檢測(cè)抗體。[0010]具體地，為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案:[0011]從黃曲霉菌菌絲細(xì)胞壁中提取可溶性細(xì)胞壁蛋白(SCWPs)，用細(xì)胞壁蛋白免疫來(lái)亨母雞，利用分子克隆的技術(shù)和方法構(gòu)建了雞源單鏈抗體噬菌體展示文`庫(kù)，然后利用噬菌體展示技術(shù)篩選得到了高親和力單鏈抗體AfSA4，并進(jìn)一步構(gòu)建了融合蛋白AfSA4-AP。與此同時(shí)，用`細(xì)胞壁蛋白免疫的Balb/c小鼠后，利用雜交瘤細(xì)胞融合技術(shù)篩選得到了抗黃曲霉的單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株2A8。單克隆抗體2A8(捕獲抗體)和單鏈抗體融合蛋白AfSA4-AP(檢測(cè)抗體)可以配套應(yīng)用與黃曲霉菌的檢測(cè)當(dāng)中。[0012]一種黃曲霉特異單鏈抗體基因，其制備過(guò)程如下:[0013]從培養(yǎng)的黃曲霉菌絲中制備可溶性細(xì)胞壁蛋白SCWPs，然后免疫來(lái)亨母雞，在獲得滿意抗體效價(jià)后提取脾臟和骨髓淋巴細(xì)胞的mRNA并逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，然后從cDNA中經(jīng)PCR擴(kuò)增得到雞抗體的重鏈可變區(qū)基因(V11)和輕鏈可變區(qū)基因(')片段，以及單鏈抗體基因(scFv)。將scFv基因亞克隆至噬菌粒載體pComb3X上，電轉(zhuǎn)化至大腸桿菌XLl-BlueMRF’得到單鏈抗體曬菌體展示文庫(kù)。單鏈抗體曬菌體展示文庫(kù)經(jīng)過(guò)曬菌體展示篩選、表達(dá)ELISA鑒定和單鏈抗體基因序列分析后得到一種高親和力單鏈抗體基因，將其命名為AfSA4，其核苷酸序列如SEQIDNO:1所不，序列長(zhǎng)度為756bp。[0014]一種黃曲霉特異單鏈抗體蛋白，其制備過(guò)程如下:[0015]將含有黃曲霉特異單鏈抗體基因AfSA4的pComb3X載體(pComb3X_AfSA4)轉(zhuǎn)化至大腸桿菌TOP10中，經(jīng)誘導(dǎo)物異丙基-P-D-硫代半乳糖苷誘導(dǎo)表達(dá)后，利用N1-NTA親和層析純化獲得AfSA4抗體蛋白。SDS-PAGE電泳檢測(cè)結(jié)果(圖6)表明AfSA4抗體蛋白分子量大小約為35kD，其編碼的氨基酸序列如SEQIDNO:2所示。[0016]一種黃曲霉特異單鏈抗體在黃曲霉菌和寄生曲霉菌檢測(cè)中的應(yīng)用，其應(yīng)用過(guò)程如下:[0017]將達(dá)到純化的AfSA4抗體通過(guò)間接酶聯(lián)免疫反應(yīng)(IndirectELISA)檢測(cè)方法或制備成檢測(cè)試劑盒、試紙條和蛋白芯片等應(yīng)用于黃曲霉菌和寄生曲霉菌的檢測(cè)。[0018]I)將100黃曲霉菌或寄生曲霉菌SCWPs(制備方法見實(shí)施例1)(IOiig/ml)加入ELISA板孔中，37°C溫浴2h或4°C放置過(guò)夜，進(jìn)行抗原包被。[0019]2)每個(gè)ELISA板孔用300UIPBST洗滌3次，每次30sec。[0020]3)將300ill封閉液(含2%(ff/V)脫脂奶粉的PBS溶液(成分:137mMNaCl，2.7mMKCl,IOmMNa2HPO4,1.8mMKH2PO4,pH7.2~7.4)，加入到抗原包被孔和空白對(duì)照孔中，于37°C封閉2h。[0021]4)每孔用300UIPBST洗滌3次，每次30sec。[0022]5)每孔加入100UI稀釋在封閉液中的AfSA4抗體(200nM)，37°C溫浴2h。[0023]6)每孔用300UIPBST(含0.05%Tween20的PBS)洗滌3次，每次30sec。[0024]7)每孔加入100UI稀釋在封閉液中的鼠抗HA標(biāo)簽抗體(購(gòu)自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司，體積比為1:10，000)，371:溫浴211。[0025]8)每孔用300UIPBST洗滌3次，每次30sec。[0026]9)每孔加入100UI稀釋在封閉液中的AP標(biāo)記羊抗鼠IgG抗體(購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，體積比為1:10，000)，371:溫浴211。[0027]10)每孔用300UIPBST和PBS分別洗滌3次，每次30sec。[0028]11)每孔加入IOOuI顯色液[0.2%(W/V，)對(duì)硝基苯磷酸二鈉(pNPP)溶液(0.1Mglycinebuffer,pH10.4,ImMMgCl2,ImMZnC12)],避光反應(yīng)15~30min,用酶標(biāo)儀測(cè)定0D405nm值。[0029]根據(jù)ELISA結(jié)果顯示，AfSA4抗體對(duì)黃曲霉菌和寄生曲霉菌SCWPs具有高親和力，酶標(biāo)儀測(cè)定的OD4tl5nm平均值為1.560(黃曲霉)和2.188(寄生曲霉)，分別比陰性對(duì)照高出36.3倍和47.6倍。在實(shí)際檢測(cè)過(guò)程中樣品前處理方法簡(jiǎn)單，將樣品直接研磨后即可進(jìn)行檢測(cè)。[0030]一種黃曲霉特異單鏈抗體的融合蛋白，其制備過(guò)程如下:[0031]將黃曲霉特異單鏈抗體基因AfSA4亞克隆到pDAP2/S載體上，重組載體pDAP2/S-AfSA4轉(zhuǎn)化至大腸桿菌XLl-BlueMRF’中，經(jīng)異丙基-P-D-硫代半乳糖苷誘導(dǎo)表達(dá)后，利用N1-NTA親和層析純化(HuZQ,LiHP,etal.Anal.Chim.Acta2013，764:84-92.)獲得AfSA4-AP抗體融合蛋白。純化后的AfSA4-AP融合蛋白經(jīng)SDS-PAGE電泳檢測(cè)發(fā)現(xiàn)其分子量約為80kD(圖9)，其序列如SEQIDNO:8所示。[0032]一株黃曲霉特異的單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株，其制備過(guò)程如下:[0033]用黃曲霉可溶性細(xì)胞壁蛋白SCWPs免疫Balb/c小鼠后，取小鼠的脾淋巴細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞Sp2/0進(jìn)行融合，經(jīng)篩選得到雜交瘤細(xì)胞后，利用SCWPs抗原對(duì)雜交瘤細(xì)胞進(jìn)行ELISA篩選，經(jīng)過(guò)亞克隆后獲得I株能夠穩(wěn)定分泌抗黃曲霉的單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株，申請(qǐng)人:將其命名為2A8。從接種雜交瘤細(xì)胞的小鼠腹水中利用硫酸銨沉淀法純化得到單克隆抗體2A8，通過(guò)ELISA鑒定抗體的效價(jià)和特異性。[0034]申請(qǐng)人:已于2013年8月12日將獲得的黃曲霉特異的單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株2A8送中國(guó).武漢.武漢大學(xué)中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)保藏，保藏號(hào)為CCTCCNO:C2013101。[0035]一種黃曲霉特異單鏈抗體融合蛋白和單克隆抗體在黃曲霉菌和寄生曲霉菌檢測(cè)中的應(yīng)用，其應(yīng)用過(guò)程如下:[0036]將純化的單克隆抗體2A8和融合蛋白AfSA4-AP通過(guò)雙抗體夾心酶聯(lián)免疫(SandwichELISA)檢測(cè)方法(BoscoloS,PelinM,etal.Environ.Sc1.Technol.2013，47:2034-2042.)或制備成檢測(cè)試劑盒、試紙條和蛋白芯片等應(yīng)用于黃曲霉菌和寄生曲霉菌的檢測(cè)。[0037]I)將100ill稀釋在PBS中的單克隆抗體2A8(20iig/ml)加入ELISA板孔中，4°C放置過(guò)夜,進(jìn)行包被。[0038]2)每個(gè)ELISA板孔用300UIPBST洗滌3次，每次30sec。[0039]3)每孔加入300UI封閉液(含2%(W/V)脫脂奶粉的PBS溶液)37°C封閉2h。[0040]4)每孔用300UIPBST洗滌3次，每次30sec。[0041]5)每孔加入IOOiU黃曲霉菌或寄生曲霉菌SCWPs(10iig/ml)，37°C溫浴2h?？瞻讓?duì)照加入PBS。[0042]6)每孔用300UIPBST洗滌3次，每次30sec。[0043]7)每孔加入IOOiU稀釋在封閉液中的AfSA4-AP融合蛋白(200nM)，37°C溫浴2h。[0044]8)每孔用300UIPBST和PBS分別洗滌3次，每次30sec。[0045]9)每孔加入IOOiUpNPP顯色液，避光反應(yīng)15~30min，用酶標(biāo)儀測(cè)定OD4tl5nm值。[0046]根據(jù)ELISA結(jié)果顯示，本發(fā)明的單克隆抗體2A8和融合蛋白AfSA4_AP對(duì)黃曲霉菌和寄生曲霉菌SCWPs具有高親和力，酶標(biāo)儀測(cè)定的OD4tl5nm平均值為2.346(黃曲霉)和2.322(寄生曲霉)，分別比陰性對(duì)照高出33.0倍和39.4倍。在實(shí)際檢測(cè)過(guò)程中樣品前處理方法簡(jiǎn)單，將樣品直接研磨后即可進(jìn)行檢測(cè)。[0047]本發(fā)明的有益效果:[0048]1、本發(fā)明的有益效果之一是利用單鏈抗體噬菌體展示文庫(kù)技術(shù)，構(gòu)建了黃曲霉特異單鏈抗體文庫(kù)，利用噬菌體展示技術(shù)從抗體文庫(kù)中篩選得到一個(gè)高親和力的黃曲霉特異單鏈抗體及其編碼基因AfSA4。[0049]2、本發(fā)明的有益效果之二是黃曲霉特異單鏈抗體AfSA4在大腸桿菌中誘導(dǎo)表達(dá)后形成可溶性蛋白，并可進(jìn)行純化，易于操作和大規(guī)模生產(chǎn)。[0050]3、本發(fā)明的有益效果之三是從大腸桿菌中純化的AfSA4抗體可應(yīng)用于黃曲霉菌和寄生曲霉菌的間接酶聯(lián)免疫(IndirectELISA)檢測(cè)，包括制備檢測(cè)試劑盒、試紙條和蛋白芯片等，可用在農(nóng)作物生產(chǎn)、飼料加工、糧食儲(chǔ)藏和食品加工等領(lǐng)域中的黃曲霉菌和寄生曲霉菌污染檢測(cè)。[0051]4、本發(fā)明的有益效果之四是AfSA4抗體與AP的融合蛋白可以在大腸桿菌中可溶性表達(dá)和純化，AfSA4-AP融合蛋白可進(jìn)行大規(guī)模生產(chǎn)，制備流程簡(jiǎn)單且成本低。[0052]5、本發(fā)明的有益效果之五是獲得的一株黃曲霉特異單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株2A8能夠用于高親和力單克隆抗體的大規(guī)模生產(chǎn)。[0053]6、本發(fā)明的有益效果之六是黃曲霉特異單克隆抗體2A8可從小鼠腹水中大量獲得，經(jīng)硫酸銨沉淀純化的抗體具有良好的特異性和親和力。[0054]7、本發(fā)明的有益效果之七是黃曲霉特異單克隆抗體2A8和AfSA4_AP融合蛋白可配套進(jìn)行對(duì)黃曲霉菌和寄生曲霉菌的雙抗體夾心酶聯(lián)免疫檢測(cè)(SandwichELISA)，包括制備檢測(cè)試劑盒、試紙條和蛋白芯片等，可用在農(nóng)作物生產(chǎn)、飼料加工、糧食儲(chǔ)藏和食品加工等領(lǐng)域中的黃曲霉菌和寄生曲霉菌污染檢測(cè)。【專利附圖】【附圖說(shuō)明】[0055]圖1:為發(fā)明的總體技術(shù)流程圖。[0056]圖2:為V11,Vl基因片段的凝膠電泳圖。[0057]圖中:M:DNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；泳道1:重鏈可變區(qū)片段(V11);泳道2:輕鏈可變區(qū)片段(Vl)。[0058]圖3:為scFv基因片段的凝膠電泳圖。[0059]圖中:M:DNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；泳道1:scFv基因片段。[0060]圖4:為一種pComb3X載體結(jié)構(gòu)圖。[0061]圖5:為一種表達(dá)ELISA鑒定篩選后的單鏈抗體噬菌體展示文庫(kù)。[0062]圖中:★標(biāo)記為AfSA4,?標(biāo)記為AfSA5,▲標(biāo)記為AfSA8,+標(biāo)記為AfSDIO。[0063]圖6:為一種SDS-PAGE電泳檢測(cè)純化的AfSA4、AfSA5、AfSA8、AfSDlO單鏈抗體示意圖。[0064]圖中:M:蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)；泳道1:AfSA4;泳道2:AfSA5;泳道3:AfSA8;泳道4:AfSDlO0[0065]圖7=ELISA檢測(cè)AfSA4、AfSA5、AfSA8、AfSDlO四種單鏈抗體對(duì)黃曲霉、寄生曲霉親和力示意圖。[0066]圖中:不同的字母(a,(6,y)表不顯著性差異(p〈0.05)。[0067]圖8:為一種AfSA4抗體對(duì)黃曲霉、寄生曲霉的孢子和菌絲免疫熒光檢測(cè)的照片。[0068]圖中:a和c:顯微鏡明場(chǎng)模式下的黃曲霉菌絲^和g:顯微鏡明場(chǎng)模式下的黃曲霉孢子；i和k:顯微鏡明場(chǎng)模式下的寄生曲霉菌絲；111和O:顯微鏡明場(chǎng)模式下的寄生曲霉孢子；b，f，i，n:用AfSA4抗體檢測(cè)a，e,i，m中的菌絲和孢子；d，h，I,p:用PIPP抗體檢測(cè)c,g,k,O中的菌絲和孢子。[0069]圖9:為一種AfSA5、AfSA8、AfSD10抗體對(duì)黃曲霉孢子、菌絲免疫熒光檢測(cè)的照片。[0070]圖中:a,c,e:顯微鏡明場(chǎng)模式下的黃曲霉菌絲；g，i，k:顯微鏡明場(chǎng)模式下的黃曲霉孢子；b，h:用AfSA5抗體檢測(cè)a，g中的菌絲和孢子；d，j:用AfSA8抗體檢測(cè)c，i中的菌絲和孢子；f，1:用AfSDlO抗體檢測(cè)e，k中的菌絲和孢子。[0071]圖10:為一種SDS-PAGE電泳檢測(cè)純化的AfSA4_AP融合蛋白示意圖。[0072]圖中:M:蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)；泳道1:AfSA4_AP融合蛋白。[0073]圖11:為一種Westernblot分析AfSA4、AfSA4_AP融合蛋白識(shí)別黃曲霉和寄生曲霉細(xì)胞壁蛋白的不意圖。[0074]圖中:M:蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)；a:AfSA4識(shí)別的黃曲霉和寄生曲霉細(xì)胞壁蛋白；b:AfSA4-AP識(shí)別的黃曲霉和寄生曲霉細(xì)胞壁蛋白。[0075]圖12:為一種表面等離子共振(SPR)分析AfSA4抗體及AfSA4_AP融合蛋白與黃曲霉SCWPs結(jié)合能力的示意圖。[0076]圖中:a:AfSA4抗體與黃曲霉SCWPs結(jié)合的動(dòng)力學(xué)曲線(AfSA4抗體濃度為50~400nM)；b:AfSA4-AP融合蛋白與黃曲霉SCWPs結(jié)合的動(dòng)力學(xué)曲線(AfSA4_AP融合蛋白濃度為6.25~50nM)；c:AfSA4抗體與AfSA4_AP融合蛋白在50nM濃度下動(dòng)力學(xué)曲線的比較。[0077]圖13:為一種雙抗體夾心ELISA法對(duì)黃曲霉、寄生曲霉最低檢測(cè)限的示意圖。[0078]圖中:?標(biāo)記為雙抗體夾心ELISA法對(duì)黃曲霉的最低檢測(cè)限；▲標(biāo)記為雙抗體夾心ELISA法對(duì)寄生曲霉的最低檢測(cè)限。[0079]圖14:為一種雙抗體夾心ELISA法對(duì)黃曲霉、寄生曲霉最低定量限的示意圖。[0080]圖中:?標(biāo)記為雙抗體夾心ELISA法對(duì)黃曲霉在玉米中的定量限；▲標(biāo)記為雙抗體夾心ELISA法對(duì)黃曲霉在花生中的定量限；〇標(biāo)記為雙抗體夾心ELISA法對(duì)寄生曲霉在玉米中的定量限；A標(biāo)記為雙抗體夾心ELISA法對(duì)寄生曲霉在花生中的定量限?！揪唧w實(shí)施方式】[0081]實(shí)施例1:黃曲霉菌細(xì)胞壁蛋白(SCWPs)制備[0082]I)用滅菌牙簽挑取黃曲霉(Aspergillusflavus)菌株wh_l(采集自中國(guó),湖北，武漢)該菌株經(jīng)形態(tài)鑒定為黃曲霉，其產(chǎn)生黃曲霉毒素的能力經(jīng)過(guò)LC-MS/MS進(jìn)行測(cè)定(HanZ，RenY，etal.J.Agric.FoodChem.2012，60，8233-8247)，在接種花生8天后AFB1和AFB2的含量分別為775.39iig/kg和26iig/kg;在接種玉米8天后AFB1和AFB2的含量分別為1056.8iig/kg和55.04iig/kg)，接種于PDA培養(yǎng)基(成分:20%(W/V)馬鈴薯，2%(ff/V)葡萄糖，1.5%(ff/V)瓊脂)上，28°C培養(yǎng)5天，用含有0.05%Tween-20的無(wú)菌水將菌絲表面的分生孢子洗下，收集孢子液。[0083]2)取上述步驟I)制備的孢子液Iml(IXIO5/ml)接種于160mlCzapek培養(yǎng)基(成分:3%(ff/V)蔗糖，0.3%(ff/V)NaNO3,0.1%(ff/V)K2HPO4j0.05%(ff/V)MgSO4*7H20,0.05%(ff/V)KCl，0.001%(ff/V)FeSO4,pH9.0)中，28°C，200r/min振蕩培養(yǎng)5天。[0084]3)將培養(yǎng)液用2層滅菌紗布過(guò)濾收集菌絲，并用滅菌水洗滌3次后將菌絲冷凍干燥。[0085]4)用液氮冷凍菌絲并在研缽中研磨，轉(zhuǎn)移至50ml離心管中，置于冰上。[0086]5)向離心管中加入40mlCWP緩沖液(IOmMTris-HCl，ImM苯甲基磺酰氟(PMSF)，PH7.8)將菌絲重懸。[0087]6)4°C,50r/min旋轉(zhuǎn)洗漆30min。[0088]7)4°C,4600r/min離心IOmin,棄上清。[0089]8)用預(yù)冷的CWP清洗液(IMNaCl，ImMPMSF)洗滌3次，每次洗滌同步驟6，然后同步驟7)的方法離心。[0090]9)加入40ml含ImMPMSF的滅菌水重懸洗滌3次，每次洗滌同步驟6)，然后用步驟7)的方法離心。[0091]10)力卩AIOml提取液(50mMTris-HCl(pH8.0)，0.1MEDTA，2%(ff/V)SDS,IOmMDTT)重懸沉淀，煮沸l(wèi)Omin。[0092]11)室溫15000r/min離心IOmin0[0093]12)吸取上清，加入4倍體積的10%(V/V)TCA/丙酮，充分混勻后_20°C沉淀30min以上。[0094]13)4°C,15000r/min離心IOmin,棄上清。[0095]14)加入25ml預(yù)冷丙酮重懸沉淀后用步驟13的方法離心。[0096]15)重復(fù)步驟5)操作2次。[0097]16)棄上清，干燥5~IOmin直至丙酮完全揮發(fā)。[0098]17)力卩入2mlPBS(成分:137mMNaCl，2.7mMKCl,IOmMNa2HPO4,1.8mMKH2PO4,pH7.2~7.4)，超聲波助溶30min。[0099]18)4°C,12000r/min離心lOmin,保留上清。[0100]19)重復(fù)步驟17)和18)，合并上清。[0101]20)4°C,12000r/min離心lOmin，取上清加入3kD超濾管，再加入IOmlPBS至超濾管中，4°C,4000r/min離心30~60min進(jìn)行濃縮,重復(fù)該步驟2~3次。[0102]21)吸取濃縮后的CWPs至離心管中保存于_20°C備用。[0103]實(shí)施例2:用SCffPs免疫來(lái)亨母雞[0104]用制備的黃曲霉SCWPs免疫來(lái)亨母雞(購(gòu)自華中農(nóng)業(yè)大學(xué)養(yǎng)雞場(chǎng))6次，采取肌肉注射免疫方法，每隔14天免疫一次。第一次取實(shí)施例1制備的SCWPs500uI(200ug)作為抗原與500uI弗氏完全佐劑混合后免疫,第二至第五次加強(qiáng)免疫:取500uI抗原與500uI弗氏不完全佐劑混合后免疫。第三次和第五次免疫I周后靜脈取血,將血清從1:200倍比稀釋，采用間接ELISA法檢測(cè)雞血清中抗體的效價(jià)(參照林巧愛(ài)、董海艷主編，《醫(yī)學(xué)免疫學(xué)與微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)》，浙江大學(xué)出版社，2006年)。結(jié)果表明免疫后的雞血清中黃曲霉特異抗體效價(jià)達(dá)到1:204，800。[0105]實(shí)施例3:提取雞脾臟總RNA、純化mRNA以及合成cDNA第一鏈[0106]I)最后一次免疫7天后取抗體效價(jià)最高的雞的脾臟，分離脾臟細(xì)胞。[0107]2)利用TRIzol總RNA提取試劑(購(gòu)自Invitrogen公司，按照說(shuō)明書操作)提取雞脾臟總RNA。[0108]3)用mRNA純化試劑盒(購(gòu)自QIAGEN公司，按說(shuō)明書操作)，從步驟2)提取的總RNA中純化mRNA。[0109]4)用SuperScript?III逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(購(gòu)自Invitrogen公司，按照說(shuō)明書操作)，以步驟3)得到的mRNA為模板，用引物oligo(dT)12_18(購(gòu)自Invitrogen公司的商業(yè)引物)合成cDNA第一鏈。[0110]實(shí)施例4:PCR擴(kuò)增重鏈可變區(qū)(Vn)、輕鏈可變區(qū)(VL)及單鏈抗體(ScFv)基因[0111]I)PCR擴(kuò)增Vi^PVl基因[0112]以實(shí)施例3得到的反轉(zhuǎn)錄合成的cDNA為模板，用正向引物CSCVHo-FL(GGTCAGTCCTCTAGATCTTCCGGCGGTGGTGGCAGCTCCGGTGGTGGCGGTTCCGCCGTGACGTTGGACGAG)和反向引物CSCG-B(CTGGCCGGCCTGGCCACTAGTGGAGGAGACGATGACTTCGGTCC)進(jìn)行PCR擴(kuò)增獲得VII片段；以實(shí)施例3反轉(zhuǎn)錄合成的cDNA為模板，用正向引物CSCVK(GTGGCCCAGGCGGCCCTGACTCAGCCGTCCTCGGTGTC)和反向引物CKJo-B(GGAAGATCTAGAGGACTGACCTAGGACGGTCAGG)進(jìn)行PCR擴(kuò)增獲得VI片段。在50illPCR反應(yīng)體系中，加入0.5illcDNA，5ill10XPCR緩沖液(含Mg2+)，IuIlOmMdNTPs,0.5uI正向引物CSCVHo-FL或CSCVK(100yM)，0.5yI反向引物CSCG-B或CKJo-B(IOOiiM)，2.5UTaq聚合酶。PCR反應(yīng)條件為:94°C5min；94°C15sec，56°C15sec,72°C45sec，30個(gè)循環(huán);最后72°CIOmin0PCR產(chǎn)物通過(guò)1%(W/V)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，其結(jié)果如圖2所示，V11和VL片段大小與預(yù)期相一致。[0113]2)用DNA凝膠回收試劑盒(購(gòu)自QIAGEN公司，按說(shuō)明書操作)從凝膠中回收步驟1)擴(kuò)增得到的VII和VL片段。[0114]3)SOE-PCR擴(kuò)增scFv基因[0115]以等量的V11和VL片段作為模板，用正向引物CSC-F(GAGGAGGAGGAGGAGGAGGTGGCCCAGGCGGCCCTGACTCAG)和反向引物CSC-B(GAGGAGGAGGAGGAGGAGGAGCTGGCCGGCCTGGCCACTAGTGGAGG)進(jìn)行SOE-PCR擴(kuò)增，獲得scFv基因。在50PCR反應(yīng)體系中，加入V11和\片段各50ng，5ii110XPCR緩沖液(含Mg2+)，liiIlOmMdNTPs,0.3uI正向引物CSC_F(100yM)，0.3ill反向引物CSC-B(100uM),2.5UTaq聚合酶。PCR反應(yīng)條件為:94V5min；94°C15sec,56°C15sec,72°C90sec，25個(gè)循環(huán)；最后72°CIOmin0PCR產(chǎn)物通過(guò)1%(W/V)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，其結(jié)果如圖3所示，所得scFv片段大小與預(yù)期相一致。[0116]4)用DNA凝膠回收試劑盒(購(gòu)自QIAGEN公司，按說(shuō)明書操作)從凝膠中回收步驟步驟3)獲得的scFv片段。[0117]實(shí)施例5:ScFv片段連接到pComb3X載體[0118]I)用SfiI限制性內(nèi)切酶(購(gòu)自NEB公司，按說(shuō)明書進(jìn)行操作)酶切實(shí)施例4得到的scFv片段和載體pComb3X(Andris-WidhopfJ,RaderC,etal.Methodsforthegenerationofchickenmonoclonalantibodyfragmentsbyphagedisplay.J.1mmunol.Methods,2000,242:159_181，如圖4所示)。[0119]2)用DNA凝膠回收試劑盒(購(gòu)自QIAGEN公司，按說(shuō)明書操作)從凝膠中回收步驟I)酶切過(guò)后的scFv片段和載體pComb3X。[0120]3)用T4DNA連接酶(購(gòu)自NEB公司，按說(shuō)明書操作)連接步驟2)回收的scFv片段和pComb3X載體,得到重組質(zhì)粒pComb3X_scFv。[0121]4)對(duì)步驟3得到的重組質(zhì)粒pComb3X_scFv進(jìn)行乙醇沉淀和除鹽(參照J(rèn).薩姆布魯克等[美]，《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》，科學(xué)出版社，2003年，第三版介紹的方法)。[0122]實(shí)施例6:單鏈抗體噬菌體展示文庫(kù)的構(gòu)建[0123]I)大腸桿菌XLl-BlueMRF’感受態(tài)細(xì)胞制備[0124]用無(wú)菌牙簽蘸取大腸桿菌甘油凍存菌株XLl-BlueMRF’(購(gòu)自Stratagene公司)，在LB固體培養(yǎng)基(成分:1%(W/V)胰蛋白胨，0.5%(W/V)酵母提取物，1%(W/V)NaCl，1.5%(W/V)瓊脂，pH7.0)上37°C劃線培養(yǎng)16h。挑取一單克隆菌落接種到15mlSB液體培養(yǎng)基(成分:3%(W/V)胰蛋白胨，2%(W/V)酵母提取物，1%(W/V)3-(N-嗎啡啉)丙磺酸(簡(jiǎn)稱M0PS，pH7.0)中，37°C，200r/min培養(yǎng)16h。將2.5ml大腸桿菌XLl-BlueMRF’菌液加入到500mlSB液體培養(yǎng)基中，并同時(shí)添加10ml20%(w/v)葡萄糖和5mllMMgCl2,于37°C搖床(200r/min)中培養(yǎng)至OD6tltol達(dá)到0.7左右時(shí)，迅速置于冰上冷卻15min。將菌液分裝于離心管中，4°C,4000r/min離心20min,棄上清，然后用500ml預(yù)冷的10%(V/V)甘油洗滌菌體沉淀兩次(4°C，4000r/min離心20min后棄上清)。向離心管中加入2.5ml預(yù)冷的10%(V/V)甘油并將菌體重懸，分裝至1.5ml離心管(100uI/管)，立即保存于-800C。[0125]2)重組質(zhì)粒電轉(zhuǎn)化至大腸桿菌[0126]將5管_80°C保存的大腸桿菌XLl-BlueMRF’感受態(tài)細(xì)胞取出，置冰上融化lOmin，每管感受態(tài)細(xì)胞(IOOiiI)中加入Iiig重組質(zhì)粒pComb3X-scFv,混勻后冰上靜置2min,然后將感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)移至冰上預(yù)冷的電轉(zhuǎn)化杯(0.2cm厚)(購(gòu)自BIO-RAD公司)中，用MicroPulser?電轉(zhuǎn)化儀(購(gòu)自BIO-RAD公司，使用BacteriaEc2程序)進(jìn)行電轉(zhuǎn)化，然后立即加入37C預(yù)熱的ImlSOC培養(yǎng)基(成分:2%(W/V)胰蛋白胨，0.5%(ff/V)酵母提取物，0.05%(ff/V)NaCl，20mM葡萄糖，pH7.0)到電轉(zhuǎn)化杯中重懸菌體，將所有電轉(zhuǎn)化杯中的菌液混合并轉(zhuǎn)移至離心管中并在37°C搖床(240r/min)中培養(yǎng)lh。培養(yǎng)Ih后,加入10ml37°C預(yù)熱的SB培養(yǎng)基、3iil羧芐青霉素(IOOmg/ml)和30四環(huán)素(5mg/ml)，從中取出2uI菌液加入到200uISB中，然后從中分別取10和100uI涂含有100yg/ml羧芐青霉素的LB平板37°C培養(yǎng)過(guò)夜后計(jì)數(shù)。將上述15ml菌液于37°C搖床(240r/min)中培養(yǎng)Ih后再加入4.5yI羧節(jié)青霉素(IOOmg/ml)繼續(xù)培養(yǎng)Ih,然后按照實(shí)施例8進(jìn)行單鏈抗體的篩選。[0127]實(shí)施例7:單鏈抗體噬菌體展示文庫(kù)的鑒定[0128]I)通過(guò)計(jì)數(shù)實(shí)施例6步驟2)中所培養(yǎng)LB平板上的大腸桿菌克隆，然后乘以稀釋倍數(shù)和菌液的體積計(jì)算得到的單鏈抗體噬菌體展示文庫(kù)庫(kù)容量約為1.2X107cfu。[0129]2)從實(shí)施例6步驟2)中所培養(yǎng)LB平板上隨機(jī)挑選25個(gè)大腸桿菌克隆，接種到IOOug/ml羧芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中于37°C搖床(200r/min)中培養(yǎng)過(guò)夜。[0130]3)煮沸裂解法提取過(guò)夜培養(yǎng)菌液的質(zhì)粒DNA(參照J(rèn).薩姆布魯克等[美]，《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》，科學(xué)出版社，2003年)。[0131]4)以步驟3)得到的質(zhì)粒DNA為模板，用正向引物ompseq(AAGACAGCTATCGCGATTGCAG)和反向引物gback(GCCCCCTTATTAGCGTTTGCCATC)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。在25illPCR反應(yīng)體系中，含有50ng質(zhì)粒DNA，2.5iilPCR緩沖液(含Mg2+)，2u11.25mMdNTPs,IiiI正向引物ompseq(IOuM)，I反向引物gback(IOuM)，1.25UTaq聚合酶。PCR反應(yīng)條件為:94°C5min;94°C15sec，56°C15sec，72°C90sec，30個(gè)循環(huán)；最后72°CIOmin0PCR產(chǎn)物通過(guò)I%(ff/V)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)單鏈抗體噬菌體展示文庫(kù)的陽(yáng)性率。[0132]5)用BstNI限制性內(nèi)切酶(購(gòu)自NEB公司，按說(shuō)明書操作)酶切步驟4)得到的PCR產(chǎn)物，將酶切產(chǎn)物進(jìn)行1.5%(ff/V)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)噬菌體展示文庫(kù)的多樣性。[0133]對(duì)文庫(kù)進(jìn)行的鑒定表明，所構(gòu)建的單鏈抗體噬菌體展示文庫(kù)陽(yáng)性率達(dá)到96%，多樣性高于50%，說(shuō)明所構(gòu)建的文庫(kù)質(zhì)量較高，可進(jìn)行篩選特異性的單鏈抗體。[0134]實(shí)施例8:篩選單鏈單鏈抗體噬菌`體展示文庫(kù)[0135]I)向?qū)嵤├?最后獲得的15ml菌液中加入10ml3.7X10ncfu/ml的VCSMl3輔助噬菌體(購(gòu)自Stratagene公司，輔助噬菌體的繁殖和保存參照J(rèn).薩姆布魯克等[美]，《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》，科學(xué)出版社，2003年，第三版中介紹的方法)。[0136]2)將25ml菌液轉(zhuǎn)移到裝有175ml預(yù)熱的500ml三角瓶中，并加入92.5illIOOmg/ml的羧芐青霉素和370u15mg/ml的四環(huán)素于37°C搖床(240r/min)中培養(yǎng)1.5~2h，然后加入280ill卡那霉素(50mg/ml)，37°C繼續(xù)培養(yǎng)過(guò)夜(12~15h)。[0137]3)用黃曲霉SCWPs(200iig/ml)包被ELISA板(共4孔，每孔100yl)，4°C放置過(guò)夜。[0138]4)將步驟2)中培養(yǎng)過(guò)夜的大腸桿菌菌液4°C，3000g離心15min，然后保留上清。[0139]5)向上清中加入50ml5XPEG/NaCl溶液(20%(ff/V)聚乙二醇(PEG)6000，2.5MNaCl)，充分混勻后分裝至50ml離心管，冰上放置30min~lh。[0140]6)4°C，15000g離心15min，將上清丟棄，然后將離心管倒立于吸水紙上lOmin，使管內(nèi)殘留的[0141]PEG/NaCl溶液全部流出。[0142]7)向離心管中加入2ml溶解在TBS(50mMTris-HCl,pH7.5，150mMNaCl)中的1%(w/v)BSA，將所有的噬菌體沉淀重懸，然后轉(zhuǎn)移到2ml離心管中，4°C，14000r/min離心5min后取上清于4°C保存并馬上取一部分進(jìn)行篩選。[0143]8)將步驟3)中包被好的ELISA板中的抗原溶液甩出，加入250UI溶于TBS中的3%(w/v)牛血清白蛋白(BSA)，37°C封閉lh。[0144]9)將封閉液甩出，每個(gè)孔中加入50iU步驟7)中收集的新鮮噬菌體，37°C溫浴2h。[0145]10)將噬菌體溶液甩出，每孔中加入250illTBST(0.05%Tween)，洗滌5次，每次Imin(第二輪和第三輪淘選時(shí)增加洗滌次數(shù)至10次和15次，Tween濃度增加至0.5%)。[0146]11)每孔加入IOOuIGlycine-HCl(100m,pH2.2)，室溫放置lOmin，用槍劇烈吹吸10次，然后吸出并加入3iilTris(2M)中和。[0147]12)將洗脫的噬菌體加入到2ml在SB中培養(yǎng)(37°C，200r/min)至OD6tltol約為0.5的XLl-BlueMRF，菌液中，室溫侵染15min。[0148]13)加入6ml37°C預(yù)熱的SB培養(yǎng)基、1.6iil羧芐青霉素(IOOmg/ml)和12yl四環(huán)素(5mg/ml)。[0149]14)從中取10ill用SB培養(yǎng)基稀釋至10_4，然后取100UI涂含有羧芐青霉素的LB平板37°C培養(yǎng)過(guò)夜，次日通過(guò)計(jì)數(shù)大腸桿菌克隆來(lái)計(jì)算淘選后的噬菌體滴度。[0150]15)將步驟13中的8ml菌液在37°C搖床(240r/min)中培養(yǎng)Ih。[0151]16)加入2.4iil羧芐青霉素(IOOmg/ml)再繼續(xù)培養(yǎng)lh。[0152]17)加入5mlVCSM13輔助卩遼菌體(購(gòu)自Stratagene公司)，將菌液轉(zhuǎn)移至87ml預(yù)熱的SB中，并添加46iiI羧節(jié)青霉素(IOOmg/ml)和184UI四環(huán)素(5mg/ml),于37°C搖床(240r/min)中培養(yǎng)1.5~2h。[0153]18)加入140UI卡那霉素(50mg/ml),240r/min，37°C培養(yǎng)過(guò)夜。[0154]19)按照步驟4~7的方法收集噬菌體，并進(jìn)行下一輪篩選。[0155]實(shí)施例9:表達(dá)ELISA鑒定淘選抗體庫(kù)[0156]I)最后一輪淘選完成后從實(shí)施例8步驟14)的LB平板上隨機(jī)挑選35個(gè)克隆，接種至3ml含有羧芐青霉素(50iig/ml)的SB培養(yǎng)基中，在37°C搖床(240r/min)中培養(yǎng)至OD6tltlnm約為0.5。[0157]2)加入終濃度為2mM的異丙基-P-D-硫代半乳糖苷(IPTG)，繼續(xù)培養(yǎng)20h。[0158]3)黃曲霉SCWPs按實(shí)施例8步驟3)包被到ELISA板上，空白對(duì)照用3%(w/v)BSA包被。[0159]4)將步驟3)中包被好的ELISA板中的抗原溶液甩出，加入250UI溶于磷酸鹽緩沖液(PBS)中的5%(w/v)脫脂奶粉，37°C封閉lh。[0160]5)將過(guò)夜培養(yǎng)的大腸桿菌菌液于4°C，2800g離心15min，保留上清。[0161]6)取50ill步驟5)中的上清與501115%(w/v)脫脂奶粉混勻后加入到封閉過(guò)后的ELISA板孔中，37°C溫浴2h。[0162]7)用300ii10.05%PBST洗滌3次，每次30sec。[0163]8)將鼠抗HA標(biāo)簽抗體(購(gòu)自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司)按體積比為1:4000稀釋到封閉液中，每孔加入100yl，37°C溫浴lh。[0164]9)用300ii10.05%PBST洗滌3次，每次30sec。[0165]10)將HRP標(biāo)記的羊抗鼠抗體(購(gòu)自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司)按體積比為1:4000稀釋到封閉液中，每孔加入l)0iU，37°C溫浴lh。[0166]11)用300U10.05%PBST和PBS各洗滌3次，每次30sec。[0167]12)每孔加入100UI可溶性單組份TMB底物(購(gòu)自北京天根生化科技有限公司)避光反應(yīng)15~30min。[0168]13)加入100UIH2SO4溶液(2M)終止反應(yīng)，用酶標(biāo)儀測(cè)OD45tlnm值。[0169]表達(dá)ELISA鑒定結(jié)果顯示，35個(gè)單克隆樣品中有10個(gè)顯色值高于1.8(圖5)，將這10個(gè)顯色值高的樣品送到上海立菲生物技術(shù)有限公司，將他們的重組質(zhì)粒中的插入序列進(jìn)行測(cè)序(測(cè)序引物同實(shí)施例7中的引物)。測(cè)序測(cè)序結(jié)果經(jīng)分析表明它們具有四種不同類型核苷酸序列，分別命名為AfSA4(其核苷酸序列如SEQIDNO:1所示，其氨基酸序列如SEQIDNO:2所示)、AfSA5、AfSA8和AfSDIO。含有這四種基因的大腸桿菌命名為重組大腸桿菌XLl-BlueMRF’/pComb3X_AfSA4、XLl-BlueMRF’/pComb3X_AfSA5、XLl-BlueMRF’/pComb3X-AfSA8、XLl-BlueMRF’/pComb3X_AfSD10將菌液加入等體積50%(V/V)甘油后保存于_80°C。[0170]實(shí)施例10:單鏈抗體的大量表達(dá)與純化[0171]I)用煮沸裂解法提取過(guò)實(shí)施例9中四種含有抗體基因的四種重組大腸桿菌中的重組質(zhì)粒DNA。[0172]2)通過(guò)熱激轉(zhuǎn)化至大腸桿菌T0P10感受態(tài)細(xì)胞中(熱激感受態(tài)細(xì)胞的制備和熱激轉(zhuǎn)化方法參照J(rèn).薩姆布魯克等[美]，《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》，科學(xué)出版社，2003年)。[0173]3)將含有四種重組質(zhì)粒的大腸桿菌T0P10克隆接種至5ml含有100iig/ml羧芐青霉素的SB培養(yǎng)基中，于37°C搖床中(200r/min)培養(yǎng)過(guò)夜(12h)。[0174]4)取2ml過(guò)夜培養(yǎng)菌液加入200ml含100yg/ml羧芐青霉素、20mMMgCl2的SB培養(yǎng)基中，于37°C搖床中(200r/min)培養(yǎng)至OD6tltlnm達(dá)到0.5左右。[0175]5)加入終濃度為ImM的IPTG，置于37°C搖床中(200r/min)培養(yǎng)過(guò)夜。[0176]6)將過(guò)夜培養(yǎng)的菌液4°C，5000r/min離心20min，棄上清。[0177]7)用重懸緩沖液(50mMNaH2P04，300mMNaCl,IOmM咪唑，ImMPMSFpH8.0)將菌體重懸。[0178]8)用高壓細(xì)胞破碎儀(購(gòu)自意大利GEA尼魯索爾維公司，按說(shuō)明書操作)將大腸桿菌細(xì)胞破碎。[0179]9)細(xì)胞裂解液4°C，15000r/min離心30min，上清保留。[0180]10)將400uI充分混勻的N1-NTA基質(zhì)(購(gòu)自QIAGEN公司)加入到純化柱(購(gòu)自BIO-RAD公司)使其沉降30min以上。[0181]11)剪去純化柱下端封口，加入5ml步驟7中的重懸緩沖液平衡純化柱。[0182]12)加入步驟9)得到的大腸桿菌細(xì)胞裂解液上清，收集樣品流穿液。[0183]13)加入50ml緩沖液B(50mMNaH2P04，300mMNaCl，20mM咪唑，pH8.0)洗脫純化柱I~2次，收集流穿液(含有雜蛋白)。[0184]14)加入400uI緩沖液C(50mMNaH2P04，3OOmMNaCI,25OmM咪唑，pH8.0)洗脫純化柱3次，分別收集洗脫液為Cl、C2、C3(含有目的蛋白)。[0185]15)加5ml去離子水平衡純化柱。[0186]16)加入lml30%(v/v)酒精并將純化柱保存在4°C。[0187]17)純化的單鏈抗體通過(guò)SDS-PAGE電泳檢測(cè)(見實(shí)施例11)后用PBS透析后加終濃度50%(v/v)甘油保存在_20°C。[0188]實(shí)施例11=SDS-PAGE電泳檢測(cè)純化的單鏈抗體[0189]I)取約Iiig實(shí)施例10純化的單鏈抗體，加入5倍濃縮的十二烷基硫酸鈉(SDS)上樣緩沖液(250mMTris-HCl(pH6.8),10%(ff/V)SDS(電泳級(jí))，0.5%(ff/V)溴酚藍(lán)，50%(V/V)甘油，5%(ff/V)(6-巰基乙醇)，混勻后煮沸5min，置于冰上備用。[0190]2)配制分離膠和濃縮膠(參照J(rèn).薩姆布魯克等[美]，《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》，科學(xué)出版社，2003年，第三版介紹的方法制備)。[0191]3)將IXTris-Glycine電泳緩沖液(25mMTris，250mM甘氨酸，0.1%(ff/V)SDS)加入到蛋白垂直電泳系統(tǒng)(購(gòu)自BIO-RAD公司)，將步驟I準(zhǔn)備的樣品加入到點(diǎn)樣孔中。[0192]4)用80伏低電壓電泳20min后，再用120伏高電壓電泳80~120min至溴酚藍(lán)電泳至分離膠底端。[0193]5)將凝膠取出并切掉濃縮膠，用染色液(0.1%(ff/V)考馬斯亮藍(lán)R-250，25%(V/V)異丙醇，10%(V/V)冰醋酸)染色lh。[0194]6)將凝膠置于脫色液(5%(V/V)甲醇，7.5%(V/V)冰醋酸)中脫色30min以上。[0195]SDS-PAGE電泳檢測(cè)結(jié)果如圖6所示，四種單鏈抗體分子量大小約為35kD。[0196]實(shí)施例12:利用ELISA方法檢測(cè)四種單鏈抗體對(duì)黃曲霉、寄生曲霉的親和力[0197]I)用黃曲霉和寄生曲霉的SCWPs(購(gòu)自北京，中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心，Img/ml)分別包被ELISA板孔(100UI/孔)，37°C溫浴包被2h或4°C包被過(guò)夜。[0198]2)每個(gè)ELISA板孔用300UIPBST洗滌3次，每次30sec。[0199]3)將300UI封閉液(含2%(W/V)脫脂奶粉的PBS溶液)加入到抗原包被孔和空白對(duì)照孔中，于37°C封閉2h。[0200]4)每孔用300UIPBST洗滌3次，每次30sec。[0201]5)分別加入100uI稀釋在封閉液中的四種單鏈抗體(200nM)，37°C溫浴2h。[0202]6)每孔用300uIPBST洗滌3次，每次30sec。[0203]7)每孔加入100UI稀釋(I:4000)在封閉液中的鼠抗HA標(biāo)簽抗體(購(gòu)自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司)，37°C溫浴2h。[0204]8)每孔用300UIPBST洗滌3次，每次30sec。[0205]9)每孔加入100UI稀釋(I:4000)在封閉液中的HRP標(biāo)記的羊抗鼠抗體(購(gòu)自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司)，37°C溫浴2h。[0206]10)每孔用300UIPBST和PBS分別洗滌3次，每次30sec。[0207]11)每孔加入100UI可溶性單組份TMB底物(購(gòu)自北京天根生化科技有限公司)避光反應(yīng)15~30min。[0208]12)加入100UIH2SO4溶液(2M)終止反應(yīng)，用酶標(biāo)儀測(cè)OD45tlnm值。[0209]ELISA結(jié)果顯示(圖7)，單鏈抗體AfSA4對(duì)黃曲霉和寄生曲霉SCWPs均具有很強(qiáng)的結(jié)合能力，且明顯高于另外三種單鏈抗體對(duì)兩種菌株的親和力，其差異達(dá)到了顯著水平(p〈0.05)。[0210]實(shí)施例13:免疫熒光檢測(cè)四種單鏈抗體對(duì)黃曲霉、寄生曲霉的結(jié)合特性[0211]I)按實(shí)施例1的步驟I)制備黃曲霉、寄生曲霉孢子。[0212]2)接種Iml孢子液(IO5/mi)于20mlYPG培養(yǎng)基(成分:0.3%(ff/V)酵母提取物，1%(ff/V)蛋白胨，2%(ff/V)葡萄糖)中，28°C，200r/min培養(yǎng)8h至大部分孢子萌發(fā)。[0213]3)蓋玻片浸泡于2MNa0H中2h，蒸餾水清洗后再浸泡于70%乙醇中2h。[0214]4)蓋玻片浸泡于多聚賴氨酸溶液中5min后取出晾干。[0215]5)向12孔細(xì)胞培養(yǎng)板孔中加入2ml2%(ff/V)小牛血清白蛋白(BSA，購(gòu)自Sigma公司)溶液，37°C封閉2h。[0216]6)每孔用2mlPBS洗滌3次。[0217]7)將步驟4中的蓋玻片置于細(xì)胞培養(yǎng)板孔中，加入Iml步驟2中的萌發(fā)的孢子液。[0218]8)將細(xì)胞培養(yǎng)板室溫離心(2800r/min)15min。[0219]9)用2mlPBS洗滌3次。[0220]10)加入500UI實(shí)施例10純化的四種單鏈抗體(封閉液中稀釋至IUg/ml)，37°C放置2h。[0221]11)用2mlPBST洗滌3次。[0222]12)加入500ii11:4000(v/v)封閉液中稀釋稀釋的鼠抗HA單克隆抗體，37°C放置2h。[0223]13)用2mlPBST洗滌3次。[0224]14)加入500U11:100(V/V)封閉液中稀釋的Cy3標(biāo)記羊抗鼠IgG(H+L)抗體(購(gòu)自美國(guó)ProteinTechGroup公司)，37°C避光放置lh。[0225]15)用2mlPBST和PBS分別洗滌3次。[0226]16)在載玻片上滴加封片劑，蓋上附著有菌絲和孢子的蓋玻片(有菌絲和孢子的一面貼在載玻片上)，在突光顯微鏡下觀察。[0227]免疫熒光實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖8所示，AfSA4抗體對(duì)黃曲霉和寄生曲霉孢子和菌絲的表面都有很強(qiáng)的熒光信號(hào)(圖a，b，e,f，i，j,m,n)，而陰性對(duì)照的非特異性單鏈抗體PIPP(KathuriaS,SriramanR,etal.Efficacyofplant-producedrecombinantantibodiesagainstHCG.Hum.Reprod.,2002,17:2054-2061.)與菌絲或抱子均未見任何突光反應(yīng)(圖c，d，g，h，k，l,o,p)，說(shuō)明AfSA4抗體能與黃曲霉和寄生曲霉孢子和菌絲細(xì)胞壁表面抗原特異結(jié)合。而4€345、4€348、々€3010與黃曲霉孢子和菌絲細(xì)胞壁表面未觀察到明顯的熒光信號(hào)(圖9)，說(shuō)明這3種單鏈抗體不能識(shí)別菌絲和孢子的細(xì)胞壁表面抗原。[0228]實(shí)施例14:AfSA4_AP融合蛋白表達(dá)載體構(gòu)建、原核表達(dá)和純化[0229]I)通過(guò)PCR擴(kuò)增在AfSA4抗體基因3’端加上218連接肽(WhitlowM，BellBA,etal.Animprovedlinkerforsingle-chainFVwithreducedaggregationandenhancedproteolyticstability.Protein.Eng.,1993,6:989-995.)以及兩端的SfiI和NotI酶切位點(diǎn)，然后通過(guò)這兩個(gè)酶切位點(diǎn)連接到pDAP2/S載體(KerschbaumerRJ,HirschlS，etal.Single-chainFVfusionproteinssuitableascoatinganddetectingreagentsinadoubleamibodysandwichEnzyme-linkedimmunosorbentassay.Anal.Biochem.，1997，249:219-227.)中，得到含有AfSA4_AP融合蛋白基因的重組質(zhì)粒，將其電轉(zhuǎn)化到E.coliXLl-BlueMRF’感受態(tài)細(xì)胞(方法見實(shí)施例6步驟2)中，挑選有氨芐青霉素抗性的克隆送上海立菲生物技術(shù)有限公司測(cè)序，得到含有正確重組質(zhì)粒DNA的重組大腸桿菌。[0230]2)AfSA4-AP融合蛋白的表達(dá)和純化按實(shí)施例10的方法操作，但步驟5誘導(dǎo)表達(dá)溫度為28°C。[0231]純化后的AfSA4_AP融合蛋白經(jīng)SDS-PAGE電泳檢測(cè)表明(圖10)，融合蛋白分子量約為80kD。[0232]實(shí)施例15:AfSA4-AP融合蛋白活性檢測(cè)[0233]I)將100ill黃曲霉菌或寄生曲霉菌SCWPs(IOiig/ml)加入ELISA板孔中，37°C溫浴2h或4°C放置過(guò)夜，進(jìn)行抗原包被。[0234]2)每個(gè)ELISA板孔用300UIPBST洗滌3次，每次30sec。[0235]3)將300UI封閉液(含2%(W/V)脫脂奶粉的PBS溶液)加入到抗原包被孔和空白對(duì)照孔中，于37°C封閉2h。[0236]4)每孔用300UIPBST洗滌3次，每次30sec[0237]5)每孔加入100UI稀釋在封閉液中的AfSA4_AP抗體(200nM)，37C溫浴2h。[0238]6)每孔用300UIPBST和PBS分別洗滌3次，每次30sec。[0239]7)每孔加入100UI顯色液(0.2%(ff/V)對(duì)硝基苯磷酸二鈉(pNPP)溶液)，避光反應(yīng)15~30min，用酶標(biāo)儀測(cè)定OD4tl5nm值。[0240]根據(jù)ELISA結(jié)果顯示，AfSA4_AP抗體對(duì)黃曲霉菌和寄生曲霉菌SCWPs具有高親和力，酶標(biāo)儀測(cè)定的OD4tl5nm平均值為2.842(黃曲霉)和2.794(寄生曲霉)，分別比陰性對(duì)照高出49.0倍和50.8倍。[0241]實(shí)施例16=ELISA分析AfSA4抗體和AfSA4-AP融合蛋白的結(jié)合特性[0242]I)選取6種曲霉屬菌株和其它9種非曲霉屬真菌菌株(見表1)，按實(shí)施例1的方法I培養(yǎng)孢子和菌絲。[0243]2)將孢子液或菌絲塊接種于20mlYPG培養(yǎng)基(0.3%酵母粉，I%蛋白胨，2%葡萄糖)中，28°C，200r/min培養(yǎng)5天。[0244]3)按實(shí)施例1中步驟3)的方法將菌絲過(guò)濾收集并在液氮中研磨并重懸于PBS中。[0245]3)在ELISA板孔中加入100UI菌絲懸浮液(lmg/ml)，37°C溫浴包被2h或4°C包被過(guò)夜。[0246]4)分別用AfSA4抗體和AfSA4_AP融合蛋白進(jìn)行ELISA檢測(cè)。[0247]①當(dāng)用AfSA4抗體檢測(cè)時(shí):[0248]a)每個(gè)ELISA板孔用300UIPBST洗滌3次，每次30sec。[0249]b)將300UI封閉液(含2%(W/V)脫脂奶粉的PBS溶液)加入到抗原包被孔和空白對(duì)照孔中，于37°C封閉2h。[0250]c)每孔用300UIPBST洗滌3次，每次30sec。[0251]d)每孔加入100uI稀釋在封閉液中的AfSA4抗體(200nM)，37°C溫浴2h。[0252]e)每孔用300UIPBST洗滌3次，每次30sec。[0253]f)每孔加入100UI稀釋在封閉液中的鼠抗HA標(biāo)簽抗體(體積比為1:10，000)，37°C溫浴2h。[0254]g)每孔用300UIPBST洗滌3次，每次30sec。[0255]h)每孔加入100ill稀釋在封閉液中的AP標(biāo)記羊抗鼠IgG抗體(體積比為1:10，000)，371:溫浴211。[0256]i)每孔用300UIPBST和PBS分別洗滌3次，每次30sec。[0257]j)每孔加入100UI顯色液(0.2%(ff/V)對(duì)硝基苯磷酸二鈉(pNPP)溶液)，避光反應(yīng)15~30min，用酶標(biāo)儀測(cè)定OD4tl5nm值。[0258]②AfSA4_AP融合蛋白檢測(cè):按實(shí)施例15步驟2~7)的方法操作。[0259]ELISA結(jié)果表明(見表1)AfSA4抗體和AfSA4_AP融合蛋白對(duì)黃曲霉和寄生曲霉都具有很高的親和力，而與非曲霉屬的真菌無(wú)交叉反應(yīng)，說(shuō)明AfSA4-AP融合蛋白具有AfSA4抗體對(duì)抗原的親和力和特異性。[0260]表1ELISA檢測(cè)分析AfSA4抗體和AfSA4-AP融合蛋白的抗原結(jié)合特性[0261]【權(quán)利要求】1.一種黃曲霉特異單鏈抗體基因AfSA4，其核苷酸序列如序列表SEQIDNO:1所示。2.權(quán)利要求1所述的一種黃曲霉特異單鏈抗體基因AfSA4，其特征在于:該基因的輕鏈可變區(qū)'由312個(gè)核苷酸編碼，其核苷酸序列如SEQIDNO:3所示；重鏈可變區(qū)VII由390個(gè)核苷酸編碼，其核苷酸序列如SEQIDNO:5所示。3.一種黃曲霉特異單鏈抗體AfSA4蛋白，其特征在于:該蛋白由252個(gè)氨基酸組成，其編碼核苷酸序列如SEQIDNO:2所示。4.權(quán)利要求3所述的一種黃曲霉特異單鏈抗體AfSA4蛋白，其特征在于:其輕鏈可變區(qū)Vl由104個(gè)氨基酸組成，其編碼核苷酸序列如SEQIDNO:4所示；重鏈可變區(qū)VII由130個(gè)氨基酸組成，其編碼核苷酸序列如SEQIDNO:6所示。5.一種黃曲霉特異單鏈抗體與堿性磷酸酶融合的重組基因AfSA4-AP，其核苷酸序列如SEQIDNO:7所示。6.一種黃曲霉特異單鏈抗體與堿性磷酸酶融合的重組蛋白AfSA4-AP，其編碼核苷酸序列如SEQIDNO:8所示。7.一株分泌抗黃曲霉單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株2A8，保藏在中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)，保藏號(hào)為:CCTCCNO:C2013101o8.權(quán)利要求7所述的雜交瘤細(xì)胞株2A8在制備單克隆抗體中的應(yīng)用。9.權(quán)利要求6所述的重組蛋白AfSA4-AP在檢測(cè)黃曲霉和寄生曲霉中的應(yīng)用。10.權(quán)利要求8所述的雜交`瘤細(xì)胞株2A8在檢測(cè)黃曲霉和寄生曲霉中的應(yīng)用?！疚臋n編號(hào)】G01N33/68GK103555732SQ201310477107【公開日】2014年2月5日申請(qǐng)日期:2013年10月13日優(yōu)先權(quán)日:2013年10月13日【發(fā)明者】廖玉才,薛升,李和平申請(qǐng)人:華中農(nóng)業(yè)大學(xué)