一種分離、純化紫杉醇與三尖杉寧堿的制備方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種分離、純化紫杉醇與三尖杉寧堿的制備方法。本發(fā)明采用高效液相制備色譜法，色譜條件為：聚苯乙烯-二乙烯基苯共聚物色譜柱：MKF-EP-RP，5～12μm，(150～600)×(7.0～20.0)mm(I.D.)，流動相組成為：乙腈∶水＝45～60∶55～40(體積比)，流速為：1.0～3mL／min，檢測波長：229nm；進(jìn)樣量：20～100μL；本發(fā)明克服了硅膠等介質(zhì)的不可逆吸附以及工藝流程復(fù)雜的缺點(diǎn)，經(jīng)一步分離即可得到98％以上的紫杉醇純品。
【專利說明】一種分離、純化紫杉醇與三尖杉寧堿的制備方法
(—)

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種高效液相制備色譜(HPLC)分離方法，具體涉及一種以聚苯乙烯凝膠色譜介質(zhì)為載體的分離、純化紫杉醇與三尖杉寧堿的制備方法。
(二)

【背景技術(shù)】
[0002]紫杉醇是從紅豆杉屬植物中分離得到的并且具有廣譜抗癌活性的二萜類化合物。它具有獨(dú)特的抗癌機(jī)制，對治療卵巢癌、黑色素瘤、肺癌、乳腺癌等多種癌癥均有良好的療效。近年來，它已成為天然植物藥物領(lǐng)域中最熱門的新藥，需求量與日俱增。由于紫杉醇主要來源于紅豆杉的樹皮，資源匱乏、含量低微，且臨床應(yīng)用中對紫杉醇的純度要求較高，因此分離提取得到高純度的紫杉醇將是一個浩大而復(fù)雜的工程。在對紫杉醇進(jìn)行分離純化時常會碰到的一個問題就是紫杉醇與三尖杉寧堿的分離。由于這兩種物質(zhì)的結(jié)構(gòu)非常相似，只有C-13側(cè)鏈末端結(jié)構(gòu)不同，因而兩者的色譜行為差別很小，用常規(guī)的柱色譜和薄層色譜很難將這二者分開。
[0003]針對紫杉醇與三尖杉寧堿類紫杉烷類化合物的分析分離，國內(nèi)外已做了大量研究，并取得了一定的效果，但大多數(shù)都采用的是以硅膠基質(zhì)為色譜柱的高效液相色譜法(HPLC)[參見:田桂蓮，張志強(qiáng)，蘇志國.苯基-硅膠色譜介質(zhì)的合成及其在紫杉醇提純中的應(yīng)用.色譜.2001，19(1):47-50]。雖然該色譜柱經(jīng)過兩步修飾即胺基功能化及苯環(huán)衍生化，但仍需經(jīng)多步分離也僅得到純度不到80%的紫杉醇純品。隨著色譜介質(zhì)的發(fā)展，大孔樹脂[李勇超，楊靖，職明星，等.D4020大孔樹脂提純發(fā)酵液中的紫杉醇的研究[J].食品與生物技術(shù)學(xué)報.2009，29 (5) =710-714]成為了焦點(diǎn)，它是一種有機(jī)高分子聚合物吸附劑，且在天然產(chǎn)物的分離純化方面有著廣泛的應(yīng)用。李勇超等人使用該樹脂提純發(fā)酵液中紫杉醇，回收率可達(dá)到87%，說明該樹脂能較好的吸附-解吸附紫杉醇，但該工藝過程中使用不同濃度的甲醇和乙醇水溶液分別對樹脂進(jìn)行吸附和解吸附處理，且僅說明了該方法對去除色素類雜質(zhì)有明顯效果，未具體指出紫杉醇與其類似的紫杉烷類化合物的分離及純度。中國專利CN1054382C(申請?zhí)?6102442.9)公開了一種以大孔樹脂分離紫杉醇的方法，即先將紫杉烷類化合物富集在固體吸附劑上，再使用有機(jī)溶劑的水溶液進(jìn)行洗脫，分步收集餾分，濃縮后再次進(jìn)行柱分離。該方法工藝過程繁瑣，且分離條件未進(jìn)行優(yōu)化。為此尋找一種操作簡單且分離條件完善的提取紫杉醇的方法，對于紫杉醇的制備及工業(yè)生產(chǎn)具有深遠(yuǎn)的意義。
[0004]因此，本發(fā)明采用均勻、耐壓和耐酸堿的聚苯乙烯一二乙烯基苯高分子微球?yàn)樘盍?，?yōu)化流動相種類和比例，可經(jīng)一步色譜法使紫杉醇與三尖杉寧堿達(dá)到分離，操作方法簡便、聞效。
(三)


【發(fā)明內(nèi)容】

本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術(shù)的工藝復(fù)雜等缺點(diǎn)，介紹了一種簡單的分離、純化紫杉醇與三尖杉寧堿的制備方法。 本發(fā)明的技術(shù)方案如下，即一種分離、純化紫杉醇與三尖杉寧堿的制備方法，其特點(diǎn)在于采用一種均勻、耐壓、多孔型聚苯乙烯-二乙烯基苯共聚物為固定相的高聚物制備色譜柱，高效液相制備色譜操作條件為:
a.聚苯乙烯凝膠色譜柱=MKF-EP-RP,5?12 μ m，柱長:150?600，柱徑7.0?20mm(1.D.)；
b.流動相:乙腈/水=40?75/60?25(體積比);乙醇/水=50?75/50?25 ；
c.流速:1.0?3.0mL/min，進(jìn)樣量:10?200 μ L，柱溫:室溫；
d.采用UV檢測器，檢測波長為229nm。
與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有的優(yōu)點(diǎn)和效果如下:
1、整個分析周期短，色譜分離全過程僅約40min。
2、經(jīng)一步分離即可得到99.1 %純度的紫杉醇，且操作方法簡單。
3、本發(fā)明同樣能在常規(guī)高效液相色譜儀上進(jìn)行操作，不限于昂貴的中、低壓制備色譜，因此對儀器的要求低，方法普及性好。
4、在AKTAexplorerlOO制備型色譜儀器上放大制備紫杉醇，可得到98%以上純度的紫杉醇，方法穩(wěn)定性好。
(四)【專利附圖】

【附圖說明】:
圖1為本發(fā)明的舉例方法效果圖之一，即具體條件:紫杉醇與三尖杉寧堿在聚苯乙烯凝膠色譜柱=MKF-EP-RP型制備色譜柱(8 μ m, 300 X 7.8m (1.D.))中的HPLC圖，流動相:乙腈/水=60:40(體積比);流速:lmL/min ;進(jìn)樣物質(zhì)分別為供試品_1,_3和4,圖1中1、2分別代表三尖杉寧堿和紫杉醇。圖1為本發(fā)明的舉例方法效果圖之一，其它舉例方法圖不
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圖1液相色譜圖
(五)

【具體實(shí)施方式】
實(shí)驗(yàn)器材及試劑:
(1)實(shí)驗(yàn)儀器:
戴安Summit型高效液相色譜系統(tǒng)(美國戴安公司)；AB SCIEXAPI2000LC-MS/MS液質(zhì)儀；AKTA explorerlOO制備型色譜系統(tǒng)(通用電器醫(yī)療集團(tuán))；
(2)色譜柱:
MKF-EP-RP 型制備柱:300mmX7.8mm(1.d.)，8ym，兩只；200mmX8.0mm(1.d.)，8 μ m ;150mmX20mm(i.d.), 10 μ m ;300mmX7.8mm(1.d.), 12 μ m,兩只；300mmX7.8mm(1.d.), 10 μ m ；MKF-DK-RP 制備柱:150mmX 10mm (i.d.), 12 μ m ；300mmX 10mm (i.d.)，12 μ m ;150mmX 20mm(1.d.), 8 μ m ;300mmX 20mm(1.d.), 12 μ m ;150mmX20mm(i.d.), 12 μ m。(南京麥科菲高效分離載體有限公司)
(3)實(shí)驗(yàn)試劑:
紫杉醇標(biāo)樣(純度為93.6% );三尖杉寧堿標(biāo)樣(純度82.9% );發(fā)酵液(紫杉醇含量為33.9% ;三尖杉寧堿含量為33.3% );色譜純乙醇；色譜純乙腈；高效液相去離子水。供試品的配制: 供試品-1:取發(fā)酵液0.5ml至20ml的容量瓶中，用甲醇定容至20ml，待測(現(xiàn)用現(xiàn)配)
供試品-2:取紫杉醇標(biāo)準(zhǔn)品約10mg，精密稱定，用甲醇溶劑定容至10ml，待測(現(xiàn)用現(xiàn)配)
供試品-3:取三尖杉寧堿標(biāo)準(zhǔn)品約10mg，精密稱定，用甲醇溶劑定容至10ml，待測(現(xiàn)用現(xiàn)配)
供試品-4:取發(fā)酵液Iml至20ml的容量瓶中，用甲醇定容至20ml，待測(現(xiàn)用現(xiàn)配)
實(shí)施例1
色譜條件:檢測機(jī)器:戴安Summit型高效液相色譜系統(tǒng)；
色譜柱:MKF-EP-RP(300mmX7.8mm，8ym);流動相:乙腈(B)/水(A) = 75:25(體積比，以下同上);流速:lmL/min ;檢測波長:229nm ;進(jìn)樣量:20 μ L ;進(jìn)樣物質(zhì):供試品_1，測得紫杉醇與三尖杉寧堿的分離度R為0.84。
實(shí)施例2
色譜條件:檢測機(jī)器:戴安Summit型高效液相色譜系統(tǒng)；
色譜柱:MKF-EP_RP(200mmX8.0mm,8 μ m);流動相:乙腈(B)/水(A) = 60:40(體積比，以下同上);流速:lmL/min ;檢測波長:229nm ;進(jìn)樣量:20 μ L ;進(jìn)樣物質(zhì):供試品_2，測得紫杉醇與三尖杉寧堿的分離度R為1.04。
實(shí)施例3
色譜條件:檢測機(jī)器:戴安Summit型高效液相色譜系統(tǒng)；
色譜柱=MKF-EP-RP (600mm X 7.8mm, 12 μ m)；流動相:乙腈(B) / 水(A) = 50:50 (體積比，以下同上)；流速:1.5mL/min ;檢測波長:229nm ;進(jìn)樣量:20 μ L ;進(jìn)樣物質(zhì):供試品-3，測得紫杉醇與三尖杉寧堿的分離度R為1.27。
實(shí)施例4
色譜條件:檢測機(jī)器:戴安Summit型高效液相色譜系統(tǒng)；
色譜柱:MKF-EP-RP (300mmX 7.8mm, 10 μ m);流動相:乙腈(B)/ 水(A) = 40:60 ;流速:1.5mL/min ;檢測波長:254nm ;進(jìn)樣量:10μ L ;進(jìn)樣物質(zhì):供試品_1，測得紫杉醇與三尖杉寧堿的分離度R為1.52。
實(shí)施例5
色譜條件:檢測機(jī)器:戴安Summit型高效液相色譜系統(tǒng)；
色譜柱=MKF-EP-RP (600mmX 7.8mm, 8 μ m);流動相:乙醇(B)/ 水(A) = 75:25 ;流速:1.0mL/min ;檢測波長:254nm ;進(jìn)樣量:10μ L ;進(jìn)樣物質(zhì):供試品_1，測得紫杉醇與三尖杉寧堿的分離度R為0.92。
實(shí)施例6
色譜條件:檢測機(jī)器:戴安Summit型高效液相色譜系統(tǒng)；
色譜柱:MKF-EP-RP(300mmX7.8mm，8ym);流動相:乙醇(B)/水(A) = 55:45 ;流速:1.0mL/min ;檢測波長:254nm ;進(jìn)樣量:10μ L ;進(jìn)樣物質(zhì):供試品_1，測得紫杉醇與三尖杉寧堿的分離度R為1.36。
實(shí)施例7
色譜條件:檢測機(jī)器:AKTA explorerlOO制備型色譜系統(tǒng)；
色譜柱:MKF-DK-RP (150mmX 20mm, 8 μ m);流動相:乙腈(B)/ 水(A) = 60:40 ;流速:lmL/min ;檢測波長:229nm ;進(jìn)樣量:10y L ;進(jìn)樣物質(zhì):供試品_4，測得紫杉醇與三尖杉寧堿的分離度R為1.45。
實(shí)施例8
色譜條件:檢測機(jī)器:AKTA explorerlOO制備型色譜系統(tǒng)；
色譜柱:MKF-DK-RP (450mmX 10mm, 12 μ m);流動相:乙腈(B)/ 水(A) = 65:35 ;流速:2mL/min ;檢測波長:229nm ;進(jìn)樣量:100μ L ;進(jìn)樣物質(zhì):供試品_4，測得紫杉醇與三尖杉寧堿的分離度R為1.17。
實(shí)施例9
色譜條件:檢測機(jī)器:AKTA explorerlOO制備型色譜系統(tǒng)；
色譜柱:MKF-DK-RP (450mmX 20mm, 12 μ m);流動相:乙腈(B)/ 水(A) = 60:40 ;流速:3mL/min ;檢測波長:254nm ;進(jìn)樣量:200 μ L ;進(jìn)樣物質(zhì):供試品_4，測得紫杉醇與三尖杉寧堿的分離度R為1.32。
【權(quán)利要求】
1.一種分離、純化紫杉醇與三尖杉寧堿的制備方法，其特征在于使用高效液相制備色譜，高效液相制備色譜條件為: ￡1.高聚物色譜柱的選用:聚苯乙烯-二乙烯基苯共聚物，粒徑:5?129111，柱長:150?600臟，柱內(nèi)徑7.0?20麵； 匕流動相:乙腈/水的體積比為40?75 / 60?25 ；或乙醇/水的體積比為55?75 / 45 ?25 ； 0.流速:1.0?3.011^ /砧!!，進(jìn)樣量:10?200 9匕柱溫:室溫； (1.采用—檢測器，檢測波長為225咖?254111
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種分離、純化紫杉醇與三尖杉寧堿的制備方法，其特征在于所述的高聚物色譜柱為型聚苯乙烯-二乙烯基苯共聚物色譜固定相充填。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種分離、純化紫杉醇與三尖杉寧堿的制備方法，其特征在于該方法使用流動相為:乙醇丨水，其體積比為:55?75 / 45?25或乙腈丨水，其體積比為:40?75 / 60?25，可以用等度洗脫，也可以用梯度洗脫方式。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種分離、純化紫杉醇與三尖杉寧堿的制備方法，其特征在于該高聚物色譜柱的選用:柱長:150?300臟，柱內(nèi)徑9.0?20.0臟；或200-600臟，柱內(nèi)徑7.0?9.0臟。
【文檔編號】G01N30/88GK104422749SQ201310395925
【公開日】2015年3月18日 申請日期:2013年9月4日 優(yōu)先權(quán)日:2013年9月4日
【發(fā)明者】劉曉寧, 黃艷, 魏榮卿 申請人:南京工業(yè)大學(xué)