專利名稱：一種高效液相色譜法測定丙戊酸體液濃度過程中的衍生化方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種高效液相色譜法測定丙戊酸體液濃度過程中的衍生化方法。
背景技術：
丙戊酸是一種最常用的廣譜抗癲癇藥，其治療濃度范圍窄，個體差異大，治療過程中須監(jiān)測血藥濃度，通過個體化用藥，提高癲癇病控制率、減少不良反應。監(jiān)測丙戊酸血藥濃 度常常使用HPLC法(高效液相色譜法)，而用HPLC法常需把丙戊酸衍生化成具有紫外吸收或能發(fā)熒光的酯類。常用的衍生化方法是使用三乙胺作催化劑，催化丙戊酸與0-溴苯乙酮、2，4' - 二溴苯乙酮、2-溴-對硝基苯乙酮或4-溴-7-甲氧基香豆素等進行衍生化反應，為了提高衍生化效率，常常需要加入過量的衍生化劑，但長期使用過量的衍生化劑(> 400 yg)易使色譜柱壓力過大，柱效下降，縮短色譜柱壽命。例如下述2篇文獻均是采用三乙胺作催化劑，催化丙戊酸與衍生劑進行衍生化反應。1、馮惠平，王璟，陳宜峰等的“柱前衍生-高效液相色譜法測定人血清中丙戊酸鈉濃度”。色譜條件:AgilentHC-C18 色譜柱(5 μ m, 4.6X 250mm),流動相:甲醇-水(73:27);流速:lmL/min，柱溫:40°C ;紫外檢測波長:262nm ;進樣量為20 μ L0樣品處理方法:精密量取血清樣品0.lmL，置具塞試管中，加入環(huán)己烷羧酸內(nèi)標液50 μ L (200 μ g/mL)，1.0mol/L的硫酸100 μ L，渦旋振蕩30s，加正戊烷2mL,渦旋振蕩3min，離心5min (5500r/min),精密吸取上層有機相1.0mL,加ω-溴苯乙酮10 μ L (10.3mg/mL),加三乙胺10 μ L，渦旋振蕩30s，置50°C _55°C水浴中衍生化反應lOmin，并揮干有機相，殘渣中加入甲醇200 μ L,潤旋振蕩30s,離心3min (5500r/min),取20 μ L進樣。結(jié)果:在10.1 182.2 μ g/mL范圍內(nèi)，丙戊酸和內(nèi)標環(huán)己烷羧酸衍生物的峰面積比與濃度呈良好的線性關系(r=0.9997)，平均回收率98.4-99.8%，日內(nèi)和日間RSD彡5.9%。最低定量濃度為10.1 μ g/mL。不足:當血清丙戊酸濃度為182.2 μ g/mL時，1.0mL上層有機相中含丙戊酸
0.063 μ mol,內(nèi)標環(huán)己燒羧酸0.039 μ mol,加入的衍生化劑ω -溴苯乙酮0.52 μ mol,即衍生化劑與反應物的摩爾數(shù)比為5.1倍，反應不完全，方法靈敏度低，重復性不好。2> Zhuo-jia Chen, Xue-ding Wang, Hong-sheng Wang 等的“Simultaneousdetermination of valproic acid and2-propyl_4-pentenoic acid for the predictionof clinical adverse effects in Chinese patients with epilepsy，，(同時測定中國療癇病人的丙戊酸和2-丙基-4-戊烯酸血清濃度，預測丙戊酸的副作用)。色譜條件:C18色譜柱(5 μ m，4.6 X 150mm)，流動相:甲醇-水(76:24)，流速=ImL/min ;紫外檢測波長:254nm ;進樣量為20 μ L。樣品處理方法:取質(zhì)控血清和病人血清各140 μ L分置于IOmL具塞離心試管內(nèi)，加乙腈100 μ L，1.0mol/L的硫酸100 μ L和lmg/mL.內(nèi)標(辛酸)溶液20 μ L混勻后，加1.5mL乙酸乙酯混旋5min、離心(4000r/min) lOmin。吸取上述上層有機相于IOmL具塞離心試管內(nèi)，加三乙胺IOyL,混勻后加12mg/mL衍生試劑2，f -二溴苯乙酮50 μ L (600μ g,6.5倍)，密塞后置70°C水浴上保溫40min，去塞后氮氣吹干，100 μ L流動相溶解殘余物，IOyL進樣分析。結(jié)果:在5 - 200 μ g/mL范圍內(nèi)，丙戊酸衍生物和內(nèi)標的峰面積比與濃度呈良好的線性關系，r=0.9998，平均回收率101.3-104.5%，日內(nèi)和日間RSD ( 5.1%。其最低檢測濃度為 5.0 μ g.mL、不足:當血清丙戊酸濃度為200 μ g/mL時，上層有機相中含丙戊酸0.19 μ mol，內(nèi)標辛酸0.14 μ mol，加入的衍生化劑2，^ -二溴苯乙酮2.16 μ mol，劑衍生化劑與反應物的摩爾數(shù)比為6.5倍，反應不完全，方法靈敏度低，重復性不好。衍生化劑2，4' - 二溴苯乙酮用量過大(> 400 μ g)，降低了方法學的檢測靈敏度，長期重復使用，易使色譜柱壓力過大，可使柱效下降，縮短色譜柱壽命。綜上所述，三乙胺催化丙戊酸衍生反應的效率不高，通常需要反應物摩爾倍數(shù)9-11倍以上的衍生劑才能把丙戊酸完全衍生化。但過量的衍生劑容易造成HPLC分析基線不平，降低了方法學的靈敏度；長期重復使用過量的衍生化劑(> 400 yg)易使色譜柱壓力過大，柱效下降，縮短色譜柱壽命。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術問題是:提供一種選用氫氧化季銨鹽乙腈溶液作為催化劑的衍生化方法，用于衍生化-HPLC法測定丙戊酸體液濃度，該方法只需要反應物摩爾倍數(shù)3-5倍的衍生劑就能把丙戊酸完全衍生化，從而提高HPLC法測定丙戊酸血藥濃度的靈敏度、準確度、精密度和重現(xiàn)性，干擾 少，可延長色譜柱使用壽命。解決上述技術問題的技術方案是:一種高效液相色譜法測定丙戊酸體液濃度過程中的衍生化方法，包括以下步驟:精密取50-100 μ L質(zhì)控或病人血清，加入0.1-0.2 μ g/μ L內(nèi)標溶液40-80 μ L，再加入2-3mol/L硫酸溶液50-70 μ L，混勻，加入2_4mL乙醚渦旋提取l-3min,在3000-4000r/min條件下離心分離5_10min,吸取上清液,加入10mmol/L催化劑氫氧化季銨鹽乙腈溶液30-110 μ L，渦旋混勻，再加入反應物摩爾倍數(shù)3-7倍的衍生劑，根據(jù)需要加入適量的乙腈，使反應溶液中乙腈的總體積達到140-160μ L，渦旋混勻，在50-60°C水浴反應20-40分鐘，提高水浴溫度至65-70°C揮干有機相，衍生化反應結(jié)束。所述的催化劑氫氧化季銨鹽乙腈溶液為四甲基氫氧化銨乙腈溶液或四丁基氫氧化銨乙腈溶液或四乙基氫氧化銨乙腈溶液；所述的內(nèi)標溶液為壬酸溶液、環(huán)己基丙酸溶液、辛酸溶液或癸酸溶液；所述的衍生劑為2，4' - 二溴苯乙酮乙腈溶液、α -溴苯乙酮乙腈溶液、2-溴-對硝基苯乙酮乙腈溶液或4-溴-7-甲氧基香豆素乙腈溶液。本發(fā)明的進一步技術方案是:所述的催化劑為四甲基氫氧化銨乙腈溶液，其加入量為lOmmol/L四甲基氫氧化銨乙腈溶液90-110 μ L。本發(fā)明的另一進一步技術方案是:所述的催化劑為四丁基氫氧化銨乙腈溶液，其加入量為lOmmol/L四丁基氫氧化銨乙腈溶液30-60 μ L。所述的反應物是指血清中的高濃度丙戊酸和內(nèi)標溶液中的內(nèi)標物，所述的高濃度的丙戊酸是指濃度為120-200 μ g/mL的丙戊酸。本發(fā)明的更進一步技術方案是:所述的加入的衍生劑與反應物的摩爾比為5倍。所述的質(zhì)控或病人血清中丙戊酸濃度為1-200 μ g/mL。本發(fā)明用氫氧化季銨鹽乙腈溶液代替三乙胺催化丙戊酸與衍生劑(如2-溴苯乙酮或2，4- 二溴苯乙酮等)衍生化成為可紫外檢測的苯酯，只需要反應物摩爾倍數(shù)3-5倍量的衍生劑，即可達到97%以上的衍生化產(chǎn)率。具有的優(yōu)點為:衍生化反應完全(97%以上)，色譜圖基線平穩(wěn)，無內(nèi)源性雜質(zhì)干擾，測定結(jié)果準確，精密度好，靈敏度高，衍生化劑2，4' - 二溴苯乙酮、α -溴苯乙酮等用量少，不易使色譜柱壓力增大，有利于延長色譜柱使用壽命。下面，結(jié)合附圖和實施例對本發(fā)明之一種高效液相色譜法測定丙戊酸體液濃度過程中的衍生化方法的技術特征作進一步的說明。


圖1:空白血清色譜圖(四甲基氫氧化銨催化)。圖2:空白血清色譜圖(三乙胺催化)。圖3:標準品血清色譜圖(四甲基氫氧化銨催化，標準品血清中丙戊酸濃度120 μ g/mL)ο圖4:標準品血清色譜圖(三乙胺催化，標準品血清中丙戊酸濃度120 μ g/mL)。圖5:病人血清色譜圖(三乙胺催化)。圖6:病人血清色譜圖(四甲基氫氧化銨催化)。圖中:丙戊酸t(yī)E 為 8.9-9.0min,內(nèi)標 tE 為 9.9-10.0min0
具體實施例方式儀器:島津LC-20AT四元梯度高效液相色譜系統(tǒng)(日本島津)；HANGPING FA 1004電子分析天平；XW_80漩渦混合器；80-2S臺式低速離心機。實施例1:一種高效液相色譜法測定丙戊酸體液濃度過程中的衍生化方法，以四甲基氫氧化銨為催化劑，2，4' - 二溴苯乙酮為衍生劑。反應式如下:
權利要求
1.一種高效液相色譜法測定丙戊酸體液濃度過程中的衍生化方法，其特征在于:包括以下步驟:精密取50-100 μ L質(zhì)控或病人血清，加入0.1-0.2 μ g/μ L內(nèi)標溶液40-80 μ L，再加入2-311101/1硫酸溶液50-7(^1^，混勻，加入2-41^乙醚渦旋提取l_3min，在3000-4000r/min條件下離心分離5_10min,吸取上清液,加入10mmol/L催化劑氫氧化季銨鹽乙腈溶液30-110 μ L，渦旋混勻，再加入反應物摩爾倍數(shù)3-7倍的衍生劑，根據(jù)需要加入適量的乙腈，使反應溶液中乙腈的總體積達到140-160 μ L，渦旋混勻，在50-60°C水浴反應20-40分鐘，提高水浴溫度至65-70 V揮干有機相，衍生化反應結(jié)束。
2.根據(jù)權利要求1一種高效液相色譜法測定丙戊酸體液濃度過程中的衍生化方法，其特征在于:所述的催化劑氫氧化季銨鹽乙腈溶液為四甲基氫氧化銨乙腈溶液或四丁基氫氧化銨乙腈溶液或四乙基氫氧化銨乙腈溶液；所述的內(nèi)標溶液為壬酸溶液、環(huán)己基丙酸溶液、辛酸溶液或癸酸溶液；所述的衍生劑為2，4' -二溴苯乙酮乙腈溶液、α-溴苯乙酮乙腈溶液、2-溴-對硝基苯乙酮乙腈溶液或4-溴-7-甲氧基香豆素乙腈溶液。
3.根據(jù)權利要求2—種高效液相色譜法測定丙戊酸體液濃度過程中的衍生化方法，其特征在于:所述的催化劑為四甲基氫氧化銨乙腈溶液，其加入量為lOmmol/L四甲基氫氧化銨乙腈溶液90-110 μ L。
4.根據(jù)權利要求2—種高效液相色譜法測定丙戊酸體液濃度過程中的衍生化方法，其特征在于:所述的催化劑為四丁基氫氧化銨乙腈溶液，其加入量為lOmmol/L四丁基氫氧化銨乙腈溶液30-60 μ L。
5.根據(jù)權利要求1、2、3或4一種高效液相色譜法測定丙戊酸體液濃度過程中的衍生化方法，其特征在于:所述的反應物是指血清中的高濃度丙戊酸和內(nèi)標溶液中的內(nèi)標物，所述的高濃度的丙戊酸是按濃度為120-200 μ g/mL的丙戊酸計。
6.根據(jù)權利要求5—種高效液相色譜法測定丙戊酸體液濃度過程中的衍生化方法，其特征在于:所述的加入的衍生劑與反應物的摩爾比為5倍。
7.根據(jù)權利要求1、2、3或4一種高效液相色譜法測定丙戊酸體液濃度過程中的衍生化方法，其特征在于:所述的質(zhì)控或病人血清中丙戊酸濃度為1-200 μ g/mL。
8.根據(jù)權利要求5—種高效液相色譜法測定丙戊酸體液濃度過程中的衍生化方法，其特征在于:所述的質(zhì)控或病人血清中丙戊酸濃度為1-200 μ g/mL。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種高效液相色譜法測定丙戊酸體液濃度過程中的衍生化方法，該方法選用氫氧化季銨鹽乙腈溶液(四甲基氫氧化銨乙腈溶液或四丁基氫氧化銨乙腈溶液或四乙基氫氧化銨乙腈溶液)代替三乙胺催化丙戊酸與衍生劑(2，4′-二溴苯乙酮乙腈溶液、α-溴苯乙酮乙腈溶液、2-溴-對硝基苯乙酮乙腈溶液或4-溴-7-甲氧基香豆素乙腈溶液)衍生化成為可紫外檢測的苯酯，只需要反應物摩爾倍數(shù)3-5倍量的衍生劑，即可達到95%以上的衍生化產(chǎn)率。具有的優(yōu)點為衍生化反應完全，色譜圖基線平穩(wěn)，無內(nèi)源性雜質(zhì)干擾，測定結(jié)果準確，精密度好，靈敏度高，衍生化劑用量少，不易使色譜柱壓力增大，有利于延長色譜柱使用壽命。
文檔編號G01N30/06GK103197014SQ20131010454
公開日2013年7月10日 申請日期2013年3月28日 優(yōu)先權日2013年3月28日
發(fā)明者毛桂福 申請人:柳州市婦幼保健院