專利名稱：一種鴨坦布蘇病毒抗體固相競爭elisa檢測試劑盒的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種獸醫(yī)學檢測用試劑盒，確切講本發(fā)明是一種用于鴨坦布蘇病毒抗體固相競爭ELISA檢測試劑盒。
背景技術：
由鴨坦布蘇病毒引起的鴨群疾病現(xiàn)已形成大范圍暴發(fā)流行，其主要臨床癥狀為采食量突然下降，體溫升高，排綠色稀便，部分鴨癱瘓，個別鴨精神沉郁，產(chǎn)蛋鴨發(fā)病后產(chǎn)蛋量急劇下降可從90%以上下降至10%以下，剖檢可見卵泡破裂出血，卵黃性腹膜炎，脾臟出血，胰腺出血壞死,肝臟腫大出血。該病發(fā)病率高達90%，死亡率可達5%-30%。2010年我國學者報道在河北省首次分離到鴨坦布蘇病毒，該病毒在我國東南部迅速蔓延，在上海、浙江、江蘇、福建、山東、河南、河北和湖北等省份都大規(guī)模暴發(fā)。該病毒導致的疾病給養(yǎng)殖戶和社會造成了巨大的經(jīng)濟損失?，F(xiàn)有報道稱該病毒不僅感染鴨，還感染雞和鵝，從麻雀體內(nèi)也分離到該病毒；但現(xiàn)在還沒有有效的治療藥物和商品化的預防該病毒的疫苗，因此流行病學調(diào)查對該病的控制至關重要。目前已報道的病原學檢測技術主要有病毒分離、RT-PCR、巢式PCR、RT-LAMP, SYBRGreen RT-PCR、Taqman RT-PCR和MGB RT-PCR等。病毒分離不僅對試驗環(huán)境要求高，所需時間長。RT-PCR、巢式PCR和RT-LAMP需對后續(xù)結果進行處理，容易出現(xiàn)交叉污染及假陽性結果。SYBR Green RT-PCR,Taqman RT-PCR和MGB RT-PCR在對引物和探針設計時，不僅對基因序列要求高，而且費用高，需要高端儀器，上述檢測方法需要對操作人員進行嚴格培訓后方能工作。用于該病抗體檢測的ELISA方法操作簡單，容易掌握，不需要高端精密的儀器設備，易于推廣。目前針對鴨坦布蘇病毒抗體檢測的ELISA方法為間接ELISA，此法只能針對特定的鴨血清樣品，且只能判斷血清樣品的陰陽性，沒有檢測抗體效價的標準，因此無法檢測被檢樣品的抗體效價。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的技術任務在于提供一種可克服現(xiàn)有技術不足，具有特異、敏感、快速、方便、廉價特點的用于檢測鴨坦布蘇病毒抗體的檢測試劑盒；本發(fā)明的另一目的在于提供一種該檢測試劑盒的制備方法。
本發(fā)明的鴨坦布蘇病毒抗體固相競爭ELISA檢測試劑盒內(nèi)包含有包被鴨坦布蘇病毒滅活抗原的ELISA板。本發(fā)明的鴨坦布蘇病毒抗體固相競爭ELISA檢測試劑盒內(nèi)的ELISA板上包被的鴨坦布蘇病毒滅活抗原是通過細胞傳代培養(yǎng)的。為方便使用，本發(fā)明的鴨坦布蘇病毒抗體固相競爭ELISA檢測試劑盒內(nèi)還含有兔抗鴨坦布蘇病毒的陽性血清、鴨抗鴨坦布蘇病毒的陽性對照血清和鴨陰性對照血清，還可有用于做洗液和血清稀釋液的PBST溶液、TMB A液、TMB B液和終止液。
本發(fā)明的鴨坦布蘇病毒抗體固相競爭ELISA檢測試劑盒的制備方法是JfVero細胞生長密度達80%左右時，取-80°C保存的IO5 TCID50的鴨坦布蘇病毒，冰上融化后用OPT1-MEM做5倍稀釋，取2. 5mL感染75cm2細胞瓶中細胞，37°C孵育I小時，期間每15分鐘輕輕晃動2-3次，之后棄掉病毒感染液，再加入IOmL 0ΡΤΙ-ΜΕΜ，最后置于37°C、5% CO2的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細胞發(fā)生病變，病變細胞漂浮后將細胞瓶置于_80°C，反復凍融3次，之后于4°C、8000rpm的條件下離心30分鐘去除細胞碎片，再將上清于4°C、35000rpm的條件下離心3小時，棄上清，用適量的PBS溶液懸浮沉淀，收集的病毒用2%。甲醛37°C過夜滅活，滅活后的鴨坦布蘇病毒用于包被ELISA板。上述制備方法中的包被和封閉條件為抗原濃度為IOng/μ L，50 μ L/孔，4°C過夜；甩干ELISA板，再用PBST 100 μ L/孔洗4遍；用2% BSA 100 μ L/孔封閉，37°C，I小時。利用本發(fā)明試劑盒進行鴨坦布蘇病毒抗體固相競爭ELISA檢測，其優(yōu)點是
1)采用本發(fā)明的試劑盒進行檢測可消除動物種屬差異，即只用抗兔的二抗就可檢測不同種屬來源的疑似鴨坦布蘇病毒感染的血清樣品；
2)成本低，操作簡便；
3)不僅可高通量檢測樣品，還可根據(jù)實驗要求檢測血清的抗體效價；
4)本發(fā)明用于包被的病毒系是通過細胞傳代培養(yǎng)的，細胞培養(yǎng)比采用雞胚培養(yǎng)有如下優(yōu)點操作簡單、成本低廉、耗時短及易于純化。本發(fā)明所有的優(yōu)點是現(xiàn)有技術所無法實現(xiàn)的。

優(yōu)選的，上述的固相競爭ELISA反應條件與操作步驟為(檢測抗體效價)包被ELISA 板(50 μ L/孔)，抗原濃度為 IOng/μ L，4。。過夜;甩干 ELISA 板，PBST (100 μ L/孔)洗4遍；2% BSA封閉，37°C，I小時(100 μ L/孔)；待檢血清進行2倍比稀釋(50 μ L/孔，從1:4開始稀釋)，兔競爭血清按1:1000進行稀釋(50yL/孔)，37°C，1小時；甩干ELISA板，PBST (200 μ L/孔)洗4遍；抗兔IgG (HRP標記)酶標二抗按1:3000進行稀釋(50 μ L/孔)，37。。，I 小時；甩干 ELISA 板，PBST (100 μ L/孔)洗 4 遍；TMB (50 μ L/孔)，室溫 20min ;終止液(50 μ L /孔)；選擇450nm波長讀值。優(yōu)選的，上述的固相競爭ELISA反應條件與操作步驟為(高通量檢測血清樣品):包被 ELISA 板(50 μ L/ 孔)，抗原濃度為 IOng/ μ L，4°C過夜；甩干 ELISA 板，PBST( 100 μ L/ 孔)洗4遍；2% BSA封閉，37°C，1小時(100 μ L/孔)；待檢血清進行1:16稀釋(50 μ L/孔)，兔競爭血清按1:1000進行稀釋(50 μ L/孔)，37°C，1小時；甩干ELISA板，PBST (200 μ L/孔)洗4遍；抗兔IgG (HRP標記)酶標二抗按1:3000進行稀釋(50 μ L/孔)，37°C，I小時；甩干ELISA 板，PBST (100 μ L/孔)洗 4 遍；TMB (50 μ L/孔)，室溫 20min ;終止液(50 μ L / 孔);選擇450nm波長讀值。本研究建立的固相競爭ELISA檢測方法(0ΙΕ指定的檢測血清抗體效價的方法，有口蹄疫競爭ELISA為例)，不僅可以消除血清樣品的種屬來源差異(用一種HRP標記的二抗，可檢測鴨、雞和鵝等來源的血清樣品)，還可檢測血清的抗體效價(可用于抗體滴度和免疫效果的評價)，為一種簡單、方便、快速及廉價的檢測方法，適用于大量田間血清樣品的檢測和相關的實驗室研究。


圖1陰陽性閾值確定依據(jù)-陰陽性血清樣品在8倍稀釋度時阻斷率的分布；圖2陰陽性閾值確定依據(jù)-陰陽性血清樣品在16倍稀釋度時阻斷率的分布；
圖3陰陽性閾值確定依據(jù)-陰陽性血清樣品在32倍稀釋度時阻斷率的分布；
圖4陰陽性閾值確定依據(jù)-陰陽性血清樣品在64倍稀釋度時阻斷率的分布；
圖5特異性與敏感性檢測依據(jù)圖6交叉反應性檢測。
具體實施例方式以下結合具體實例對本發(fā)明做進一步說明1.鴨坦布蘇病毒抗原的準備
待VeiO (非洲綠猴腎細胞病毒培養(yǎng)常用細胞)細胞生長密度達80%左右時，取-80°c保存的鴨坦布蘇病毒(IO5 TCID5tl),冰上融化后用OPT1-MEM做5倍稀釋，取2. 5mL感染75cm2細胞瓶中細胞，37°C孵育I小時，期間每15分鐘輕輕晃動2-3次，之后棄掉病毒感染液，再加入IOmL 0ΡΤΙ-ΜΕΜ，最后置于37°C、5% CO2的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。3天后細胞發(fā)生病變，待病變細胞漂浮后將細胞瓶置于_80°C，反復凍融3次，之后于4°C、8000rpm的條件下離心30分鐘去除細胞碎片，再將上清于4°C、35000rpm (水平轉子)的條件下離心3小時，棄上清，用適量的PBS溶液懸浮沉淀，BCA法測定濃度后，用2%。甲醛37°C過夜滅活，滅活后的鴨坦布蘇病毒于_80°C保存?zhèn)溆谩?.血清的制備
(I)鴨坦布蘇病毒陽性鴨血清的制備
將I中超離純化的鴨坦布蘇病毒與MONTANIDE ISA 71 VG佐劑乳化(3: 7，V/V)，通過胸部肌肉多點注射免疫3周齡的北京鴨，免疫劑量為250 μ g/只；免疫前翅靜脈采血，分離血清作為陰性血清對照；一免后15天，鴨坦布蘇病毒(不加佐劑)同一免的免疫途徑免疫鴨，免疫劑量為200 μ g /只`；二免后15天，鴨坦布蘇病毒(不加佐劑)通過胸部肌肉多點注射加強免疫鴨，免疫劑量為200 μ g/只；三免后7天，翅靜脈采血，用ELISA法測血清抗體效價為1:128以上時，心臟采血，分離血清，分裝后_80°C保存。(2)兔抗鴨坦布蘇病毒血清的制備
選擇2 2. 5kg的健康公兔，將超離純化的鴨坦布蘇病毒與等體積的完全弗氏佐劑乳化，背部皮下多點注射免疫，免疫劑量為300 μ g/只；一免后15天，鴨坦布蘇病毒與等體積的不完全弗氏佐劑乳化，皮下多點注射免疫兔子，免疫劑量為300 μ g /只；二免后15天，鴨坦布蘇病毒與等體積的不完全弗氏佐劑乳化，皮下多點注射加強免疫兔子，免疫劑量為300 Ug /只；三免后7天，耳靜脈采血，用ELISA法測血清抗體效價為1:128以上時，心臟采血，分離血清，分裝后-80°C保存。3.反應條件的優(yōu)化
通過矩陣法優(yōu)化鴨坦布蘇病毒滅活抗原的包被濃度、兔抗鴨坦布蘇病毒陽性血清的稀釋比、HRP標記的抗兔IgG 二抗的稀釋比和封閉液的濃度，當陰陽性血清OD比值最大，且完全兔競爭血清孔(此孔只加入稀釋好的兔抗鴨坦布蘇病毒陽性血清及等量的PBST) OD值為1.5左右時，確定反應條件包被ELISA板(50 μ L/孔)，抗原濃度為IOng/μ L，2% BSA封閉，37。。，I小時(100 μ L/孔);兔競爭血清按1:1000進行稀釋(50 μ L/孔)，HRP標記的抗兔IgG酶標二抗按1:3000進行稀釋(50 μ L /孔)。
4.閾值的確定
經(jīng)間接ELISA檢測的123份鴨坦布蘇病毒陽性血清與141份鴨陰性血清，用已確定的反應條件和操作步驟進行檢測，樣品檢測布局見附表I。表1.固相競爭ELISA板的樣品檢測布局-檢測抗體效價
權利要求
1.一種鴨坦布蘇病毒抗體固相競爭ELISA檢測試劑盒，其特征在于試劑盒內(nèi)包含有包被鴨坦布蘇病毒滅活抗原的ELISA板。
2.根據(jù)權利要求1所述的鴨坦布蘇病毒抗體固相競爭ELISA檢測試劑盒，其特征在于ELISA板上包被的鴨坦布蘇病毒滅活抗原是通過細胞傳代培養(yǎng)的。
3.根據(jù)權利要求1或2所述的鴨坦布蘇病毒抗體固相競爭ELISA檢測試劑盒，其特征在于試劑盒內(nèi)還含有兔抗鴨坦布蘇病毒的陽性血清、鴨抗鴨坦布蘇病毒的陽性對照血清和鴨陰性對照血清。
4.根據(jù)權利要求3所述的鴨坦布蘇病毒抗體固相競爭ELISA檢測試劑盒，其特征在于試劑盒內(nèi)還有PBST溶液、TMB A液、TMB B液和終止液。
全文摘要
本發(fā)明公開一種用于鴨坦布蘇病毒抗體的固相競爭ELISA檢測試劑盒。本發(fā)明的鴨坦布蘇病毒血清學檢測試劑盒包含有包被鴨坦布蘇病毒滅活抗原的ELISA板，兔抗鴨坦布蘇病毒的陽性血清、鴨抗鴨坦布蘇病毒的陽性對照血清和鴨陰性對照血清。采用本發(fā)明的試劑盒進行檢測，可不分種屬的檢測鴨坦布蘇病毒易感動物血清，不僅可以高通量的檢測田間血清樣品，還可根據(jù)需要檢測樣品的抗體效價。同時，所提供的固相競爭ELISA試劑盒操作簡單，易于掌握；不需高端儀器設備，易于推廣；成本低，適于田間血清樣品檢測及實驗室研究應用。
文檔編號G01N33/96GK103063854SQ20131000974
公開日2013年4月24日 申請日期2013年1月10日 優(yōu)先權日2013年1月10日
發(fā)明者朱啟運, 付鈺廣, 吉艷紅 申請人:中國農(nóng)業(yè)科學院蘭州獸醫(yī)研究所