專利名稱：一種研究厚殼貽貝胚胎和幼蟲神經(jīng)發(fā)育的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及厚殼貽貝的神經(jīng)發(fā)育研究，具體地說(shuō)，是一種研究厚殼貽貝胚胎和幼蟲神經(jīng)發(fā)育的方法。
背景技術(shù)：
厚殼貽貝(Jfytilus coruscus )，軟體動(dòng)物門/雙殼綱，分布于我國(guó)的黃海、渤海和東海沿岸以及臺(tái)灣等地。貽貝用足絲附著在附養(yǎng)物上生活，利用鰓濾食。選食海水中的微小生物以及有機(jī)碎屑等。其繁殖季節(jié)一年兩次，是海產(chǎn)貝類中生長(zhǎng)最快的種類之一。厚殼貽貝的發(fā)育階段包括受精卵、桑葚期、囊胚期、擔(dān)輪幼蟲、D形幼蟲、殼頂幼蟲、匍匐幼蟲等階段，在變成附著成體之前有一個(gè)浮游幼蟲階段。理解和控制厚殼貽貝浮游幼蟲的附著變態(tài)行為對(duì)于水產(chǎn)養(yǎng)殖苗種生產(chǎn)技術(shù)的改善和海洋防污技術(shù)的發(fā)展具有極其重要的理論意義和實(shí)踐意義，而目前尚無(wú)關(guān)于厚殼貽貝幼蟲發(fā)育過(guò)程中附著變態(tài)機(jī)制的報(bào)道。中國(guó)期刊《安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)》，2010年第32期，刊出的論文“厚殼貽貝胚胎發(fā)育觀察”，公開了一種研究厚殼貽貝胚胎發(fā)育的方法，其具體方法是選擇性腺成熟的厚殼貽貝親貝，通過(guò)催產(chǎn)受精，對(duì)厚殼貽貝受精、卵裂、幼體發(fā)育等細(xì)胞生物學(xué)現(xiàn)象用顯微鏡進(jìn)行連續(xù)觀察，經(jīng)顯微攝影，詳細(xì)記錄厚殼貽貝的胚胎發(fā)育全過(guò)程。但是其并沒有對(duì)厚殼貽貝的胚胎和幼蟲神經(jīng)發(fā)育進(jìn)行研究，因此無(wú)法探究其浮游幼蟲的附著變態(tài)機(jī)制。目前，在對(duì)哺乳動(dòng)物如小鼠的神經(jīng)發(fā)育研究中，有使用5羥色胺抗體、FMRF酰胺類抗體結(jié)合α微管蛋白抗體對(duì)小鼠神經(jīng)系統(tǒng)進(jìn)行標(biāo)記，但在對(duì)貝類的研究中，三種抗體結(jié)合標(biāo)記很少見。在雙殼貝類中，有僅采用α微管蛋白抗體來(lái)標(biāo)記其幼蟲的神經(jīng)系統(tǒng)的報(bào)道，但是結(jié)果顯示其難以將幼蟲的神經(jīng)系統(tǒng)完整的描述出來(lái)。其主要原因在于:使用抗體對(duì)研究對(duì)象的神經(jīng)發(fā)育進(jìn)行標(biāo)記，需要保證抗體處于合適的濃度，同時(shí)要保證其他化學(xué)物質(zhì)的處理濃度和時(shí)間均適宜，才能有效的將神經(jīng)系統(tǒng)標(biāo)示出來(lái)，若使用多種抗體進(jìn)行標(biāo)記，為保證每一種抗體都可以有效的與其抗原有效結(jié)合同時(shí)互不干擾，則進(jìn)一步增加了其標(biāo)記的難度。但是鑒于研究厚殼貽貝胚胎和幼蟲神經(jīng)發(fā)育可用于揭示其浮游幼蟲的附著變態(tài)機(jī)制，并進(jìn)一步指導(dǎo)水產(chǎn)養(yǎng)殖苗種生產(chǎn)和海洋防污，因此，亟需一種可用于研究厚殼貽貝胚胎和幼蟲神經(jīng)發(fā)育的有效方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中的不足，提供一種研究厚殼貽貝胚胎和幼蟲神經(jīng)發(fā)育的方法。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案是:
一種研究厚殼貽貝胚胎和幼蟲神經(jīng)發(fā)育的方法，其特征在于，它包括以下步驟:
a)將厚殼貽貝的胚胎和幼蟲置入質(zhì)量濃度為0.1-8%的MgCl2溶液中處理20-30 min,用多聚甲醛將幼蟲固定在PBS緩沖液中；
b)取出步驟a)處理后的幼蟲，洗滌后用質(zhì)量濃度0.1-15%的乙二胺四乙酸靜置脫鈣，然后將胚胎或幼蟲樣品用PBS緩沖液洗滌后加入封閉液；
c)用濃度1:200-1:1000的5羥色胺抗體或濃度1:200-1:1000的FMRF酰胺類抗體和濃度1:200-1:1000的α微管蛋白抗體結(jié)合標(biāo)記步驟b)的厚殼貽貝胚胎和幼蟲，4°C下孵育1-8天，再用PBST洗滌后分別加入含有濃度為1:800-1:1200 二抗的PBS溶液中，4°C下孵育4-12小時(shí)。優(yōu)選的，所述的MgCl2溶液的質(zhì)量濃度為7.5%，所述的乙二胺四乙酸的質(zhì)量濃度為
5% ο優(yōu)選的，所述的二抗的濃度為1:1000。所述的二抗是山羊抗兔和山羊抗鼠二抗。所述的封閉液是含質(zhì)量濃度0.25%牛血清蛋白、質(zhì)量濃度1% triton-100和質(zhì)量濃度0.03%疊氮化鈉的PBS溶液。本發(fā)明優(yōu)點(diǎn)在于:1、本發(fā)明采用5羥色胺抗體和FMRF酰胺類抗體分別與α微管蛋白抗體結(jié)合，對(duì)厚殼貽貝的神經(jīng)系統(tǒng)進(jìn)行了免疫標(biāo)記，并通過(guò)免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)和熒光染色技術(shù)檢驗(yàn)了厚殼貽貝的胚胎至早期幼蟲階段的不同類型神經(jīng)細(xì)胞的時(shí)空分布，結(jié)果可獲得清晰的熒光信號(hào)圖譜，清楚地觀測(cè)到厚殼貽貝胚胎及幼蟲階段的神經(jīng)發(fā)育過(guò)程，并根據(jù)所得熒光信號(hào)圖譜，繪制了完整的厚殼貽貝早期幼蟲神經(jīng)發(fā)育示意圖。2、本發(fā)明對(duì)厚殼貽貝胚胎及幼蟲階段的神經(jīng)發(fā)育過(guò)程的標(biāo)記可用于闡明其神經(jīng)發(fā)育機(jī)制，觀測(cè)足區(qū)細(xì)胞形成過(guò)程，可進(jìn)一步揭示厚殼貽貝浮游幼蟲的附著變態(tài)機(jī)制，指導(dǎo)水產(chǎn)養(yǎng)殖苗種生產(chǎn)和海洋防污等。


附圖1是厚殼貽貝胚胎以及幼蟲體內(nèi)FMRF酰胺類免疫陽(yáng)性信號(hào)(紅色)和α微管蛋白(綠色)的定位圖。1.受精卵，出現(xiàn)第一極葉；2.桑葚期(6 h)，開始出現(xiàn)α微管蛋白；
3.囊胚期(12 h)，無(wú)FMRF酰胺類陽(yáng)性信號(hào)出現(xiàn)；4.早期擔(dān)輪幼蟲(18 h)，第一個(gè)FMRF酰胺類免疫活性細(xì)胞(al)出現(xiàn)在幼蟲體的頂端區(qū)域，mo (口)；5.擔(dān)輪幼蟲后期(24h)，F(xiàn)MRF酰胺類免疫陽(yáng)性信號(hào)數(shù)量增加至2個(gè)；6.早期D形幼蟲(30 h)，頂神經(jīng)節(jié)(包含3個(gè)陽(yáng)性信號(hào))以及少量纖維；7.早期D形幼蟲(36 h)，免疫信號(hào)數(shù)量繼續(xù)增加，且伸出前后兩個(gè)纖維，并向體前后延伸，向后伸入到未來(lái)發(fā)育的足區(qū)域；8.D形面盤幼蟲(48 h)的腹面觀，足左右兩側(cè)的陽(yáng)性信號(hào)出現(xiàn)，由之前的神經(jīng)細(xì)胞發(fā)出的神經(jīng)纖維延伸至足細(xì)胞，并與之連接；
9.D形面盤幼蟲(48h)的側(cè)面觀。附圖2是厚殼貽貝胚胎及幼蟲體內(nèi)5-羥色胺免疫陽(yáng)性信號(hào)(紅色)和α微管蛋白(綠色)的定位圖。1.受精卵，出現(xiàn)第一極體；2.桑葚期(6 h)，開始出現(xiàn)α微管蛋白；3.囊胚期(12 h)，無(wú)5-羥色胺陽(yáng)性信號(hào)出現(xiàn)；4.早期擔(dān)輪幼蟲(18 h)，第一個(gè)5-羥色胺免疫陽(yáng)性信號(hào)出現(xiàn)；5.擔(dān)輪幼蟲后期(24h)，5-羥色胺免疫陽(yáng)性信號(hào)數(shù)量增加至2個(gè)，分布在幼蟲體的頂端；6.30 h D形面盤幼蟲，頂部陽(yáng)性信號(hào)伸出細(xì)小的頂端纖毛簇；7.早期D形幼蟲(36 h)，沒有觀察到陽(yáng)性信號(hào)數(shù)量增加，免疫陽(yáng)性信號(hào)伸出兩條纖維向前延伸；8.D形幼蟲(42 h)，5-羥色胺免疫陽(yáng)性信號(hào)數(shù)量增加至2-3個(gè)，位置保持不變，分布于腦神經(jīng)節(jié)區(qū)域，而且由它們發(fā)出的纖維延伸在腦神經(jīng)節(jié)周圍；9.D形幼蟲(48 h)，5-羥色胺免疫陽(yáng)性信號(hào)數(shù)量增加至4個(gè)，位置仍然沒有變化。附圖3是厚殼貽貝早期幼蟲神經(jīng)發(fā)育示意圖。1.擔(dān)輪幼蟲早期FMRF酰胺類活性側(cè)面觀，頂部第一個(gè)FMRF酰胺類免疫陽(yáng)性信號(hào)(al)出現(xiàn)在頂端區(qū)；2.擔(dān)輪幼蟲晚期階段FMRF酰胺類免疫活性側(cè)面觀，有頂部I個(gè)陽(yáng)性信號(hào)(al)和側(cè)部一個(gè)陽(yáng)性信號(hào)(rll);3.在D形幼蟲階段FMRF酰胺類免疫活性側(cè)面觀，足右側(cè)的陽(yáng)性信號(hào)(rpl)出現(xiàn)，由rll發(fā)出的神經(jīng)纖維延伸至足細(xì)胞，并與之連接；4.擔(dān)輪幼蟲早期FMRF酰胺類免疫活性的腹面觀，第一個(gè)FMRF酰胺類頂部免疫陽(yáng)性信號(hào)(al)出現(xiàn)在頂端區(qū)；5.擔(dān)輪幼蟲晚期FMRF酰胺類免疫活性的腹面觀，有I個(gè)頂陽(yáng)性信號(hào)(al)和兩個(gè)側(cè)陽(yáng)性信號(hào)(rll和111);6.D形幼蟲階段FMRF酰胺類免疫活性的腹面觀，左右兩側(cè)的足陽(yáng)性信號(hào)(Ipl和rpl)出現(xiàn)，由rll和111發(fā)出的神經(jīng)纖維延伸至足細(xì)胞，并與之連接；7.擔(dān)輪幼蟲早期5-羥色胺活性側(cè)面觀，第一個(gè)5-羥色胺免疫陽(yáng)性信號(hào)出現(xiàn)；8.擔(dān)輪幼蟲晚期5-羥色胺活性側(cè)面觀，5-羥色胺免疫陽(yáng)性信號(hào)增加至2個(gè)；9.D形幼蟲階段5-羥色胺活性側(cè)面觀，5-羥色胺免疫陽(yáng)性信號(hào)增加至3-4個(gè)，且位置保持不變，分布于腦神經(jīng)節(jié)部位。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明提供的具體實(shí)施方式
作詳細(xì)說(shuō)明。實(shí)施例1 I實(shí)驗(yàn)材料
厚殼貽貝成貝采自于浙江嵊泗縣枸杞海域；5羥色胺抗體(來(lái)源于兔子)、FMRF酰胺類抗體(來(lái)源于兔子)、α微管蛋白抗體(來(lái)源于小鼠，在PBS溶液中按照1:500(體積比)稀釋+1.0%(質(zhì)量濃度)正常牛血清+1.0%(體積比)tritonX-100)均購(gòu)于Sigma公司；山羊抗兔 Alexa568、山羊抗鼠 Alexa 488 均購(gòu)于 Molecular Probes。2實(shí)驗(yàn)方法
2.1厚殼貽貝浮游幼蟲的預(yù)處理
按照常規(guī)方法孵化厚殼貽貝受精卵，具體孵化方法是將盛有厚殼貽貝密封袋和冰塊先放置于保溫箱，12h后將親貝從保溫箱中取出，放置于20-22°C海水中。催產(chǎn)過(guò)程中，微量充氣。將正在排放精子和卵子的親貝分別單獨(dú)隔離放于2L燒杯中，在倒置顯微鏡下觀察精子活力和卵子形狀，選擇游速很快的精子和渾圓飽滿的卵子進(jìn)行混合孵化培育。從孵化開始至48 h，每6 h取樣I次。取樣前，攪動(dòng)水體，使樣品分布均勻。通過(guò)篩絹網(wǎng)將胚胎和幼蟲收集，使用過(guò)濾海水洗滌，后置入質(zhì)量濃度為7.5%的MgCl2溶液中大約20-30 min，直到幼蟲完全麻痹。用新鮮的質(zhì)量濃度為4%的多聚甲醛將幼蟲固定在pH值7.4的PBS緩沖液中。室溫下固定2 h后，PBS緩沖液洗滌后轉(zhuǎn)移至體積濃度70%的乙醇中，存儲(chǔ)在_20°C條件備用。2.2厚殼貽貝浮游幼蟲的抗體結(jié)合標(biāo)記
取出備用的幼蟲，洗滌后加入質(zhì)量濃度為5%的乙二胺四乙酸，稍加混合后室溫下靜置脫鈣30 min。然后，將胚胎或幼蟲樣品在PBS緩沖液中洗滌3次，每次15 min，后加入封閉液(0.25%牛血清蛋白，1% triton-100，0.03%疊氮化鈉，PBS)，4°C過(guò)夜。分別用濃度1:1000的5羥色胺抗體(來(lái)源于兔子)或濃度1:1000的FMRF酰胺類抗體(來(lái)源于兔子)和濃度1:500的α微管蛋白抗體(來(lái)源于小鼠，在PBS溶液中1:500稀釋+1.0%正常牛血清+1.0% tritonX-100)結(jié)合標(biāo)記，置于4°C下孵育2天，然后在PBST中洗滌I h/3次，并分別加入含有濃度為1:1000山羊抗兔Alexa568 (稀釋至1:1000 (體積比))和濃度為1:1000山羊抗鼠Alexa 488 (稀釋至1:1000 (體積比))的PBS中，4°C 12h。在二抗中孵育之后，所有胚胎及幼蟲在PBS中洗滌若干次，然后用80%的甘油/PBS封片。2.3厚殼貽貝浮游幼蟲抗體結(jié)合標(biāo)記的熒光檢測(cè)
將上述經(jīng)抗體結(jié)合標(biāo)記后的所有樣品在熒光顯微鏡Nikon ECLIPSE 90i下檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)中，所檢測(cè)的每個(gè)階段每個(gè)抗體對(duì)應(yīng)的胚胎或幼蟲個(gè)數(shù)均大于100個(gè)。用Photoshop CS(Adobe System)調(diào)整圖片的對(duì)比度和明亮度并聚焦為圖片。3實(shí)驗(yàn)結(jié)果
厚殼貽貝胚胎以及幼蟲體內(nèi)FMRF酰胺類免疫陽(yáng)性信號(hào)(紅色)和α微管蛋白(綠色)的定位如圖1所示。在厚殼貽貝從受精卵開始至囊胚期的整個(gè)胚胎發(fā)育的過(guò)程中，均無(wú)發(fā)現(xiàn)FMRF酰胺類(FMRFamide-1ike)免疫陽(yáng)性信號(hào)。在早期擔(dān)輪幼蟲發(fā)育階段(18 h)，第I個(gè)FMRF酰胺類免疫活性細(xì)胞在身體的最前部出現(xiàn)，即第I個(gè)頂細(xì)胞(al)，這個(gè)細(xì)胞在纖毛的頂端末尾處。當(dāng)首次被檢測(cè)到的時(shí)候，被特異性染色的細(xì)胞分布于細(xì)胞質(zhì)中。24 h后，擔(dān)輪幼蟲的FMRF酰胺類免疫活性細(xì)胞增加至2個(gè)。30 h后，明顯觀察到FMRF酰胺類免疫活性側(cè)細(xì)胞(左邊和右邊的側(cè)細(xì)胞，分別是rll和111)數(shù)量增加至2個(gè)，且這些免疫活性側(cè)細(xì)胞均分布在頂端區(qū)al頂細(xì)胞的背側(cè)并貫穿在纖毛中。36 h后，更多的FMRF酰胺類免疫活性側(cè)細(xì)胞出現(xiàn)在幼蟲頂部區(qū)域的左右兩側(cè)。這些側(cè)細(xì)胞伸出的陽(yáng)性纖維延伸后形成基底神經(jīng)纖維，并延伸至正在發(fā)育中足所在區(qū)域。在頂端區(qū)所有細(xì)胞中，al頂細(xì)胞始終處于腹部，位置沒有發(fā)生變化。在D形面盤幼蟲階段(48 h)，F(xiàn)MRF酰胺類免疫活性細(xì)胞的基底神經(jīng)纖維形成了一個(gè)緊湊的神經(jīng)纖維網(wǎng)。這個(gè)神經(jīng)纖維網(wǎng)以及其周圍緊密連接的體細(xì)胞形成了頂器官，頂器官與之后的發(fā)育階段保持一致。側(cè)細(xì)胞rll和111仍然與頂端器官的細(xì)胞相分離，每個(gè)細(xì)胞延伸出兩條纖維:相對(duì)較短的那條從前部伸出，而較長(zhǎng)的那條纖維伸入后腹部進(jìn)入足區(qū)(足區(qū)有I對(duì)細(xì)胞出現(xiàn)——左足細(xì)胞和右足細(xì)胞，rpl和Ipl )。幼蟲進(jìn)入D形階段(48h)神經(jīng)系統(tǒng)的FMRF酰胺類免疫活性細(xì)胞分別是:頂器官的3個(gè)頂細(xì)胞、2個(gè)側(cè)細(xì)胞(rll和111)，以及足區(qū)形成的2個(gè)足細(xì)胞(rpl和lpl)。由頂細(xì)胞和側(cè)細(xì)胞延伸出的免疫活性纖維形成基底神經(jīng)纖維。厚殼貽貝胚胎及幼蟲體內(nèi)5-羥色胺免疫陽(yáng)性信號(hào)(紅色)和α微管蛋白(綠色)的定位如圖2所示。在厚殼貽貝從受精開始至囊胚期的整個(gè)胚胎發(fā)育的過(guò)程中，均無(wú)發(fā)現(xiàn)5-羥色胺(serotonin-like)免疫陽(yáng)性信號(hào)。在早期擔(dān)輪幼蟲發(fā)育階段(18 h)，第I個(gè)5-羥色胺免疫活性細(xì)胞在頂端出現(xiàn)，即頂器官前端。這個(gè)細(xì)胞生出一個(gè)頂端簇纖毛。24 h后，5-羥色胺免疫活性細(xì)胞增加至2個(gè)。隨后，在早期D形幼蟲階段，觀察到免疫活性細(xì)胞伸出一個(gè)短小的基底神經(jīng)纖維，延伸至后來(lái)發(fā)育成的頂器官神經(jīng)纖維網(wǎng)部位。42 h時(shí)，更多5-羥色胺免疫活性細(xì)胞出現(xiàn)在頂區(qū)域，其數(shù)量已經(jīng)增加至2-3個(gè)。所有這些細(xì)胞均具有頂纖毛，且這些基底纖維形成緊密的神經(jīng)纖維網(wǎng)。幼蟲發(fā)育至D形階段(48 h)，5-羥色胺免疫活性細(xì)胞的數(shù)量增加至4個(gè)。這些細(xì)胞發(fā)出的基底纖維延伸至緊密的頂神經(jīng)纖維網(wǎng)。上述使用5羥色胺抗體或FMRF酰胺類抗體和α微管蛋白抗體結(jié)合標(biāo)記獲得的厚殼貽貝胚胎以及幼蟲體內(nèi)抗體熒光信號(hào)圖譜清晰，可清楚的觀測(cè)到厚殼貽貝胚胎及幼蟲節(jié)段的神經(jīng)發(fā)育過(guò)程。根據(jù)上述熒光信號(hào)圖譜，我們繪制了完整的厚殼貽貝早期幼蟲神經(jīng)發(fā)育示意圖，如圖3所示。綜上所述，使用本發(fā)明的方法對(duì)厚殼貽貝胚胎和幼蟲階段進(jìn)行標(biāo)記，完整地揭示了厚殼貽貝早期幼蟲神經(jīng)發(fā)育過(guò)程中各個(gè)時(shí)期的細(xì)胞變化，闡明了其神經(jīng)發(fā)育機(jī)制，觀測(cè)到其足區(qū)細(xì)胞形成過(guò)程，這為揭示厚殼貽貝浮游幼蟲的附著變態(tài)機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。實(shí)施例2
實(shí)施例2的操作同實(shí)施例1，不同之處僅在于步驟2.1使用的MgCl2溶液的質(zhì)量濃度為
0.1% ;步驟2.2中使用的乙二胺四乙酸的質(zhì)量濃度為15% ;步驟2.2中一抗5羥色胺抗體或FMRF酰胺類抗體和α微管蛋白抗體的濃度分別為1:500、1:200和1:1000，一抗孵育時(shí)間為8天；步驟2.2中二抗山羊抗兔Alexa568和山羊抗鼠Alexa 488的濃度分別為1:800、1:1200，二抗孵育時(shí)間為4 h。實(shí)施例3
實(shí)施例3的操作同實(shí)施例1，不同之處僅在于步驟2.1使用的MgCl2溶液的質(zhì)量濃度為8% ;步驟2.2中使用的乙二胺四乙酸的質(zhì)量濃度為0.1% ;步驟2.2中一抗5羥色胺抗體或FMRF酰胺類抗體和α微管蛋白抗體的濃度分別為1:200、1:1000和1:800，一抗孵育時(shí)間為I天;步驟2.2中二抗山羊抗兔Alexa568和山羊抗鼠Alexa 488的濃度分別為1:1000、1:1000，二抗孵育時(shí)間為8 h。實(shí)施例4
實(shí)施例4的操作同實(shí)施例1，不同之處僅在于步驟2.1使用的MgCl2溶液的質(zhì)量濃度為
0.1% ;步驟2.2中使用的乙二胺四乙酸的質(zhì)量濃度為0.1% ;步驟2.2中一抗5羥色胺抗體或FMRF酰胺類抗體和α微管蛋白抗體的濃度分別為1:1000、1:700和1:1000，一抗孵育時(shí)間為8天；步驟2.2中二抗山羊抗兔Alexa568和山羊抗鼠Alexa 488的濃度分別為1:800、1:1000，二抗孵育時(shí)間為10 h。實(shí)施例5
實(shí)施例5的操作同實(shí)施例1，不同之處僅在于步驟2.1使用的MgCl2溶液的質(zhì)量濃度為4.5% ;步驟2.2中使用的乙二胺四乙酸的質(zhì)量濃度為8% ;步驟2.2中一抗5羥色胺抗體或FMRF酰胺類抗體和α微管蛋白抗體的濃度分別為1:500、1:500和1:200，一抗孵育時(shí)間為I天;步驟2.2中二抗山羊抗兔Alexa568和山羊抗鼠Alexa 488的濃度分別為1:1200、1:800，二抗孵育時(shí)間為4 h。實(shí)施例6
實(shí)施例6的操作同實(shí)施例1，不同之處僅在于步驟2.1使用的MgCl2溶液的質(zhì)量濃度為8% ;步驟2.2中使用的乙二胺四乙酸的質(zhì)量濃度為0.1% ;步驟2.2中一抗5羥色胺抗體或FMRF酰胺類抗體和α微管蛋白抗體的濃度分別為1:500、1:1000和1:1000，一抗孵育時(shí)間為8天；步驟2.2中二抗山羊抗兔Alexa568和山羊抗鼠Alexa 488的濃度分別為1:1000、1:1000，二抗孵育時(shí)間為12 h。對(duì)比例I
對(duì)比例I的操作同實(shí)施例1，不同之處僅在于步驟2.1使用的MgCl2溶液的質(zhì)量濃度為8.5%。
對(duì)比例2
對(duì)比例2的操作同實(shí)施例1，不同之處僅在于步驟2.2中使用的乙二胺四乙酸的質(zhì)量濃度為16%。對(duì)比例3
對(duì)比例3的操作同實(shí)施例1，不同之處僅在于步驟2.2中一抗5羥色胺抗體或FMRF酰胺類抗體和α微管蛋白抗體的濃度分別為1:1200、1:1200和1:1200。對(duì)比例4
對(duì)比例4的操作同實(shí)施例1,不同之處僅在于步驟2.2中二抗山羊抗兔Alexa568和山羊抗鼠Alexa 488的孵育時(shí)間為13 h。對(duì)上述實(shí)施例2-6及對(duì)比例1-4進(jìn)行厚殼貽貝浮游幼蟲抗體結(jié)合標(biāo)記的熒光檢測(cè)，結(jié)果顯示實(shí)施例4-6使用5羥色胺抗體或FMRF酰胺類抗體和α微管蛋白抗體結(jié)合標(biāo)記獲得的厚殼貽貝胚胎以及幼蟲體內(nèi)抗體熒光信號(hào)圖譜清晰，可清楚的觀測(cè)到厚殼貽貝胚胎及幼蟲階段的神經(jīng)發(fā)育過(guò)程，對(duì)比例1-4使用5羥色胺抗體或FMRF酰胺類抗體和α微管蛋白抗體結(jié)合標(biāo)記獲得的厚殼貽貝胚胎以及幼蟲體內(nèi)抗體熒光信號(hào)顯示較弱，不能清楚而連續(xù)地觀測(cè)厚殼貽貝胚胎及幼蟲階段每個(gè)時(shí)期的神經(jīng)發(fā)育情況。綜合分析可知，MgCl2溶液的濃度、乙二胺四乙酸溶液的濃度、一抗的濃度及孵育時(shí)間、二抗的濃度及孵育時(shí)間影響到對(duì)厚殼貽貝胚胎及幼蟲的抗體標(biāo)記效果，其中，MgCl2溶液主用于貝類幼蟲張殼，從而使抗體能夠有效進(jìn)入其體內(nèi)；乙二胺四乙酸主用于貝類幼蟲貝殼脫鈣，從而使貝類貝殼變薄或透明化；而一抗、二抗的濃度及孵育時(shí)間決定抗體和目標(biāo)物的結(jié)合數(shù)量及結(jié)合強(qiáng)度，只有在合適的參數(shù)條件下才能對(duì)樣品有效標(biāo)記，達(dá)到能觀測(cè)到熒光且各種熒光信號(hào)清晰可辨的程度。以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對(duì)于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員，在不脫離本發(fā)明方法的前提下，還可以做出若干改進(jìn)和補(bǔ)充，這些改進(jìn)和補(bǔ)充也應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。
權(quán)利要求
1.一種研究厚殼貽貝胚胎和幼蟲神經(jīng)發(fā)育的方法，其特征在于，它包括以下步驟: a)將厚殼貽貝的胚胎和幼蟲置入質(zhì)量濃度為0.1-8%的MgCl2溶液中處理20-30 min,用多聚甲醛將幼蟲固定在PBS緩沖液中； b)取出步驟a)處理后的幼蟲，洗滌后用質(zhì)量濃度0.1-15%的乙二胺四乙酸靜置脫鈣，然后將胚胎或幼蟲樣品用PBS緩沖液洗滌后加入封閉液； c)用濃度1:200-1:1000的5羥色胺抗體或濃度1:200-1:1000的FMRF酰胺類抗體和濃度1:200-1:1000的α微管蛋白抗體結(jié)合標(biāo)記步驟b)的厚殼貽貝胚胎和幼蟲，4°C下孵育1-8天，再用PBST洗滌后分別加入含有濃度為1:800-1:1200 二抗的PBS溶液中，4°C下孵育4-12小時(shí)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的MgCl2溶液的質(zhì)量濃度為7.5%，所述的乙二胺四乙酸的質(zhì)量濃度為5%。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的二抗的濃度為1:1000。
4.據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的二抗是山羊抗兔和山羊抗鼠二抗。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的封閉液是含質(zhì)量濃度0.25%牛血清蛋白、質(zhì)量濃度1% triton-100和質(zhì)量濃度0.03%疊氮化鈉的PBS溶液。
全文摘要
本發(fā)明提供一種研究厚殼貽貝胚胎和幼蟲神經(jīng)發(fā)育的方法a)將胚胎和幼蟲置入質(zhì)量濃度為0.1-8%的MgCl2溶液中處理，用多聚甲醛固定幼蟲；b)取出處理后的幼蟲，洗滌后用質(zhì)量濃度0.1-15%乙二胺四乙酸靜置脫鈣，然后用PBS洗滌后加入封閉液；c)用濃度1:200-1:1000的5羥色胺抗體或FMRF酰胺類抗體和α微管蛋白抗體結(jié)合標(biāo)記厚殼貽貝胚胎和幼蟲，4℃孵育1-8天，再用PBST洗滌后分別加入含有濃度為1:800-1:1200二抗的PBS中，4℃孵育4-12小時(shí)。使用該方法可獲得清晰的熒光信號(hào)圖譜，清楚觀測(cè)到胚胎及幼蟲階段的神經(jīng)發(fā)育過(guò)程，為揭示厚殼貽貝浮游幼蟲的附著變態(tài)機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。
文檔編號(hào)G01N33/68GK103076457SQ201310008239
公開日2013年5月1日 申請(qǐng)日期2013年1月10日 優(yōu)先權(quán)日2013年1月10日
發(fā)明者楊金龍, 李樹恒, 梁簫, 李家樂 申請(qǐng)人:上海海洋大學(xué)