專利名稱：一株生產(chǎn)纖維素降解酶的綠色木霉及其在城市綠化廢棄物降解中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于微生物技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種綠色木霉菌；另外本發(fā)明還涉及該綠色木霉菌的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
纖維素是自然界中存量最大的一類可再生資源，以秸稈為例，全世界每年產(chǎn)農(nóng)作物秸稈約1000 2000億噸，然而僅有幾億噸纖維素被人類利用。我國(guó)是一個(gè)農(nóng)業(yè)大國(guó)，據(jù)粗略統(tǒng)計(jì)，我國(guó)每年產(chǎn)生農(nóng)作物秸稈約7億噸。由于纖維素中存在許多高能氫鍵，因此其水解、利用較困難，大部分的纖維素類物質(zhì)都被棄置。大量的纖維素只有一小部分用于紡織、 飼料和造紙等方面；絕大多數(shù)用作燃料或通過(guò)微生物的自然分解回到自然界的碳循環(huán)中。 這些農(nóng)用廢棄物資源不僅沒(méi)有得到充分利用，其焚燒又對(duì)環(huán)境造成了污染。因此合理開(kāi)發(fā)和科學(xué)利用這一豐厚的天然資源已成為研究開(kāi)發(fā)的一個(gè)重點(diǎn)領(lǐng)域。雖然秸稈等農(nóng)用廢棄物的利用收到普遍重視，城市綠化廢棄物的生物轉(zhuǎn)化還沒(méi)有得到足夠的關(guān)注。近幾年來(lái)隨著城市化的規(guī)模逐步擴(kuò)大，以及城市綠化的不斷發(fā)展，城市綠化廢棄物已經(jīng)成為城市垃圾的重要組成部分，據(jù)報(bào)道，南京市每天可產(chǎn)400噸左右的落葉， 青島市每天要產(chǎn)生600多噸落葉。如何處理這些綠化廢棄物，并且不污染環(huán)境等問(wèn)題亟待解決?？萑~等綠化廢棄物多被運(yùn)到垃圾場(chǎng)焚燒或者埋掉，而垃圾焚燒后會(huì)產(chǎn)生大量浮塵和致癌物質(zhì)，嚴(yán)重影響環(huán)境衛(wèi)生和居民健康。另一方面，落葉和草坪草含有豐富的纖維素成分，可作為可再生資源用于生物能源的生產(chǎn)，解決我國(guó)生物能源生產(chǎn)資源短缺的問(wèn)題。有學(xué)者分別研究了木霉對(duì)落葉的降解和曲霉對(duì)枯草的降解，但二者研究的只是物料的降解，存在降解時(shí)間長(zhǎng)，還原糖低等問(wèn)題， 另外，也沒(méi)有考慮降解菌在降解落葉和草坪草后的處理，以及原料的預(yù)處理技術(shù)。利用高溫濕解草坪草的技術(shù)也有報(bào)道，但該工藝需要特殊的設(shè)備，加熱溫度高達(dá)480°C，耗能較多，而生物處理?xiàng)l件溫和，更容易操作。綠色木霉菌是近年來(lái)逐漸受到普遍關(guān)注的可用于治理廢棄農(nóng)作物污染及纖維素酶高產(chǎn)菌株的木酶菌，該屬細(xì)菌可降解多種農(nóng)用廢棄物，包括玉米芯、玉米秸稈、稻草等，但國(guó)內(nèi)對(duì)綠色木霉的研究還不夠深入，對(duì)其應(yīng)用研究也較少。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一株生產(chǎn)纖維素降解酶的綠色木霉，該菌株可在微晶纖維素、羧甲基纖維素鈉、玉米秸稈等纖維素為唯一碳源的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，所產(chǎn)生的發(fā)酵液具有降解纖維素的能力。本發(fā)明的另一目的是一株生產(chǎn)纖維素降解酶的綠色木霉在城市綠化廢棄物降解中的應(yīng)用，開(kāi)發(fā)高效處理城市綠化廢棄物的工藝，一方面減少環(huán)境污染和垃圾處理負(fù)擔(dān)，另一方面提高處理效率，并獲得高含量的還原糖。本發(fā)明一株高產(chǎn)纖維素酶的綠色木霉菌株，該菌株為木霉屬中的綠色木霉Trichoderma viride，編號(hào)M20，2011年4月2日保藏于中國(guó)普通微生物菌種保藏中心，保藏號(hào)為 CGMCC No. 4732。所述的綠色木霉菌M20屬于半知菌門，絲孢目，2009年于山西秸稈土壤堆積下面土壤中分離，提取綠色木霉菌M20基因組DNA，以ITS通用引物(正向引物ITS1: 5， -TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3，，反向引物 ITS4: 5， -CCTCCGCTTATTGATATGC-3，)進(jìn)行 PCR擴(kuò)增，對(duì)序列進(jìn)行Blastn同源比對(duì)，其與Trichoderma viride (GenBank登錄號(hào) ⑶325689. 1)具有較高的相似性(99%)，因此命名為綠色木霉菌。所述M20 的 ITS 序列5，-AGGAATACGAGCATTTCAGCTCCCAAACCCAATGTGAACCATACCA AACTGTTGCCTCGGCGGGGTCACGCCCCGGGTGCGTCGCAGCCCCGGAACCAGGCGCCCGCCGGAGGGACCAACCAA ACTCTTTTCTGTAGTCCCCTCGCGGACGTTATTTCTTACAGCTCTGAGCAAAAATTCAAAATGAATCAAAACTTTCA ACAACGGATCTCTTGGTTCTGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGT GAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCGCCAGTATTCTGGCGGGCATGCCTGTCCGAGCGTCATTTCAAC CCTCGAACCCCTCCGGGGGGTCGGCGTTGGGGACCTCGGGAGCCCCTAAGACGGGATCCCGGCCCCGAAATACAGTG GCGGTCTCGCCGCAGCCTCTCCTGCGCAGTAGTTTGCACAACTCGCACCGGGAGCGCGGCGCGTCCACGTCCGTAA AACACCCAACTTCTGAAATGTTGACCTCGGATCAGGTAGGAATACCCGCTGAACTTAAGCATATCAMAGCGGGAGGA A-3，。所述綠色木霉菌培養(yǎng)方法平板活化，M20在PDA平板上生長(zhǎng)，PDA平板配制方法 200g馬鈴薯去皮，切成塊，煮沸30分鐘，后用紗布過(guò)濾取濾汁，然后加1%葡萄糖，2%瓊脂， 然后定容至1升，培養(yǎng)溫度和時(shí)間30°C，3 5天；
孢子剛剛長(zhǎng)出時(shí)，用1000 μ L的槍頭尾圓端取4塊菌落接種于種子培養(yǎng)基中，進(jìn)入種子
培養(yǎng)；
其中種子培養(yǎng)基玉米粉(40目)3g豆餅粉1. 5g MgSO4WH2O 0. 05g K2HPO4 0. 2g, 水100ml，pH自然，每瓶250ml的瓶子裝培養(yǎng)基50毫升； M20種子培養(yǎng)時(shí)間2天，搖床轉(zhuǎn)速150rpm，搖床溫度30°C。液體產(chǎn)酶培養(yǎng)利用前述無(wú)機(jī)鹽產(chǎn)酶培養(yǎng)基，種子培養(yǎng)2天后，取種子液1 2ml 于發(fā)酵培養(yǎng)基中，搖床轉(zhuǎn)速為150rpm，搖床溫度30°C，初始發(fā)酵培養(yǎng)基pH 6. 0為最佳。所述綠色木霉菌M20發(fā)酵液在落葉、草坪草等城市綠化廢棄物降解中的應(yīng)用。所述綠色木霉菌M20作為纖維素生產(chǎn)菌的應(yīng)用，利用M20水解落葉和草坪草獲得還原糖的方法具體為A，菌種種子制備；B，纖維素酶液體深層發(fā)酵；C，落葉及草坪草預(yù)處理及水解；D，還原糖的獲得。本發(fā)明綠色木霉菌M20的菌落在固體培養(yǎng)基上為圓形，菌落開(kāi)始為白色，經(jīng)過(guò)3 5天菌落從中心處生長(zhǎng)出綠色孢子，經(jīng)過(guò)一周左右菌落完全變成綠色，與文獻(xiàn)報(bào)道的類似。 該菌株可在微晶纖維素、羧甲基纖維素鈉、玉米秸稈、玉米芯等纖維素為唯一碳源的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，在以木聚糖為唯一碳源的平板上也生長(zhǎng)良好。本發(fā)明有關(guān)分離自山西秸稈堆積處土壤樣品的一株綠色木霉菌，其對(duì)落葉和草坪草具有較好的水解能力，顯示了其利用廢棄落葉及綠化垃圾等生產(chǎn)單細(xì)胞蛋白和燃料乙醇，解決當(dāng)前人類面臨的能源和資源短缺，以及綠化廢棄物焚燒帶來(lái)的環(huán)境污染等一系列棘手問(wèn)題的重要應(yīng)用。


圖1是M20在不同濃度微晶纖維素中纖維素酶活力圖； 圖2是未用稀酸處理過(guò)樹(shù)葉酶解結(jié)果圖； 圖3是稀酸處理過(guò)的樹(shù)葉酶解結(jié)果圖； 圖4是未用稀酸處理過(guò)的草坪草酶解結(jié)果圖； 圖5是用稀酸處理過(guò)的草坪草酶解結(jié)果圖。
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明，但本發(fā)明并不局限于具體實(shí)施例。實(shí)施例1
綠色木霉菌M20屬于半知菌門，絲孢目，2009年于山西秸稈土壤堆積下面土壤中分離， 該菌株在PDA固體培養(yǎng)基上生長(zhǎng)良好，培養(yǎng)溫度30 °C，培養(yǎng)3-5天可獲得成熟綠色孢子。 PDA平板配制方法200g馬鈴薯去皮，切成塊，煮沸30分鐘，后用紗布過(guò)濾取濾汁，然后加 1%葡萄糖，洲瓊脂，然后定容至1升，PH自然。提取綠色木霉菌M20基因組DNA，以ITS通用引物(正向引物ITSl 5，-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3，，反向引物 ITS4 5，-CCTCCGCTTATTGATATGC-3，)進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增，對(duì)序列進(jìn)行Blastn同源比對(duì)，其與Trichodenm viride具有較高的相似性(99%)，因此命名為綠色木霉菌。Trichoderma Wriife，編號(hào)M20，2011年4月2日保藏于中國(guó)普通微生物菌種保藏中心，保藏號(hào)為CGMCC NO. 4732。綠色木霉菌M20可以0. 1 的微晶纖維素、羧甲基纖維素鈉、落葉、草坪草、玉米秸稈等為唯一碳源生長(zhǎng)，因此可用于降解城市綠化廢棄物。實(shí)施例2:
綠色木霉菌M20在不添加任何無(wú)機(jī)鹽情況下，在m落葉和草坪草的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，并促進(jìn)落葉和草坪草分解，因此可有效用于城市綠化廢棄物的處理。實(shí)施例3
綠色木霉菌M20在無(wú)機(jī)鹽產(chǎn)酶培養(yǎng)基中進(jìn)行液體深層發(fā)酵，培養(yǎng)基成分為0. 05% (NH4)2SO4, 0. 05% L-天冬氨酸，0.1% KH2PO4，0. 05% KCl, 0. 041% MgSO4 7H20, 0. 01% CaCl2, 0.05%酵母粉，0.19Γ4%纖維素，其中纖維素包括微晶纖維素、稻草粉、玉米芯粉、 秸稈粉、麩等。Μ20以微晶纖維素誘導(dǎo)所產(chǎn)生的纖維素酶活力最高。以0. 1,0. 2，0. 3,0. 4， 0.5,1, 1.5,2, 2.5，3，3.5，4 %微晶纖維素為唯一碳源生長(zhǎng)，可產(chǎn)生纖維素酶，其中除 0. 5%與1%微晶纖維素組測(cè)得纖維素酶濾紙酶活較大以外，其他實(shí)驗(yàn)組均比較小。較低的微晶纖維素需要量可以降低產(chǎn)纖維素酶的成本。纖維素酶測(cè)定方法準(zhǔn)確稱取Whatman濾紙 (Cat No. 1001 110) 50mg (規(guī)格為1 X6cm)，將其卷曲成一團(tuán)放入25ml的比色管中，加入 8000rpm離心5min的發(fā)酵液上清液0.5 ml至25ml比色管中，再加入pH為4. 8的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液Iml將濾紙團(tuán)浸沒(méi)，50°C水浴Ih，立即加入:3ml DNS煮沸5min， 540nm處測(cè)吸光度，算出還原糖含量。酶活單位定義為每分鐘生成1. 0 μπιο 葡萄糖(以還原糖計(jì))所需的酶量為1單位，用IU · πιΓ1表示。表1為不同碳源下纖維素酶活力比較，圖1為不同濃度微晶纖維素下纖維素酶活力的比較，可見(jiàn)微晶纖維素是最佳碳源，秸稈粉為比較好的天然底物。表1 M20在不同纖維素為唯一碳源的培養(yǎng)基中產(chǎn)生的纖維素酶活力
權(quán)利要求
1.一株高產(chǎn)纖維素酶的綠色木霉菌株，該菌株為木霉屬中的綠色木霉，編號(hào)M20，2011 年4月2日保藏于中國(guó)普通微生物菌種保藏中心，保藏號(hào)為CGMCC No. 4732。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一株高產(chǎn)纖維素酶的綠色木霉菌株，其特征是所述的綠色木霉菌M20屬于半知菌門，絲孢目，2009年于山西秸稈土壤堆積下面土壤中分離，提取綠色木霉菌M20基因組DNA，以ITS通用引物(正向引物ITSl 5，-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3，， 反向引物ITS4: 5，-CCTCCGCTTATTGATATGC-3，)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，對(duì)序列進(jìn)行Blastn同源比對(duì)，其與綠色木霉具有較高的相似性。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一株高產(chǎn)纖維素酶的綠色木霉菌株，其特征是所述M20的 ITS 序列5’ -AGGAATACGAGCATTTCAGCTCCCAAACCCAATGTGAACCATACCAAACTGTTGCCTCGGCGGG GTCACGCCCCGGGTGCGTCGCAGCCCCGGAACCAGGCGCCCGCCGGAGGGACCAACCAAACTCTTTTCTGTAGTCCC CTCGCGGACGTTATTTCTTACAGCTCTGAGCAAAAATTCAAAATGAATCAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTT CTGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGA ACGCACATTGCGCCCGCCAGTATTCTGGCGGGCATGCCTGTCCGAGCGTCATTTCAACCCTCGAACCCCTCCGGGGG GTCGGCGTTGGGGACCTCGGGAGCCCCTAAGACGGGATCCCGGCCCCGAAATACAGTGGCGGTCTCGCCGCAGCCTC TCCTGCGCAGTAGTTTGCACAACTCGCACCGGGAGCGCGGCGCGTCCACGTCCGTAAAACACCCAACTTCTGAAATG TTGACCTCGGATCAGGTAGGAATACCCGCTGAACTTAAGCATATCAAAAGCGGGAGGAA-3'o
4.權(quán)利要求1一 3任一所述的一株高產(chǎn)纖維素酶的綠色木霉菌株的培養(yǎng)方法，其特征是平板活化，M20在PDA平板上生長(zhǎng)，PDA平板配制方法200g馬鈴薯去皮，切成塊，煮沸 30分鐘，后用紗布過(guò)濾取濾汁，然后加1%葡萄糖，洲瓊脂，然后定容至1升，培養(yǎng)溫度和時(shí)間為30°C，3 5天；綠色孢子剛剛長(zhǎng)出時(shí)，用1000 μ L的槍頭尾圓端取4塊菌落接種于種子培養(yǎng)基中，進(jìn)入種子培養(yǎng)；其中種子培養(yǎng)基玉米粉(40目)3g，豆餅粉1.5g，MgS04*7H20 0. 05g, K2HPO4 0. 2g, 水100ml，pH自然，每瓶250ml的瓶子裝培養(yǎng)基50毫升；M20種子培養(yǎng)時(shí)間2天，搖床轉(zhuǎn)速150rpm，搖床溫度30°C ；液體產(chǎn)酶培養(yǎng)種子培養(yǎng)結(jié)束后，取種子液1 2ml于產(chǎn)酶培養(yǎng)基中，產(chǎn)酶培養(yǎng)基配方為(NH4) 2S04 0. 5g,蛋白胨 0. 5g, KH2PO4 lg, KCl 0. 5g, MgSO4. 7H20 0. 5g, CaCl2, 0. lg,酵母粉0. 5g，微晶纖維素5g，水1000 ml, pH 6.0，搖床轉(zhuǎn)速為150 rpm，搖床溫度 30°C，發(fā)酵培養(yǎng)7天。
5.根據(jù)權(quán)利要求1一 3任一所述一株高產(chǎn)纖維素酶的綠色木霉菌株發(fā)酵液在落葉、草坪草等城市綠化廢棄物降解中的應(yīng)用。
6.根據(jù)權(quán)利要求1一 3任一所述一株高產(chǎn)纖維素酶的綠色木霉菌株作為纖維素生產(chǎn)菌的應(yīng)用，利用M20水解落葉和草坪草獲得還原糖的方法具體為A，菌種種子制備；B，纖維素酶液體深層發(fā)酵；C，落葉及草坪草預(yù)處理及水解；D，還原糖的獲得。
全文摘要
本發(fā)明屬于微生物技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種綠色木霉菌；另外本發(fā)明還涉及該綠色木霉菌的應(yīng)用。一株高產(chǎn)纖維素酶的綠色木霉菌株，該菌株為木霉屬中的綠色木霉Trichodermaviride，編號(hào)M20，2011年4月2日保藏于中國(guó)普通微生物菌種保藏中心，保藏號(hào)為CGMCCNo.4732。本發(fā)明菌株可以多種纖維素類化合物為唯一碳源生長(zhǎng)，包括羧甲基纖維素鈉、微晶纖維素、玉米秸稈、玉米芯、落葉、草坪草等。本技術(shù)發(fā)明涉及的綠色木霉可分泌多種纖維素水解酶類，可用于處理城市綠化廢棄物，在較短時(shí)間內(nèi)獲得較高的還原糖，所獲得的糖可用于單細(xì)胞蛋白的生產(chǎn)，還可以用于生產(chǎn)燃料乙醇，對(duì)于解決當(dāng)前人類面臨的能源短缺和環(huán)境污染等一系列棘手問(wèn)題具有重要意義。
文檔編號(hào)B09B3/00GK102559508SQ20111023543
公開(kāi)日2012年7月11日 申請(qǐng)日期2011年8月17日 優(yōu)先權(quán)日2011年8月17日
發(fā)明者孫鴻金, 白鳳武, 趙心清 申請(qǐng)人:大連理工大學(xué)