專利名稱：用于聯(lián)合檢測三種發(fā)熱伴出疹病毒的液相芯片非診斷性方法及其制備方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種可同時檢測腸道病毒71 (Enterovirus 71 )、柯薩奇病毒A組16(Coxsackievirus A 16)和麻疫病毒(Measles virus)的液相芯片非診斷性方法以及對其液相芯片的制備方法和應用。
背景技術：
發(fā)熱伴出疹癥候群是以發(fā)熱、出疹為主要癥狀，同時伴有其他臨床癥狀的一組疾病。常見的病原體包括腸道病毒71 (Enterovirus 71，EV71)、柯薩奇病毒A組16(Coxsackievirus A 16, CA16)、麻疫病毒(Measles virus, MV)、風疫病毒、登革病毒等。其中，EV71和CA16分別是導致重癥和輕癥手足口病的主要病原體，麻疹病毒是麻疹的主要病原體。這類疾病在潛伏期時就具有傳染性。因此，在疾病的早期開展對該癥候群病原的篩 查，對隨后的隔離、采取相應的防控措施等具有指導意義。聚合酶鏈式反應(polymerase chain reaction)簡稱PCR,是一種模擬天然DNA復制的體外擴增法。PCR技術的問世給分子診斷帶來一場革命。PCR技術已經(jīng)成為分子診斷的基礎。目前PCR產(chǎn)物的檢測方法為瓊脂糖凝膠電泳檢測，瓊脂糖凝膠僅約可區(qū)分相差IOObp的DNA片段。片段長度相差不大或者相等的PCR產(chǎn)物，瓊脂糖凝膠電泳將無能無力。另外，瓊脂糖凝膠電泳通過紫外光激發(fā)熒光染料產(chǎn)生熒光來判斷是否存在PCR產(chǎn)物，檢測靈敏度相對較低。且瓊脂糖凝膠電泳通過片段的大小對產(chǎn)物進行判斷，特異性差，對非特異擴增的大小相似的片段不能區(qū)分。而且常用的染料如溴化乙錠等具有致癌性，常操作對身體健康不利。液相芯片(liquid chip),也稱懸浮芯片(suspension array),是一種非常靈活的多功能檢測技術平臺，可以進行蛋白、核酸等生物大分子檢測、受體和配體識別分析等研究。液相芯片主要通過偶聯(lián)探針的熒光編碼微球與兩束激光檢測，對被測物定性和定量分析，一個反應孔內(nèi)可以完成100種不同的生物學反應?？蓪崿F(xiàn)對核酸的多重檢測。

發(fā)明內(nèi)容
針對現(xiàn)有技術存在的問題，本發(fā)明的目的在于提供一種檢測靈敏度高，特異性好，尤其適用于多重PCR產(chǎn)物相似長度片段不易區(qū)分，且理論上可對100種不同的PCR產(chǎn)物進行區(qū)分，實現(xiàn)100種不同因子的多重檢測?，F(xiàn)有的病原檢測技術受限于多重檢測能力的困境，而許多可疑樣本需要進行多病原的篩查，本發(fā)明的目的是通過提供一種聯(lián)合檢測三種病毒的液相芯片非診斷方法及其制備方法和應用，為三種發(fā)熱伴出疹病原的快速檢測提供一種靈敏、特異、快速、可靠的方法。本發(fā)明采用的技術方案是選擇三種病毒的特異基因片段，設計針對三種病毒的特異性引物；然后設計位于擴增區(qū)域內(nèi)的三種病毒的特異性探針，探針偶聯(lián)不同編號的編碼微球，制備建立出可對以上三種病毒同時檢測的液相芯片方法，在應用時，首先使用上述引物對三種病毒進行多重PCR擴增產(chǎn)物，與偶聯(lián)有探針的編碼微球結合，再與鏈親和素-藻紅蛋白(SA-PE)反應,之后通過懸浮芯片檢測系統(tǒng)(如Luminex 100, Luminex 200,Bio-plex, Liquichip等),實現(xiàn)對三種發(fā)熱伴出疫病毒的一次性檢測。為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供一種用于聯(lián)合檢測三種發(fā)熱伴出疹病毒的液相芯片非診斷性方法，包括I)用帶有生物素標記的特異性引物進行三種發(fā)熱伴出疹病毒PCR擴增；2)偶聯(lián)有捕獲探針的編碼微球在一定的條件下捕獲探針特異的與帶有生物素標記的PCR產(chǎn)物結合；3)加入鏈霉親和素一藻紅蛋白與微球上捕獲的PCR產(chǎn)物上的生物素結合，利用懸浮芯片Luminex系統(tǒng)進行檢測，通過激發(fā)微球基質上的紅色分類熒光和微球表面經(jīng)特異性反應結合上的藻紅蛋白，對待檢測物進行定性和定量分析。
進一步，所述發(fā)熱伴出疹病毒包括腸道病毒71 (EV71)、柯薩奇病毒A組16(CA16)和麻疹病毒(MV)。進一步，所述EV 71、CA16和MV的引物序列為
權利要求
1.一種用于聯(lián)合檢測三種發(fā)熱伴出疹病毒的液相芯片非診斷性方法，其特征在于，該非診斷性方法包括 1)用帶有生物素標記的引物進行發(fā)熱伴出疹病毒多重PCR擴增； 2)偶聯(lián)有捕獲探針的編碼微球在一定的條件下，捕獲探針特異的與帶有生物素標記的PCR產(chǎn)物結合； 3)加入鏈霉親和素-藻紅蛋白與微球上捕獲的PCR產(chǎn)物上的生物素結合，利用懸浮芯片Luminex系統(tǒng)進行檢測，通過激發(fā)微球基質上的紅色分類熒光和微球表面經(jīng)特異性反應結合上的藻紅蛋白，對待檢測物進行定性和定量分析。
2.如權利要求I所述的非診斷性方法，其特征在于，所述發(fā)熱伴出疹病毒包括腸道病毒71、柯薩奇病毒A組16和麻疫病毒。
3.如權利要求2所述的非診斷性方法，其特征在于，所述腸道病毒71、柯薩奇病毒A組16和麻疹病毒的引物序列為
4.如權利要求3所述的非診斷性方法，其特征在于，所述引物序列中Reverse5’端加Biotin 標記。
5.如權利要求I所述的非診斷性方法，其特征在于，所述PCR擴增的反應體系為cDNA模板2ul，PCR預混液15ul，各病毒上下游引物(lOumol/L) Iul，去離子水補足30ul。反應條件5(TC 30min ；94°C 2min ；94°C 30s, 55°C 30s, 72°C 45s, 30 個循環(huán)；72°C IOmin0
6.一種用于聯(lián)合檢測三種發(fā)熱伴出疹病毒的液相芯片非診斷性方法其液相芯片的制備方法，該方法包括 1)根據(jù)待檢測的PCR產(chǎn)物，選擇設計位于擴增區(qū)域內(nèi)的特異的捕獲探針； 2)捕獲探針和互補探針合成； 3)相應的捕獲探針偶聯(lián)編碼微球； 4)捕獲探針偶聯(lián)微球的驗證。
7.如權利要求6所述的制備方法，其特征在于，所述EV71、CA16和MV的捕獲探針及其互補序列序列為
8.如權利要求7所述的，其特征在于，所述序列中每個probe5’端加12個C或20個T再加-NH2修飾；RC-probe 5，端加Biotin標記。
9.如權利要求6所述的液相芯片制備方法，其特征在于，所述步驟2)中探針與微球偶聯(lián)時的方法，包括以下步驟 a)分別選取不同編號的編碼微球，用漩渦振蕩器振蕩微球懸液，使微球混合均勻； b)分別取上述微球大約1.25X IO6個,分別轉移至離心管，14000g離心3 5min,小心吸出上清；c)加入50μ LO. ImoI/L的2-(η-嗎啉代)乙磺酸溶液，振蕩20 30S，超聲20 30s，使微球重懸； d)用蒸餾水將合成的寡核苷酸探針稀釋到O.lmmol/L ； e)將I 5μL稀釋的探針加于微球懸浮液中，振蕩混勻；f)加入2.5 μ L新鮮配制的10mg/mL的EDC溶液至微球與探針混和液中，振蕩混勻；g)用鋁箔包裹離心管避光，漩渦振蕩器上400 600rpm振蕩，室溫孵育30min； h)再次加入新鮮配制的10mg/mLEDC ； i)再次在漩渦振蕩器上400 600rpm振蕩，室溫避光孵育30min； j)用 0. 02%PBST Iml 洗滌 I 次，離心 14000g 3 5min ； k)移棄上清，微球重懸于Iml 0. 1%SDS中，洗滌，離心； I)移棄上清，微球重懸于IOOyL pH8. OTE中，振蕩懸起混勻，即得到偶聯(lián)好的檢測微球。
10.如權利要求6所述的制備方法，其特征在于，所述步驟4)中偶聯(lián)微球的驗證方法，包括以下步驟 1)取已經(jīng)偶聯(lián)好的檢測探針每種各3500個于雜交液中，使其總量為33μL，根據(jù)微球計數(shù)結果計算相應加入量；2)向各管中加5 17μ L帶有生物素標記的互補探針鏈，使其終體積為50 μ L，吹打混勻；3)92。。 95°C變性 IOmin ； 4)雜交溫度下雜交一定時間； 5)轉移至濾板抽濾去掉未結合的互補探針鏈； 6)再向各孔加75μ L 4ng/μ LSA-PE的I X TMAC液，室溫避光孵育lOmin，抽濾去掉未結合的SA-PE ； 7)再向各孔加入75μ LI X TMAC溶液，振蕩使微球重懸； 8)反應結束后，Luminexsystem進行檢測，通過激發(fā)微球基質上的紅色分類熒光，對微球的編號進行識別；通過激發(fā)微球表面的藻紅蛋白，讀取熒光強度MFI數(shù)值并分析數(shù)據(jù)； 9)結果判定空白對照MFI低于100，包被微球MFI大于2000的可使用；若包被微球MFI小于2000，則說明包被不成功。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種用于聯(lián)合檢測三種發(fā)熱伴出疹病毒的液相芯片非診斷性方法及其制備方法，包括用帶有生物素標記的引物進行發(fā)熱伴出疹病毒PCR擴增，根據(jù)PCR擴增區(qū)域內(nèi)的核苷酸序列設計特異性捕獲探針；捕獲探針分別與相應的編碼微球偶聯(lián)，該捕獲探針在一定的條件下特異的與PCR產(chǎn)物結合；加入鏈霉親和素-藻紅蛋白與微球上捕獲的PCR產(chǎn)物上的生物素結合，利用液相芯片Luminex系統(tǒng)進行檢測，通過激發(fā)微球基質上的紅色分類熒光和微球表面經(jīng)特異性反應結合上的藻紅蛋白，對待檢測物進行定性和定量分析。本發(fā)明檢測靈敏度高，特異性好。
文檔編號G01N21/64GK102876807SQ20121036528
公開日2013年1月16日 申請日期2012年9月26日 優(yōu)先權日2012年9月26日
發(fā)明者劉麗娟, 楊永莉, 王莎莎, 王靜 申請人:中國檢驗檢疫科學研究院