專利名稱：：風(fēng)疹病毒IgM抗體化學(xué)發(fā)光免疫分析測(cè)定試劑盒及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及免疫分析醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，具體地，本發(fā)明利用化學(xué)發(fā)光免疫分析與捕獲法原理相結(jié)合，提供了一種風(fēng)滲病毒IgM抗體化學(xué)發(fā)光免疫分析測(cè)定試劑盒及其制備方法。
背景技術(shù)：
：風(fēng)疹病毒屬于披膜病毒科，具單股正鏈RNA,直徑為60nm,僅有一個(gè)血清型。風(fēng)滲病毒的抗原結(jié)構(gòu)相當(dāng)穩(wěn)定，是一種最危險(xiǎn)的致畸因素。風(fēng)滲病毒與巨細(xì)胞病毒、弓形蟲病毒、皰滲病毒1型和2型共同命名為T0RCH。這五大病毒的共同危害是造成流產(chǎn)、早產(chǎn)、死胎、胎兒畸形、殘疾兒。妊娠期婦女感染風(fēng)滲病會(huì)造成胎兒損傷，如新生兒畸形、肝脾腫大、神經(jīng)發(fā)育障礙、先天性心臟病等。僥幸存活的新生兒?？砂l(fā)生生長(zhǎng)發(fā)育遲緩、白內(nèi)障、神經(jīng)性耳耷、先天性心臟病、腦膜腦炎、巨細(xì)胞肝炎、溶血性貧血、視力、聽(tīng)力障礙等。風(fēng)滲是由風(fēng)滲病毒引起的。80年代以來(lái)日本、美國(guó)、印度、墨西哥、澳大利亞等均有較大的流行。孕婦屬易感人群，一旦感染便可發(fā)生子宮內(nèi)感染致胎兒畸形及嚴(yán)重后遺癥，流產(chǎn)及死產(chǎn)率較正常妊娠高2倍-4倍。妊娠早期感染者致畸率為50%,中期為25%，末期為15%。因此，早期妊娠婦女若確診為風(fēng)疹病毒感染時(shí)應(yīng)行人工流產(chǎn)終止妊娠。風(fēng)疹最大的危害是母親在懷孕早期特別是頭三個(gè)月感染風(fēng)滲，造成流產(chǎn)、死產(chǎn)和新生兒先天性風(fēng)滲綜合征。風(fēng)滲在我國(guó)已列入法定報(bào)告的傳染病。風(fēng)疹病毒IgM主要用于診斷病毒的急性感染。成人及兒童感染風(fēng)滲毒會(huì)引起皮滲，淋巴結(jié)腫大的癥狀。感染風(fēng)疹早期產(chǎn)生抗體為IgM抗體，因此，早期妊娠婦女風(fēng)滲IgM抗體陽(yáng)性時(shí)應(yīng)行人工流產(chǎn)終止妊娠。檢測(cè)風(fēng)滲IgM抗體至關(guān)重要，而孕婦屬易感人群，孕期檢查主要檢查孕婦血中的IgM抗體。故風(fēng)滲抗體檢查被列入婚前檢查常規(guī)項(xiàng)目。先天性風(fēng)滲患兒和初次感染風(fēng)疹者體內(nèi)特異性IgM抗體滴度高，持續(xù)時(shí)間較長(zhǎng)，風(fēng)發(fā)再次感染者體內(nèi)也能查到IgM抗體，但滴度低，持續(xù)時(shí)間較短。因此，IgM抗體的檢測(cè)有助于診斷早期風(fēng)滲病毒的感染。當(dāng)前檢測(cè)風(fēng)滲病毒的診斷技術(shù)有金標(biāo)、ELISA、PCR等方法。金標(biāo)方法操作簡(jiǎn)單、快速，但肉眼觀察有一定誤差，準(zhǔn)確率低；PCR具有靈敏度極高的特點(diǎn)，直接檢測(cè)病原體基因，但操作繁瑣、需要先進(jìn)的儀器設(shè)備和較高的費(fèi)用，不適用于基層推廣；而ELISA檢測(cè)，目前臨床應(yīng)用普遍，但大多為間接法測(cè)定IgM抗體，受血清標(biāo)本中IgG、RF的干擾，必須先將標(biāo)本用A蛋白或抗IgG抗體處理，這樣不但測(cè)定較為繁瑣，而且影響測(cè)定的特異性和靈敏度，容易導(dǎo)致假陽(yáng)性或假陰性結(jié)果。以上檢測(cè)技術(shù)，均有其特定的優(yōu)缺點(diǎn)，而本發(fā)明利用捕獲法檢測(cè)IgM抗體，克服了血清標(biāo)本中IgG、RF的干擾，提高了靈敏度與特異性，使操作更簡(jiǎn)便快速?；瘜W(xué)發(fā)光免疫分析法是目前發(fā)展和推廣應(yīng)用最快的免疫分析方法，也是目前較先進(jìn)的標(biāo)記免疫測(cè)定技術(shù)，具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、試劑價(jià)格低廉、試劑穩(wěn)定且有效期長(zhǎng)、方法穩(wěn)定快速、檢測(cè)范圍寬、操作簡(jiǎn)單自動(dòng)化程度高等優(yōu)點(diǎn)，正逐漸替代傳統(tǒng)的生物檢測(cè)技術(shù)。本發(fā)明的試劑盒采用微孔板化學(xué)發(fā)光免疫分析技術(shù)，既利用了化學(xué)發(fā)光免疫分析既可應(yīng)用于開(kāi)放式的半自動(dòng)化學(xué)發(fā)光測(cè)量?jī)x，也可用于全自動(dòng)的測(cè)量系統(tǒng)，可實(shí)現(xiàn)大批量快速檢測(cè)，為臨床診斷和科研工作提供一種非常有價(jià)值的檢測(cè)手段。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明克服了現(xiàn)有技術(shù)的不足，將化學(xué)發(fā)光免疫分析與捕獲法原理有效地結(jié)合，制備出一種靈敏高、特異性好、簡(jiǎn)便快速地檢測(cè)風(fēng)療IgM抗體的試劑盒，為我國(guó)風(fēng)滲IgM檢測(cè)提供一種新型的試劑盒及制備方法。本發(fā)明消除了間接法檢測(cè)血清標(biāo)本中IgG、RF的干擾，另外目前臨床應(yīng)用普遍的ELISA試劑盒中樣品一般為1:100或者1:1000稀釋，操作繁瑣，而本發(fā)明樣品為1:IO稀釋，大大節(jié)約了時(shí)間與成本，操作更簡(jiǎn)便，可以較早地檢測(cè)出病人急性感染期風(fēng)滲IgM抗體，特別適合廣大的中小醫(yī)院推廣使用。本發(fā)明的目的是提供一種檢測(cè)風(fēng)疹I(lǐng)gM抗體的試劑盒及其制備方法。本發(fā)明的試劑盒包括陰、陽(yáng)性對(duì)照，抗人IgMju鏈包被的微孔板，中和抗原，堿性磷酸酶標(biāo)記風(fēng)滲單抗，樣品稀釋液，濃縮洗滌液及化學(xué)發(fā)光底物。本發(fā)明試劑盒是通過(guò)以下方案實(shí)現(xiàn)的1)以抗人IgMp鏈包被微孔板將0.02MpH值為4.2的PB緩沖液與適當(dāng)濃度的風(fēng)滲抗人IgMu鏈混合，并將混合液負(fù)載于固相載體上，封閉，抽濕干燥后用鋁箔袋密封。2)制備陰、陽(yáng)性對(duì)照將正常人血清用2%BSA的PBS緩沖液稀釋后制成陰性對(duì)照；將風(fēng)滲IgM陽(yáng)性血清經(jīng)2%BSA的PBS緩沖液按一定比例稀釋后制成陽(yáng)性對(duì)照。3)配制中和抗原用稀釋液將純化的風(fēng)滲抗原按一定濃度稀釋后配制而成。4)以堿性磷酸酶標(biāo)記風(fēng)滲單抗用戊二醛交聯(lián)法將風(fēng)滲單克隆抗體與堿性磷酸酶偶聯(lián)。5)配制樣品稀釋液:樣品稀釋液為含有0.5%BSA、0.1%甘油、0.1%吐溫-20、0.05%二巰基乙醇、0.1。/。Proclin300的0.02MpH值為7.4的磷酸鹽緩沖液。6)配制濃縮洗滌液濃縮洗滌液為20倍濃縮的Tris-HCl緩沖液，其包含2.4%Tris、,aCl、0,軀l、1.5%HC1、0."/。Proclin300，pH值為7.4。7)配制化學(xué)發(fā)光底物化學(xué)發(fā)光底物液為AMPPD溶液，其包含2.4%Tris、16%NaCl、0.45KC1、1.5節(jié)、20%AMPPD、0.l°/Proclin300,pH值為8.0~9.0。8)將上述各組分分裝后組裝為試劑盒。本發(fā)明試劑盒采用捕獲法檢測(cè)原理，克服了間接法測(cè)定IgM抗體時(shí)血清中IgG、RF的干擾，直接捕獲血清中特異性IgM抗體，繼而加入中和抗原與酶標(biāo)記的特異性單克隆抗體，再與化學(xué)發(fā)光底物作用，測(cè)值即與標(biāo)本中的風(fēng)滲IgM抗體呈正相關(guān)。此法常用于風(fēng)滲病毒急性感染的早期診斷。本試劑盒既具有化學(xué)發(fā)光免疫技術(shù)的高靈敏性，又采用了捕獲法不易受干擾的優(yōu)點(diǎn)，靈敏度、特異性、準(zhǔn)確性均有明顯的提高。具體實(shí)施例方式實(shí)施例1制備本發(fā)明的風(fēng)滲病毒IgM抗體化學(xué)發(fā)光免疫分析測(cè)定試劑盒本發(fā)明的風(fēng)滲病毒IgM抗體診斷試劑盒包括抗人IgM.u鏈包被微孔板(48孔或96孔)，陰、陽(yáng)性對(duì)照(各1瓶)，中和抗原(1瓶)，堿性磷酸酶標(biāo)記單抗(1瓶)，樣品稀釋液(1瓶)，濃縮洗滌液(1瓶)及化學(xué)發(fā)光底物(1瓶)。一、風(fēng)疹抗人IgMn鏈包被微孔板的制備(1)將抗人IgMia鏈加至0.02MpH值為4.2的PB緩沖液中混勻制成濃度為1:900的包被液，每孔100uL加至微孔板內(nèi)，37。C過(guò)夜；具體地，所述PB緩沖液配制方法為磷酸二氫鈉0.78g純化水定容至1000mL，用NaOH調(diào)pH至4.2(2)甩干包被液后，每孔加入封閉液200uL，4'C過(guò)夜，甩掉封閉液，拍干；室溫除濕干燥18-24小時(shí)，然后用鋁箔袋密封。二、中和抗原的制備將純化的風(fēng)滲病毒抗原，用稀釋液按l:800稀釋。具體地，所述稀釋液配制方法為BSA2gTritonX-lOOlmLProclin300lmL指示劑0.lmL0.01M的磷酸鹽緩沖液定容至lOOOmL，調(diào)pH至7.2三、堿性磷酸酶標(biāo)記風(fēng)滲單抗的制備用戊二醛交聯(lián)法將風(fēng)滲特異性單克隆抗體與堿性磷酸酶偶聯(lián)在一起，對(duì)PBS充分透析，加等體積甘油，-20。C以下保存。使用時(shí)，用Tris酶稀釋液按l:1200稀釋。具體地，所述Tris酶稀釋液配制方法為NaCl8.8gBSA10gProclin300lml食品紅0.lml純化水定容至lOOOmL,用HC1調(diào)pH至7.5四、陰、陽(yáng)性對(duì)照的制備陰性對(duì)照為健康人陰性血清過(guò)濾除菌后用含有2%BSA的PBS緩沖液稀釋后的溶液；陽(yáng)性對(duì)照為風(fēng)滲IgM抗體陽(yáng)性人血清過(guò)濾除菌并且滅活后，用含有2%BSA的PBS緩沖液按l:400稀釋后的溶液。五、樣品稀釋液的制備BSA5g甘油lmL吐溫-20lmL二巰基乙醇0.5mLProclin300lmL指示劑0.lmL0.02M的磷酸鹽緩沖液定容到1000mL，調(diào)PH至7.4六、濃縮洗滌液的制備Tris24gNaCl160gKC14gHC115mLProclin300lmL去離子水定容至lOOOmL,調(diào)整pH至7.4使用時(shí)用去離子水20倍稀釋七、化學(xué)發(fā)光底物的制備Tris24gNaCl160gKC14gHC115mLAMPPD200mLProclin300lmL去離子水定容至lOOOmL,調(diào)pH至8.0~9.0八、半成品及成品組成上述步驟所得產(chǎn)品分裝即為半成品，均4。C保存，發(fā)光底物需4'C避光保存。經(jīng)檢定合格后組裝成風(fēng)滲病毒IgM抗體測(cè)定試劑盒(化學(xué)發(fā)光法)。實(shí)施例2本發(fā)明的試劑盒的使用方法1)自4'C冰箱中取出試劑盒，室溫平衡15分鐘；2)將試劑盒提供的濃縮洗滌液用去離子水稀釋20倍；3)加樣設(shè)陰性對(duì)照3孔，陽(yáng)性對(duì)照2孔，分別加入陰、陽(yáng)對(duì)照100uL。將樣品稀釋液加于樣品孔內(nèi)100uL，再加入待測(cè)血清10uL，每次實(shí)驗(yàn)設(shè)空白l孔，用微量震蕩器充分振蕩混勻，貼上封板膜，置37。C溫育30分鐘；4)洗板用全自動(dòng)洗板機(jī)或手工洗板5次，每孔400uL,最后在干凈的吸水紙上扣千；5)加中和抗原與酶標(biāo)記物除空白孔外，每孔分別加入中和抗原與酶標(biāo)記物各50uL，用微量震蕩器充分振蕩混勻，貼上封板膜，置37。C溫育30分鐘；6)洗叛方法同4);7)加底物每孔加化學(xué)發(fā)光底物液100uL，振蕩混勻，置室溫避光反應(yīng)5分鐘;8)測(cè)量必須于加化學(xué)發(fā)光底物液后的第5~30分鐘內(nèi)測(cè)量，在化學(xué)發(fā)光測(cè)量?jī)x上依序測(cè)量各孔的發(fā)光強(qiáng)度(RLU),測(cè)量時(shí)間1秒/孔；9)結(jié)果判定才艮據(jù)測(cè)定標(biāo)本(S)的RLU值與臨界值(CUT-OFF)的比值確定；臨界值(CUT-OFF)=2.1x陰性對(duì)照孔平均RLU值；若S/C0值^1,則為陽(yáng)性反應(yīng)，說(shuō)明樣本中含有風(fēng)滲IgM抗體；若S/CO值<1，則為陰性反應(yīng)，說(shuō)明樣本中不含有風(fēng)滲IgM抗體。實(shí)施例3本發(fā)明的試劑盒與ELISA試劑盒比較1、靈敏度將風(fēng)滲IgM抗體陽(yáng)性血清用樣品稀釋液進(jìn)行倍比稀釋后檢測(cè)，其結(jié)果見(jiàn)表1:表l兩種試劑盒靈敏度檢測(cè)結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>由表l可知，當(dāng)稀釋度為1:1280時(shí)，本發(fā)明仍可判斷為陽(yáng)性，而ELISA試劑盒只能檢測(cè)到l:320的稀釋度，可見(jiàn)本發(fā)明靈敏度較高。2、血清標(biāo)扣險(xiǎn)測(cè)本發(fā)明試劑盒與ELISA試劑盒同時(shí)檢測(cè)已確診的487例陰性血清標(biāo)本與52例風(fēng)滲IgM陽(yáng)性血清標(biāo)本，兩種試劑盒檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)下表2:表2兩種試劑盒血清標(biāo)本J險(xiǎn)測(cè)結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>從表2可以看出本發(fā)明試劑盒對(duì)陰性血清的檢出率為98.2%(478/487)，對(duì)陽(yáng)性血清的檢出率為98.1%(51/52);而ELISA試劑盒對(duì)陰性血清的檢出率為91.0%(443/487),對(duì)陽(yáng)性血清的檢出率為92.3%(48/52)?？梢?jiàn)本發(fā)明試劑盒對(duì)陰性血清和陽(yáng)性血清的檢出率明顯高于ELISA試劑盒，具有更高的臨床符合率。實(shí)施例4本發(fā)明試劑盒的交叉干擾試驗(yàn)本發(fā)明試劑盒對(duì)其類似物、干擾物血清進(jìn)行檢測(cè)，其中CMV-IgM陽(yáng)性血清12例、T0X-IgM陽(yáng)性血清14例、HSVl-IgM陽(yáng)性血清10例和HSV2-IgM陽(yáng)性血清9例，RF陽(yáng)性血清6例，檢測(cè)結(jié)果如下表3:表3本發(fā)明試劑盒對(duì)其類似物、干擾物檢測(cè)結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>從表3檢測(cè)結(jié)果，可以看出本試劑盒與其類似物無(wú)交叉，也不受RF因子的干擾,具有很好的特異性。實(shí)施例5本發(fā)明試劑盒穩(wěn)定性、重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果將試劑盒放置于37度孵箱內(nèi)7天，經(jīng)平衡后與4'C試劑對(duì)比試驗(yàn)，用4'C與37'C試劑盒分別做內(nèi)控品20孑L，測(cè)值結(jié)果為37。C試劑盒內(nèi)控品的測(cè)值較4。C內(nèi)控品下降8.2%,進(jìn)行3次重復(fù)試驗(yàn)，精密性(CV)為7.6%，表明本試劑盒具有極好的穩(wěn)定性和重復(fù)性。權(quán)利要求1.一種風(fēng)疹I(lǐng)gM抗體化學(xué)發(fā)光免疫分析測(cè)定試劑盒，包括陰、陽(yáng)性對(duì)照，抗人IgMμ鏈包被微孔板，中和抗原，樣品稀釋液，濃縮洗滌液，堿性磷酸酶標(biāo)記單抗以及化學(xué)發(fā)光底物。2、如權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述樣品稀釋液為含有0,5。/。BSA、1%甘油、1°/。吐溫-20、0.05%二巰基乙醇、1。/。Proclin300的0.02MpH值為7.4的磷酸鹽緩沖液。3、如權(quán)利要求"所述的試劑盒，jt特征在于，所述濃縮洗涂液為20倍濃縮的Tris-HCl緩沖液，其包含2.4%Tris、16%NaCl、0.4%KC1、1.5額、0.衡oclin300。4、如權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述化學(xué)發(fā)光底物為AMPPD、CSPD或CDP-Star。5、如權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述化學(xué)發(fā)光底物為溶液，其包含2.衞is、薩aCl、0.45KC1、L5節(jié)、20麵PPD、0.衡oclin300。6、一種制備權(quán)利要求1所述試劑盒的方法，其特征在于包括以下步驟配制陰、陽(yáng)性對(duì)照；以抗人IgMia鏈包被微孔板；配制中和抗原；配制樣品稀釋液；配制濃縮洗滌液；用堿性磷酸酶標(biāo)記風(fēng)滲單克隆抗體；配制上述酶的化學(xué)發(fā)光底物；分裝上述陰、陽(yáng)性對(duì)照、中和抗原、樣品稀釋液、濃縮洗滌液、酶標(biāo)記物和化學(xué)發(fā)光底物；以及組裝為成品。7、如權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，所述包被微孔板采用以下方法將0.PH值為《2的PB緩沖液與適當(dāng)濃度的風(fēng)滲抗人IgM/a鏈單抗混合，并將所得混合液負(fù)栽于固相栽體上；封閉，抽濕干燥后用鋁箔袋密封。8、如權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，所述中和抗原為含有0.2%BSA、0.l%TritonX-100、0.l%Proclin300的磷酸鹽緩沖液稀釋風(fēng)滲抗原純品所得的溶液。9、如權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，所述化學(xué)發(fā)光底物為AMPPD、CSPD或CDP—Star。全文摘要本發(fā)明運(yùn)用化學(xué)發(fā)光免疫分析與捕獲法相結(jié)合，提供一種風(fēng)疹I(lǐng)gM抗體測(cè)定試劑盒及其制備方法，試劑盒由陰、陽(yáng)性對(duì)照，抗人IgMμ鏈包被微孔板，中和抗原，樣品稀釋液，濃縮洗滌液，堿性磷酸酶標(biāo)記單抗以及化學(xué)發(fā)光底物組成。本發(fā)明試劑盒制備方法包括1)配制陰、陽(yáng)性對(duì)照；2)以抗人IgMμ鏈包被微孔板；3)配制中和抗原；4)配制樣品稀釋液；5)配制濃縮洗滌液；6)堿性磷酸酶標(biāo)記風(fēng)疹單抗；7)配制化學(xué)發(fā)光底物；8)分裝上述各組分及組裝為成品。本發(fā)明具有靈敏度高，特異性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，為血清學(xué)檢測(cè)、流行病學(xué)調(diào)查及臨床診斷提供了可靠的科學(xué)診斷依據(jù)，有助于優(yōu)生優(yōu)育。文檔編號(hào)G01N21/76GK101368960SQ200810103260公開(kāi)日2009年2月18日申請(qǐng)日期2008年4月2日優(yōu)先權(quán)日2008年4月2日發(fā)明者唐寶軍,宋勝利,應(yīng)希堂,坤張,胡國(guó)茂,趙娟娟申請(qǐng)人:北京科美東雅生物技術(shù)有限公司