專利名稱：熒光增白劑vbl檢測試劑盒及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種添加劑檢測技術(shù)，具體來說，特別是涉及一種用于熒光增白劑VBL含量的酶聯(lián)免疫檢測試劑盒及其制備方法。
背景技術(shù)：
熒光增白劑VBL(C. I.熒光增白劑85)，化學(xué)名稱為4，4’-雙[(4-羥乙胺基-6-苯胺基_1，3，5-二嗪-2-基)氨基]二苯乙烯-2，2’- 二橫酸鈉,屬二苯乙烯二嗪型增白劑，熒光強度為100%±5%，色光為青光微紫，易溶于水，中性，具有優(yōu)良的勻染性和滲染性，能提高物質(zhì)的白度和光澤，廣泛用于紙張、塑料制品、洗滌劑、紡織品等。長期以來，熒光增白劑的安全性頗受爭議，有資料顯示熒光增白劑是低毒的，也有資料顯示熒光增白劑的分子結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，不易被分解，在生物體內(nèi)長期累積，會使細(xì)胞發(fā)生變異，產(chǎn)生潛在的致癌因素。因此，在未充分評估熒光增白劑的安全性的情況下，并不是所有熒光增白劑都被允許使用，歐盟、美國、日本、中國等許多國家對熒光增白劑都有一定的監(jiān)管，相關(guān)法規(guī)如歐盟2002/72/EC指令、美國聯(lián)邦法規(guī)21CFR178. 3297和GB 9685-2008《食品容器、包裝材料用添加劑使用衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)》都制定了允許用于生產(chǎn)塑料食品接觸材料和制品的添加劑清單，對允許使用的熒光增白劑的最大添加量進行限制。鑒于此，建立相關(guān)產(chǎn)品的熒光增白劑的快速檢測方法，開展定期監(jiān)測和安全性評估，對于規(guī)范行業(yè)發(fā)展，保證產(chǎn)品質(zhì)量，保護消費者身體健康和保護環(huán)境等具有深遠的意義。而熒光增白劑VBL做為允許添加的熒光增白劑中的一種，也亟需一種合適的快速檢測方法。目前，國內(nèi)外對熒光增白劑的檢測方法包括以下幾種紫外燈直接照射觀測法、色譜法、色譜質(zhì)譜聯(lián)用法。其中，紫外燈直接照射觀測法只是一種簡單的判斷，不能鑒別熒光增白劑的種類；色譜法和色譜質(zhì)譜聯(lián)用法具有特異性高、結(jié)果準(zhǔn)確的優(yōu)點，但是這兩種方法的缺點是樣品前處理繁瑣，消耗大量溶劑，且需要昂貴的實驗室設(shè)備，檢測成本高。

發(fā)明內(nèi)容
基于此，本發(fā)明在于克服現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，提供一種熒光增白劑VBL檢測試劑盒和一種熒光增白劑VBL檢測試劑盒制備方法，該試劑盒在檢測熒光增白劑VBL時可一次連續(xù)檢測多個樣品，具有便捷，快速，靈敏、成本低的特點。本發(fā)明的第一個目的在于提供一種熒光增白劑VBL檢測試劑盒，其技術(shù)方案如下一種熒光增白劑VBL檢測試劑盒，主要包括I)包被熒光增白劑VBL特異性抗原的酶標(biāo)板所述酶標(biāo)板的每個微孔內(nèi)熒光增白劑VBL特異性抗原的濃度為1-3 μ g/mL ；2)熒光增白劑VBL特異性抗體溶液該熒光增白劑VBL特異性抗體的濃度為1-3 μ g/mL ；所述熒光增白劑VBL特異性抗原與熒光增白劑VBL特異性抗體溶液的用量比為I :
Io
在其中一個實施例中，所述熒光增白劑VBL檢測試劑盒還包括有酶標(biāo)二抗，所述酶標(biāo)二抗是濃度濃度按1:10000稀釋的辣根過氧化物酶標(biāo)記羊抗鼠二抗。在其中一個實施例中，所述熒光增白劑VBL特異性抗原的濃度為2μ g/mL ;所述熒光增白劑VBL特異性抗體的濃度為2 μ g/mL。在其中一個實施例中，所述熒光增白劑VBL檢測試劑盒還包括熒光增白劑VBL標(biāo)準(zhǔn)品溶液、底物顯色劑、洗滌液、終止液、封閉液和濃縮樣品稀釋液。
在其中一個實施例中，所述特異性熒光增白劑VBL特異性抗體是鼠源單克隆抗體；所述熒光增白劑VBL特異性抗原為熒光增白劑VBL與載體蛋白的偶聯(lián)物；所述載體蛋白為牛血清白蛋白、卵清蛋白、兔血清白蛋白、甲狀腺球蛋白中的一種；所述熒光增白劑 VBL 標(biāo)準(zhǔn)品溶液濃度分別為 I X IO5 μ g/L、I X IO4 μ g/L、I X IO3 μ g/L、I X IO2 μ g/L、IXIOiU g/L、I X 10° μ g/L ;所述顯色劑由顯色劑A和顯色劑B組成，所述顯色劑A為過氧化氫或過氧化脲，所述顯色劑B為鄰苯二胺或四甲基聯(lián)苯胺；所述終止液為l-2mol/L的硫酸溶液；所述洗滌液為含有O. 05%-0. 5%吐溫-20的O. 01M，pH7. 4的磷酸鹽緩沖液；所述封閉液為含5%脫脂奶粉的O. 01M，pH7. 4的磷酸鹽緩沖液；所述濃縮樣品稀釋液為O. 01M，pH7. 4的磷酸鹽緩沖液；所述酶標(biāo)板的材料為聚苯乙烯、聚乙烯、聚丙烯中的一種。本發(fā)明的第二個目的在于提供一種熒光增白劑VBL檢測試劑盒制備方法，主要包括以下步驟I)制備包被熒光增白劑VBL特異性抗原的酶標(biāo)板將熒光增白劑VBL和三乙胺分散于干燥二氯甲烷中，加入甲磺酰氯作為活化試劑進行反應(yīng)，使熒光增白劑VBL的醇羥基轉(zhuǎn)化成甲磺酯基；隨后將甲磺酯化對熒光增白劑VBL加入無水乙醇中，加入液氨反應(yīng)，制得能夠與蛋白質(zhì)偶聯(lián)的熒光增白劑VBL的半抗原；再將其與N-羥基丁二酰胺和碳二亞胺混合，再與牛血清白蛋白混合，偶聯(lián)制備得到熒光增白劑VBL特異性抗原；將熒光增白劑VBL特異性抗原包被于酶標(biāo)板中，所述酶標(biāo)板的每個微孔內(nèi)熒光增白劑VBL特異性抗原的濃度為 1-3 μ g/mL ；2)制備熒光增白劑VBL特異性抗體以步驟I中合成的熒光增白劑VBL特異性抗原作為免疫原對小鼠進行免疫；免疫后，取血清效價高的小鼠，取其脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞SP2/0進行細(xì)胞融合；采用有限稀釋法篩選雜交瘤細(xì)胞，得到完全同質(zhì)的單克隆抗體和穩(wěn)定的單克隆雜交瘤細(xì)胞株；并取不完全佐劑腹腔注射進行致敏后的小鼠，將雜交瘤細(xì)胞混懸液注射到小鼠腹腔中，收集腹水，經(jīng)辛酸-硫酸銨沉淀法進行腹水純化，得到純化的熒光增白劑VBL單克隆抗體；所述熒光增白劑VBL特異性抗體的濃度為1-3 μ g/mL。在其中一個實施例中，上述步驟I)中，制備熒光增白劑VBL特異性抗原的方法優(yōu)選為將熒光增白劑VBLO. 87g,和三乙胺I. Olg分散于IOOmL干燥二氯甲烷中，零攝氏度下加入O. 5mL甲磺酰氯作為活化試劑，室溫攪拌反應(yīng)，使熒光增白劑VBL的醇羥基轉(zhuǎn)化成甲磺酯基；隨后將甲磺酯化對熒光增白劑VBL加入無水乙醇中，加入20倍量的液氨，回流攪拌反應(yīng)，制得能夠與蛋白質(zhì)偶聯(lián)的熒光增白劑VBL的半抗原；再將其與N-羥基丁二酰胺(NHS)和碳二亞胺(EDC)混合，再與牛血清白蛋白混合，室溫攪拌，偶聯(lián)制備得到熒光增白劑VBL特異性抗原。在其中一個實施例中，上述步驟2)為以步驟I中合成的熒光增白劑VBL特異性抗原作為免疫原對10周齡的Balb/c小鼠進行免疫；首次免疫使用完全弗氏佐劑與熒光增白劑VBL特異性抗原溶液乳化，抗原濃度為O. 4mg/mL，劑量為120 μ g/只，以后每次加強免疫使用不完全弗氏佐劑與熒光增白劑VBL特異性抗原溶液乳化，劑量同初次免疫；初次免疫兩周后，每間隔10天加強免疫一次，共免疫5 10次，當(dāng)抗體效價不再升高時，進行最后一次免疫，最后一次不加免疫佐劑直接用熒光增白劑VBL特異性抗原溶液腹腔注射，劑量同初次免疫；尾部取血檢測血清效價，取血清效價高的小鼠，在無菌條件下，取其脾細(xì)胞按6:1比例與骨髓瘤細(xì)胞SP2/0進行細(xì)胞融合；采用有限稀釋法篩選雜交瘤細(xì)胞，得到完全同質(zhì)的單克隆抗體和穩(wěn)定的單克隆雜交瘤細(xì)胞株；并取Balb/C小鼠，于一周前采用不完全佐劑腹腔注射進行致敏，劑量為O. 5mL/只；將細(xì)胞濃度為I. 5萬/mL的雜交瘤細(xì)胞混懸液注射到小鼠腹腔中，劑量為O. 5mL/只；接種雜交瘤細(xì)胞7 10天后，收集腹水，反復(fù)收集數(shù)次；存于4°C冰箱保存；經(jīng)辛酸-硫酸銨沉淀法進行腹水純化，得到純化的熒光增白劑VBL單克隆抗體。本發(fā)明的熒光增白劑VBL檢測原理為將熒光增白劑VBL抗原吸附于固相載體上，加入樣品或熒光增白劑VBL的標(biāo)準(zhǔn)溶液及熒光增白劑VBL抗體工作液，待測樣品中熒光增白劑VBL和固相載體上包被的熒光增 白劑VBL抗原競爭結(jié)合熒光增白劑VBL抗體，孵育后，加入酶標(biāo)二抗進行酶活性的放大作用，孵育，顯色后終止，測定樣品的吸光度，該值與樣品中熒光增白劑VBL的量呈負(fù)相關(guān)，與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較即可得出熒光增白劑VBL濃度范圍。下面對前述技術(shù)方案的優(yōu)點進行說明本發(fā)明的熒光增白劑VBL檢測試劑盒，利用競爭酶聯(lián)免疫測定法檢測熒光增白劑VBL，具有特異性高，結(jié)果準(zhǔn)確且前處理簡單，對儀器設(shè)備要求低、檢測成本低的特點。同時，本試劑盒中的試劑以工作液形式提供，操作簡單、快捷，為使用者節(jié)省了時間并減少因步驟復(fù)雜造成的誤差。適合用于快速而準(zhǔn)確得檢測大批量樣品中的熒光增白劑VBL。
具體實施例方式下面對本發(fā)明的實施例進行詳細(xì)說明，但不對本發(fā)明的內(nèi)容造成任何限制。實施例I本實施例所述的熒光增白劑VBL檢測試劑盒的主要組成成份如下I)熒光增白劑VBL特異性抗原工作液；通過以下方法制得將熒光增白劑VBL0.87g，即I. Ommol和三乙胺I. Olg，即IOmmol分散于IOOmL干燥二氯甲燒中，零攝氏度下加入O. 5L,即6. 46mmol甲磺酰氯作為活化試劑，室溫攪拌反應(yīng)3. 5h，熒光增白劑VBL的醇羥基可轉(zhuǎn)化成甲磺酯基；隨后將甲磺酯化對熒光增白劑VBL加入無水乙醇中，加入20倍量的液氨，回流攪拌反應(yīng)5h，制得能夠與蛋白質(zhì)偶聯(lián)的熒光增白劑VBL的半抗原；再將其與N-羥基丁二酰胺(NHS)和碳二亞胺(EDC)混合，再與牛血清白蛋白混合，室溫攪拌lh，偶聯(lián)制備得到熒光增白劑VBL特異性抗原，并用濃縮樣品稀釋液稀釋至濃度為2 μ g/mL。2)熒光增白劑VBL特異性抗體工作液；通過以下方法制得將合成得到的熒光增白劑VBL特異性抗原作為免疫原對10周齡的Balb/c小鼠進行免疫。首次免疫使用完全弗氏佐劑與熒光增白劑VBL特異性抗原的磷酸鹽緩沖溶液(O. 01M, pH7. 4)乳化，抗原濃度為O. 4mg/mL，劑量為120 μ g/只，以后每次加強免疫使用不完全弗氏佐劑與熒光增白劑VBL特異性抗原的磷酸鹽緩沖溶液(O. OlM,PH7. 4)乳化，劑量同初次免疫。初次免疫兩周后，每間隔10天加強免疫一次，共免疫5 10次，當(dāng)抗體效價不再升高時，進行最后一次免疫，最后一次不加免疫佐劑直接用熒光增白劑VBL特異性抗原的磷酸鹽緩沖溶液(O. 01M, pH7. 4)腹腔注射，劑量同初次免疫。尾部取血檢測血清效價。取血清效價高的小鼠，在無菌條件下，取其脾細(xì)胞按6:1比例與骨髓瘤細(xì)胞SP2/0進行細(xì)胞融合。采用有限稀釋法篩選雜交瘤細(xì)胞，得到完全同質(zhì)的單克隆抗體和穩(wěn)定的單克隆雜交瘤細(xì)胞株。單克隆抗體的制備與純化Balb/C小鼠，于一周前采用不完全佐劑腹腔注射進行致敏，劑量為O. 5mL/只。將細(xì)胞濃度為I. 5萬/mL的雜交瘤細(xì)胞混懸液注射到小鼠腹腔中，劑量為O. 5mL/只。接種雜交瘤細(xì)胞疒10天后，收集腹水，反復(fù)收集數(shù)次。存于4°C冰箱保存。經(jīng)辛酸-硫酸銨沉淀法進行腹水純化。具體方法每I份腹水中加入3份乙酸鈉緩沖液(濃度O. 05mol/L, ρΗ4· 0)，用濃度O. lmmol/L NaOH調(diào)整pH值至4. 5，在4°C下攪拌30min,期間緩慢加入辛酸,按稀釋前腹水體積計算40 μ L/mL ;在4°C靜止3h,離心(10140r/ min, 30min)，取上清液，保持在4°C環(huán)境中，30min內(nèi)加入(NH4)2S04使其終濃度為O. 277g/mL,靜止lh,4°C離心(10140r/min, 30min),棄上清液,得到單克隆抗體沉淀，并用濃縮樣品稀釋液稀釋至濃度為2 μ g/mL。3)辣根過氧化物酶標(biāo)記羊抗鼠二抗；由商業(yè)公司提供的辣根過氧化物酶標(biāo)記羊抗鼠二抗；4)熒光增白劑VBL標(biāo)準(zhǔn)品溶液6瓶；濃度分別為IX IO5 μ g/L、I X IO4 μ g/L、I X IO3 μ g/L、I X IO2 μ g/L、IXlO1U g/L、
IX 10° μ g/L ；5)酶標(biāo)板；96孔聚苯乙烯酶標(biāo)板，由商業(yè)公司提供；6)底物顯色劑；由顯色劑A和顯色劑B組成，顯色劑A為濃度為30%的過氧化氫水溶液，顯色劑B為濃度為10mg/mL的四甲基聯(lián)苯胺DMSO溶液；7)洗滌液；為含有重量比為(λ 05%-0. 5%吐溫-20的(λ 01M, pH7. 4的磷酸鹽緩沖液；8)終止液；為2mol/L的硫酸溶液；9)封閉液；為含5%脫脂奶粉的O. 01M, pH7. 4的磷酸鹽緩沖液；10)濃縮樣品稀釋液；為O. 01M, pH7. 4的磷酸鹽緩沖液(即磷酸根濃度為O. 01M/L, pH7. 4的磷酸鹽緩沖液)；11)自封袋；由商業(yè)公司提供。實施例2間接競爭ELISA方法的建立。
采用間接競爭ELISA法檢測熒光增白劑85單克隆抗體的競爭抑制率，方法如下I)用2 μ g/mL的熒光增白劑VBL特異性抗原包被96孔酶標(biāo)板，100 μ L/孔，放置于4°C冰箱包被過夜，用300 μ L/孔封閉液(即5%脫脂奶粉)封閉后用洗滌液洗滌，并拍干；2)加入熒光增白劑VBL標(biāo)準(zhǔn)品溶液(濃度分別為lX105yg/LUX104yg/L,
1X IO3 μ g/L、I X IO2 μ g/L、I X IO1 μ g/L、I X 10° μ g/L)或樣品溶液 50 μ L，再加入濃度為
2μ g/mL的熒光增白劑VBL特異性抗體工作液50 μ L，混合均勻，37°C溫育Ih ；3)洗滌拍干后，加入用稀釋液按1:10000比例稀釋的辣根過氧化物酶標(biāo)記羊抗鼠二抗；100 μ L/ 孔，37°C溫育 Ih ；4)洗漆拍干，每孔加入50 μ L顯色液B液、10 μ L顯色液A液顯色15min,加入 濃度為2mol/L的硫酸溶液，50 μ L/孔，終止反應(yīng)，設(shè)定酶標(biāo)儀于450nm處(優(yōu)選用雙波長450/630nm檢測，在5mi η內(nèi)讀完數(shù)據(jù))，測定OD值。以抑制率1%為縱坐標(biāo)，以熒光增白劑VBL濃度的對數(shù)lg[熒光增白劑VBL(ng/mL)]為橫坐標(biāo)，繪制熒光增白劑VBL競爭抑制曲線。將樣品的抑制率代入標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出樣本所對應(yīng)的濃度，乘以其對應(yīng)的稀釋倍數(shù)即為樣本中熒光增白劑VBL的實際含量。抑制率計算公式如下
β - BI =-L X I 0()%
D _ O其中1-抑制率B——(樣本溶液的平均吸光度值)B0——(O μ g/L標(biāo)準(zhǔn)溶液的平均吸光度值)Bn——(參比空白對照平均吸光度值)實施例3試劑盒靈敏度、特異性、準(zhǔn)確度。I.靈敏度測定。利用實施例2的間接競爭ELISA法測定結(jié)果建立熒光增白劑VBL檢測的標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。熒光增白劑VBL單克隆抗體在I μ g/L IX IO5μ g/L范圍內(nèi)有良好的線性，IC50=857. 9ng/mL，最低檢測限為O. 324ng/mL，檢測范圍(抑制20% 80%之間)為2. 817ng/mL 1212. 182 μ g/mL。紙和塑料制品的檢測限為O. 162ng/mm2，食品樣品的檢測限為O. 162ng/g，日化產(chǎn)品的檢測限為30ng/g。2.特異性測定。采用實施例2的間接競爭ELISA法測定熒光增白劑VBL結(jié)構(gòu)類似物2_羥乙基氨基-1，3, 5- 二嗪、2-苯胺基-1，3, 5- 二嗪、2-氨基_4_苯胺基-6-輕乙基氨基-1，3, 5- 二嗪、二苯乙烯_2，2’ - 二磺酸二鈉鹽、2- (3’ -磺酸基)苯氨基-4-苯胺基-1，3，5-三嗪)與單抗混合物的交叉反應(yīng)。將系列濃度(I X IO7 μ g/L、I X IO6 μ g/L、I X IO5 μ g/L、I X IO4 μ g/L、I X IO3 μ g/L、I X IO2 μ g/L、I X IO1 μ g/L)的上述物質(zhì)分別與抗體同時加入到已包被封閉好的酶標(biāo)板中，具體步驟同實施例3，分別計算各類似物的抑制率。利用單克隆抗體對熒光增白劑VBL的IC5tl值與單克隆抗體對各類似物的IC5tl值的比值得到交叉反應(yīng)率(CR%)，公式如下
權(quán)利要求
1.一種熒光增白劑VBL檢測試劑盒，其特征在于，主要包括 1)包被熒光增白劑VBL特異性抗原的酶標(biāo)板所述酶標(biāo)板的每個微孔內(nèi)熒光增白劑VBL特異性抗原的濃度為1-3 u g/mL ； 2)熒光增白劑VBL特異性抗體溶液該熒光增白劑VBL特異性抗體的濃度為1-3u g/mL ； 所述熒光增白劑VBL特異性抗原與熒光增白劑VBL特異性抗體溶液的用量比為I :1。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的熒光增白劑VBL檢測試劑盒，其特征在于，還包括有酶標(biāo)二抗，所述酶標(biāo)二抗是濃度按1:10000稀釋的辣根過氧化物酶標(biāo)記羊抗鼠二抗。
3.根據(jù)權(quán)利要求I或2所述的熒光增白劑VBL檢測試劑盒，其特征在于，所述熒光增白劑VBL特異性抗原的濃度為2 u g/mL ;所述熒光增白劑VBL特異性抗體的濃度為2 u g/mL。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的熒光增白劑VBL檢測試劑盒，其特征在于，還包括熒光增白劑VBL標(biāo)準(zhǔn)品溶液、底物顯色劑、洗滌液、終止液、封閉液和濃縮樣品稀釋液。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的熒光增白劑VBL檢測試劑盒，其特征在于，所述熒光增白劑VBL特異性抗體是鼠源單克隆抗體；所述熒光增白劑VBL特異性抗原為熒光增白劑VBL與載體蛋白的偶聯(lián)物；所述載體蛋白為牛血清白蛋白、卵清蛋白、兔血清白蛋白、甲狀腺球蛋白中的一種；所述熒光增白劑VBL標(biāo)準(zhǔn)品溶液濃度分別為I X IO5 ii g/L、IXlO4U g/L、I X IO3 u g/L, I X IO2 u g/L, I X IO1 u g/L, I X 10> g/L ;所述顯色劑由顯色劑 A 和顯色劑 B組成，所述顯色劑A為過氧化氫或過氧化脲，所述顯色劑B為鄰苯二胺或四甲基聯(lián)苯胺；所述終止液為l-2mol/L的硫酸溶液；所述洗滌液為含有0. 05%-0. 5%吐溫-20的0. 01M，pH7. 4的磷酸鹽緩沖液；所述封閉液為含5%脫脂奶粉的0. 01M，pH7. 4的磷酸鹽緩沖液；所述濃縮樣品稀釋液為0. 01M, pH7. 4的磷酸鹽緩沖液；所述酶標(biāo)板的材料為聚苯乙烯、聚乙烯、聚丙烯中的一種。
6.一種熒光增白劑VBL檢測試劑盒制備方法，其特征在于，主要包括以下步驟 1)制備包被熒光增白劑VBL特異性抗原的酶標(biāo)板將熒光增白劑VBL和三乙胺分散于干燥二氯甲烷中，加入甲磺酰氯作為活化試劑進行反應(yīng)，使熒光增白劑VBL的醇羥基轉(zhuǎn)化成甲磺酯基；隨后將甲磺酯化對熒光增白劑VBL加入無水乙醇中，加入液氨反應(yīng)，制得能夠與蛋白質(zhì)偶聯(lián)的熒光增白劑VBL的半抗原；再將其與N-羥基丁二酰胺和碳二亞胺混合，再與牛血清白蛋白混合，偶聯(lián)制備得到熒光增白劑VBL特異性抗原；將熒光增白劑VBL特異性抗原包被于酶標(biāo)板中，所述酶標(biāo)板的每個微孔內(nèi)熒光增白劑VBL特異性抗原的濃度為1-3u g/mL ； 2)制備熒光增白劑VBL特異性抗體以步驟I)中合成的熒光增白劑VBL特異性抗原作為免疫原對小鼠進行免疫；免疫后，取血清效價高的小鼠，取其脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞SP2/0進行細(xì)胞融合；采用有限稀釋法篩選雜交瘤細(xì)胞，得到完全同質(zhì)的單克隆抗體和穩(wěn)定的單克隆雜交瘤細(xì)胞株；并取不完全佐劑腹腔注射進行致敏后的小鼠，將雜交瘤細(xì)胞混懸液注射到小鼠腹腔中，收集腹水，經(jīng)辛酸-硫酸銨沉淀法進行腹水純化，得到純化的熒光增白劑VBL單克隆抗體；所述熒光增白劑VBL特異性抗體的濃度為1-3 u g/mL。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的熒光增白劑VBL檢測試劑盒制備方法，其特征在于，步驟I)中，制備熒光增白劑VBL特異性抗原的具體方法為將熒光增白劑VBL0.87g，和三乙胺l.Olg分散于IOOmL干燥二氯甲烷中，零攝氏度下加入0. 5mL甲磺酰氯作為活化試劑，室溫攪拌反應(yīng)，使熒光增白劑VBL的醇羥基轉(zhuǎn)化成甲磺酯基；隨后將甲磺酯化對熒光增白劑VBL加入無水乙醇中，加入20倍量的液氨，回流攪拌反應(yīng)，制得能夠與蛋白質(zhì)偶聯(lián)的熒光增白劑VBL的半抗原；再將其與N-羥基丁二酰胺和碳二亞胺混合，再與牛血清白蛋白混合，室溫攪拌，偶聯(lián)制備得到熒光增白劑VBL特異性抗原。
8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的熒光增白劑VBL檢測試劑盒制備方法，其特征在于，步驟2)為以步驟I中合成的熒光增白劑VBL特異性抗原作為免疫原對10周齡的Balb/c小鼠進行免疫；首次免疫使用完全弗氏佐劑與熒光增白劑VBL特異性抗原溶液乳化，抗原濃度為.0.4mg/mL，劑量為120y g/只，以后每次加強免疫使用不完全弗氏佐劑與熒光增白劑VBL特異性抗原溶液乳化，劑量同初次免疫；初次免疫兩周后，每間隔10天加強免疫一次，共免疫5^10次，當(dāng)抗體效價不再升高時，進行最后一次免疫，最后一次不加免疫佐劑直接用熒光增白劑VBL特異性抗原溶液腹腔注射，劑量同初次免疫；尾部取血檢測血清效價，取血清效價高的小鼠，在無菌條件下，取其脾細(xì)胞按6:1比例與骨髓瘤細(xì)胞SP2/0進行細(xì)胞融合；采用有限稀釋法篩選雜交瘤細(xì)胞，得到完全同質(zhì)的單克隆抗體和穩(wěn)定的單克隆雜交瘤細(xì)胞株；并取Balb/C小鼠，于一周前采用不完全佐劑腹腔注射進行致敏，劑量為0. 5mL/只；將細(xì)胞濃度為I. 5萬/mL的雜交瘤細(xì)胞混懸液注射到小鼠腹腔中，劑量為0. 5mL/只；接種雜交瘤細(xì)胞7 10天后，收集腹水，反復(fù)收集數(shù)次；存于4°C冰箱保存；經(jīng)辛酸-硫酸銨沉淀法進行腹水純化，得到純化的熒光增白劑VBL單克隆抗體。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種熒光增白劑VBL檢測試劑盒，屬于添加劑檢測技術(shù)領(lǐng)域。該試劑盒包括每個微孔內(nèi)包被濃度為1-3μg/mL熒光增白劑VBL特異性抗原的酶標(biāo)板，濃度為1-3μg/mL的熒光增白劑VBL特異性抗體，且所述熒光增白劑VBL特異性抗原與熒光增白劑VBL特異性抗體溶液的用量比為11。本發(fā)明還公開了一種熒光增白劑VBL檢測試劑盒制備方法。本發(fā)明的試劑盒在檢測熒光增白劑VBL時可一次連續(xù)檢測多個樣品，具有便捷，快速，靈敏、成本低的特點。適合用于快速而準(zhǔn)確得檢測大批量樣品中的熒光增白劑VBL。
文檔編號G01N33/545GK102798711SQ201210281660
公開日2012年11月28日 申請日期2012年8月8日 優(yōu)先權(quán)日2012年8月8日
發(fā)明者郭新東, 冼燕萍, 吳鐘玲, 羅海英, 吳玉鑾, 蔡瑋紅, 王斌, 陳意光 申請人:廣州市質(zhì)量監(jiān)督檢測研究院