專利名稱：一類綠光熒光菁染料、制備方法及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及精細(xì)化工領(lǐng)域中ー類新的熒光染料、制備方法及其應(yīng)用，特別是涉及一類單電荷含氮菁類熒光染料、其制備方法，以及利用該熒光染料、其綴合物或其組合物在生物方面的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
DNA (脫氧核糖核酸)是ー類帶有遺傳信息的生物大分子。生物體正常細(xì)胞均具有比較穩(wěn)定的DNA 二倍體含量，只有當(dāng)發(fā)生癌變或具有惡性潛能的癌前病變時，才伴隨細(xì)胞DNA含量的異常改變。因此對DNA的特異性識別和精確測量，尤其是在活細(xì)胞內(nèi)的檢測，在癌癥的早期診斷中意義非常重大。利用熒光技術(shù)進行DNA的定量分析具有靈敏度高、響應(yīng)快、儀器使用便捷等優(yōu)點引起廣大科研工作者的興趣。目前，商品化的此類染料主要有菲啶類(EB、PI)、吖啶類(AO)、咪唑類(Hoechst、DAPI)和花菁家族類(Cy、Τ0Τ0、SYT0)等。然 而，這些染料都各自存在著應(yīng)用的局限性。其一，較大一部分染料與DNA結(jié)合后呈現(xiàn)熒光淬滅，如10，10’ - ニこ基-2，2’ - ニ磺基_9，9’ -雙吖啶、藏紅T、耐而藍、甲基藍等淬滅型DNA探針雖然報道檢出限最低可達ng/mL級，但淬滅的熒光信號在熒光成像等可視化應(yīng)用中實用價值不高。其ニ，有相當(dāng)一部分熒光染料的激發(fā)光處在紫外光區(qū)，如能夠?qū)）`識別脫氧核糖核酸(DNA)的熒光染料DAPI、Hoechst 33258, Hoechst 34580等，在紫外光激發(fā)下與DNA結(jié)合產(chǎn)生藍色熒光。由于紫外光對細(xì)胞內(nèi)的核酸、蛋白等組分會造成嚴(yán)重的損傷，因此這類熒光在熒光顯微技術(shù)中的使用受到光激發(fā)時間的限制[Davis SK, Bardeen C，J.Photochem Photobiol2003; 77:675 - 679]。此外，在紫外區(qū)進行熒光檢測時，生物樣品在這個區(qū)間的吸收使光進入生物組織內(nèi)部變得困難，同時生物樣品中某些成分的自發(fā)熒光形成很強的背景干擾，使檢測效率大大降。其三，有相當(dāng)一部分染料應(yīng)用受限于固定細(xì)胞，如TOPRO, TOTO家族染料、溴こ錠(EB)、碘化丙啶(PI)等需要通過增大細(xì)胞膜的通透性或類似使膜崩解的方法才能對生物樣品進行有效的熒光標(biāo)記。然而，這種固定方法往往對細(xì)胞和生物組織真實形態(tài)的觀察有負(fù)面影響[Kozubek S，Lukasova E, Amrichova J, KozubekM, Liskova A, Slotova J. Anal Biochem2000; 282:29-38]。同時，溴こ淀等B丫唳，菲唳類染料有很大的毒性和致癌性。Invitrogen公司開發(fā)了可在溶液中定量超靈敏檢測dsDNA的試劑盒 Quant-iT PicoGreen (Ex/Em=502/523nm,檢測范圍0. 2-100ng/mL),但該染料結(jié)構(gòu)尚不明確，價格也非常昂貴。因此，開發(fā)可同時滿足激發(fā)和發(fā)射波長良好，對DNA有特異性并定量檢測、及活細(xì)胞通透性的熒光探針是ー項極具挑戰(zhàn)性的工作。在眾多種類的熒光染料中，菁類熒光染料以其波長范圍寬，摩爾消光系數(shù)大，熒光量子產(chǎn)率適中等優(yōu)點，作為生物分子熒光探針、CD和VCD記錄材料、感光材料光敏劑、光電轉(zhuǎn)換材料等已被廣泛的應(yīng)用。其中喹啉類不對稱菁類熒光染料與核酸有高度親和力，而與其他生物大分子基本不結(jié)合的特異性使其在基因組學(xué)技術(shù)、核酸定量檢測、血細(xì)胞分析等領(lǐng)域的應(yīng)用中脫穎而出。該類化合物與核酸的結(jié)合方式包括靜電吸引、堿基對嵌入及溝槽結(jié)合。具體的結(jié)合方式與結(jié)合能力取決于該標(biāo)識物的結(jié)構(gòu)及其與核酸濃度的比例。不對稱菁類化合物中最典型的為TOTO及其類似物(YOYO)和衍生物類(TOPRPO)。TOTO (噻唑橙ニ聚體)、YOYO(惡唑黃ニ聚體)是由Glazer研究組開發(fā)的ー類對核酸具有高度親和カ的多正電荷不對稱菁類熒光染料，通過改變多亞甲基鏈的長度和兩端的芳香母核(噻唑、惡唑、喹啉、吡啶和吲哚啉)的結(jié)構(gòu)可以得到不同的異ニ聚體類似物和衍生物。這類染料在溶液中幾乎無熒光，降低了檢測過程中的熒光背景干擾，與核酸結(jié)合后熒光增強。Jason等用溶液粘度測定法和原子力顯微鏡解釋了 TOTO和YOYO與DNA的雙嵌入作用[J. A. Bordelon, K.J. Feierabend, S. A. Siddiqui, L. L. Wright. J. Phys. Chem. B, 2002，106，4838-3843]。Furstenberg等利用超快速突光轉(zhuǎn)換和時間相關(guān)單光子計數(shù)法進ー步闡述了突光增強的動力學(xué)機理。[A. Fiirstenberg, M. D. Julliard, T. G. Deligeorgiec, N. I. Gadjev. J. AM. CHEM.S0C.，2006，128，7661-7669]此類染料中的有些品種已經(jīng)商品化了，如=SYTOX Blue, Τ0Τ0,POPO, BOBO, YO-PRO等。但這些商品化的染料大部分分子較大，結(jié)構(gòu)復(fù)雜，屬活細(xì)胞非通透性，只能應(yīng)用于活體外核酸的識別與檢測
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，在其基礎(chǔ)上改進，提供了ー類結(jié)構(gòu)簡單、靈敏度高、激發(fā)波長合適、且具有良好的細(xì)胞膜通透性的新化合物。本發(fā)明的目的之ー在于提供一類綠光菁類熒光染料，具有如下結(jié)構(gòu)通式I :通式I中X 為 C(CH3)2'O、S 或 Se ;R1和R2各自獨立地選自H、C1^18烷基、OR6、C1^6烷基R6或鹵素。R3 為 N (R5) (R7)；R4選自Cu燒基、節(jié)基和取代節(jié)基，所述的取代節(jié)基由以下基團任意取代(V18燒基、CN、COOH> NH2、NO2、OH> SH> C^6燒氧基、C^6燒基氣基、C1^酸氣基、齒素或C1^齒代燒基；R5和R7各自獨立地選自H或ら_18烷基；R6 為 H 或 Ch8 烷基；Y_為負(fù)離子。
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ざ1本發(fā)明所述的綠光菁類熒光染料，其中所述的R1和R2各自獨立選自HXh8烷基、OR6和鹵素。優(yōu)選R1為H或Cl，R2為H或甲氧基。本發(fā)明所述的綠光菁類熒光染料，其中所述的R4選自C1J烷基、芐基和取代芐基，取代芐基由以下基團任意取代C00H、NH2 ,OHXh烷氧基或鹵素。優(yōu)選R4選自C^6烷基、芐基和齒素取代節(jié)基。本發(fā)明所述的綠光菁類熒光染料，其中所述的R5和R7各自獨立地選自H或C^6烷基。本發(fā)明所述的綠光菁類熒光染料，其中所述的Γ為鹵素離子、C104_、PF6_、BF4'CH3COCT 或 OTs'本發(fā)明另一方面提供本發(fā)明所述的綠光菁類熒光染料的制備方法，包括以下步驟I)式IIa或IIb的化合物分別與R4Z反應(yīng)，分別制備第一季銨鹽中間體IIIa或IIIb,其中Z為鹵素或OTs, τ為反應(yīng)生成的鹵素負(fù)離子或OTsつR8為鹵素
權(quán)利要求
1.一類綠光菁類熒光染料，具有如下結(jié)構(gòu)通式I :
2.權(quán)利要求I所述的熒光染料，其特征在于所述的R1和R2各自獨立選自H、(V18烷基、OR6和鹵素。
3.權(quán)利要求2所述的熒光染料，其特征在于所述的R1為H或Cl，R2為H或甲氧基。
4.權(quán)利要求I所述的熒光染料，其特征在于所述的R4選自CV18烷基、芐基和取代芐基，取代芐基由以下基團任意取代C00H、NH2、OH、CV6烷氧基或鹵素。
5.權(quán)利要求4所述的熒光染料，其特征在于所述的R4選自C^6烷基、芐基和鹵素取代芐基。
6.權(quán)利要求I所述的熒光染料，其特征在于所述的R5和R7各自獨立地選自H或C^6烷基。
7.權(quán)利要求I所述的熒光染料，其特征在于所述的Y—為鹵素離子、ClO4'PF6' BF4'CH3COCT 或 OTs'
8.權(quán)利要求I所述的綠光菁類熒光染料的制備方法，包括以下步驟 I)式IIa或IIb的化合物分別與R4Z反應(yīng)，分別制備第一季銨鹽中間體IIIa或Illb，其中Z為鹵素或OTs, T為反應(yīng)生成的鹵素負(fù)離子或OTs R8為鹵素
9.權(quán)利要求I所述的綠光菁類熒光染料在生物樣品染色中的應(yīng)用。
10.一種生物樣品的染色方法，包括將權(quán)利要求1-6中任意一項權(quán)利要求所述的化合物與生物樣品接觸的步驟。
全文摘要
本發(fā)明提供一類綠光菁類熒光染料，具有如下結(jié)構(gòu)通式Ⅰ，式中X為C(CH3)2、O、S或Se；R1和R2各自獨立地選自H、C1-18烷基、OR6、C1-6烷基OR6或鹵素。R3為N(R5)(R7)；R4選自C1-18烷基、芐基和取代芐基，所述的取代芐基由以下基團任意取代C1-18烷基、CN、COOH、NH2、NO2、OH、SH、C1-6烷氧基、C1-6烷基氨基、C1-6酰氨基、鹵素或C1-6鹵代烷基；R5和R7各自獨立地選自H或C1-18烷基；R6為H或C1-18烷基；Y-為負(fù)離子。該熒光染料可用于DNA定量檢測以及生物染色，應(yīng)用于核酸標(biāo)記、血細(xì)胞分析、臨床醫(yī)療診斷、免疫分析檢測等領(lǐng)域。
文檔編號G01N21/64GK102702769SQ201210205799
公開日2012年10月3日 申請日期2012年6月20日 優(yōu)先權(quán)日2012年6月20日
發(fā)明者劉濤, 孫世國, 宋鋒玲, 彭孝軍, 樊江莉, 王靜云 申請人:大連理工大學(xué), 大連科榮生物技術(shù)有限公司