含高能磷酸鍵的熒光染料的制作方法
【專利摘要】含高能磷酸鍵的熒光染料，所述熒光染料具有通式I的結(jié)構(gòu)，如附圖1。該類熒光染料在活細胞非線粒體內(nèi)具有較低的熒光背景，在活細胞中線粒體區(qū)域內(nèi)具有較強的熒光信號，且對活細胞內(nèi)三磷酸腺苷酶具有很強的專一性標記。這類化合物具有一定水平的水溶性，同時具有良好的細胞膜通透性。本發(fā)明的這類化合物同時還具有較低的生物毒性、光毒性、光漂白性。其光譜范圍與生物樣品的光譜范圍有足夠大的差異。
【專利說明】
含高能磷酸鍵的熒光染料
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及一類含高能磷酸鍵的熒光染料、其制備方法，以及利用該類熒光染料 對活細胞或組織中三磷酸腺苷酶的識別和定量、動態(tài)可視化檢測。
【背景技術(shù)】
[0002] 三磷酸腺苷酶(Adenosine Triphosphatase)即ATP酶，主要存在于細胞質(zhì)膜和液 泡膜中。該酶是一種可催化三磷酸腺苷(ATP)水解生成二磷酸腺苷(ADP)和磷酸根離子的一 種生物活性輔酶。在這個催化水解過程中，ATP酶可使得生物體系釋放出大量的能量 (Annu. Rev. Biochem. 1967，36:727-756)。此能量釋放過程廣泛存在于所有已知的生命形式 中。ATP酶作為一種輔酶具有改善肌體代謝的作用，同時它可廣泛參與體內(nèi)脂肪、蛋白質(zhì)、 糖、核酸、核苷酸等代謝過程。在它催化水解過程中，釋放的能量又是體內(nèi)吸收、分泌、肌肉 收縮以及進行生化合成反應(yīng)等生命過程中所需能量的主要來源。因此，在心肌病、肝炎、進 行性肌萎縮、神經(jīng)性耳聾等疾病的治療中，常將ATP酶作為研究對象。近些年來，因 ATP酶具 有廣泛用于改善機體代謝功能，其常被看做是心臟病能量合劑中的重要成分之一。所以建 立一種簡便的、快速的、有效的、靈敏的、特異性識別和定量、動態(tài)監(jiān)測細胞或組織內(nèi)的ATP 酶以及可對其進行定量成像的技術(shù)或方法是一項重要的工作。
[0003] 現(xiàn)有識別及檢測ATP酶的方法種類很多，例如生物發(fā)光法、酶聯(lián)免疫分析法、沉淀 色素強度分析法等。但上述方法在實際活細胞或組織成像應(yīng)用中存在很多缺陷，例如:無法 實現(xiàn)活生物樣品的檢測、無法穿越細胞組織外膜、無法實時動態(tài)的監(jiān)測等等。近些年，熒光 染料結(jié)合不斷發(fā)展的顯微成像技術(shù)為消除上述缺陷提供了一種可行的重要顯微監(jiān)測工具， 以熒光染料作為核心的光學分子成像技術(shù)為ATP酶的相關(guān)基礎(chǔ)研究提供了一種潛在的可視 化工具。目前，菲啶類(EB、PI)、吖啶類(A0)、咪唑類(H 〇echst、DAPI)和花菁家族類（Cy、 T0T0、SYT0)等熒光染料都已經(jīng)成為熒光染料研究的核心對象分子。然而，這些染料在ATP酶 活性的實時動態(tài)監(jiān)測時具有一些無法改變的缺點。比如：菲啶染料類中的溴化乙錠(EB)作 為熒光染料具有很好的光學性質(zhì)，但其具有較高的生物致癌性。更重要的是，這些傳統(tǒng)的熒 光染料在熒光穩(wěn)定性、近紅外定靶激發(fā)、高分辨率的暗場成像、生物樣品的自發(fā)熒光干擾等 方面具有很大的缺陷（Nature，1999，2: 989-996 ?; Science，1997，275 : 530 ? ;Angewandte Chemie International Edition，2001,40:2098 ?)。因此，設(shè)計合成并制備低/無毒性、高膜 通透性、高選擇性識別和定量、實時動態(tài)監(jiān)測活生物樣品（細胞或組織）中的ATP酶活性的熒 光染料仍然存在巨大挑戰(zhàn)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的首先在于提供一類含高能磷酸鍵的熒光染料，具有通式I的結(jié)構(gòu)：
[0006] 通式I中：
[0007] 所述的心和1?2各自獨立選自：Cn烷基、-0 (CH2) nCH3、-0 (CH2) n0H、-0 (CH2) nNH2、-0 (CH2)nNHCH3、-0(CH2) nN(CH3)2、-0P(0)(CH2)nCH3、-0P(0)(CH2) n0H、-0P(0)(CH2)nNH2、-0P(0) (CH2)nNHCH3、-0P(0)(CH2) nN(CH3)2、-0P(0)(CH2)nP(0)CH3、-0P(0)(CH2) nP(0)0H、-0P(0) (CH2)nP(0)NH2、-0P(0)(CH2)nP(0)NHCH3、-0P(0)(CH2) nP(0)N(CH3)2、H0[P(0)(0H)0-]n、H0[P (0)(CH 3)0-]n、CH3[P(0)(CH3)0-]n、-OH 或-H，其中 n 是 1-8 的整數(shù)；
[0008] 所述的 R3選自：CP烷基、-CN、- (CH2) P0H、- (CH2) P0CH3、- (CH2) P0 (CH2) qOH、-NH (CH2) PCH3、_NH (CH2) PNH2、_ (CH2) PNH (CH2) qCH3、_NH (CH2) P0 (CH2) qCH3、_ (CH2) PNH2、_NH (CH2) PNH (CH2) qCH3、-N(CH3) (CH2)PCH3或-(CH2)PN( CH3) (CH2) qCH3，其中 p和q各自獨立地選自卜8的整 數(shù)；
[0009] 所述的 L選自：Cx 烷基、-0(CH2)x-、-(CH2)x0-、-0(CH 2)x0-、-0(CH2)x0(CH2) y-、-0 (CH2)x0(CH2)y0-、-NH(CH2) x-、-(CH2)xNH-、-NH(CH2)xNH-、-NH(CH2) xNHC(0)-、-NH(CH2)xC(0) NH-、-NH (CH2) XNH (CH2) y_、-NH (CH2) XNH (CH2) yNH-、-0 (CH2) XNH-、-NH (CH2) x〇-、-0 (CH2) x0 (CH2) yNH-、-NH (CH2) x0 (CH2) yNH-或-0 (CH2) XNH (CH2) y0-，其中 x和y 各自獨立地選自 1 -8 的整 數(shù)；
[0010] 所述的M選自：
[0012] 上述基團的結(jié)構(gòu)式中，"一"用以表示該基團與化合物其它部分連接的游離鍵。
[0013] 本發(fā)明另一方面的目的在于提供上述含高能磷酸鍵的熒光染料的制備方法，包括 如下步驟：
[0014] 1)H-M-Br與R3-H按摩爾比1:1-1:5反應(yīng)，制備化合物R3-M-Br;
[0015]反應(yīng)溫度為0_200°C，反應(yīng)時間為1-24小時，反應(yīng)溶劑選自二氯甲烷、乙醇、甲醇、 丙酮、1，4-二氧六環(huán)、丙三醇、乙酸乙酯、醋酸或其混合物；
[0016] 2)化合物R3-M-Br與化合物H-L-H按摩爾比1:1-1:15反應(yīng)，制備化合物R 3-M-L-H:
[0017] 反應(yīng)溫度〇-180°c，反應(yīng)時間卜36小時，反應(yīng)溶劑選自二氯甲烷、乙醇、甲醇、丙酮、 丙三醇、乙酸乙酯、醋酸、乙二醇甲醚、乙二醇乙醚或其混合物；
[0018] 3)化合物R3-M-L-H與化合物B按照摩爾比1:1-1:6反應(yīng)，制備化合物I:
[0020] 反應(yīng)溫度25-160°C，反應(yīng)時間1-15小時，反應(yīng)溶劑選自二氯甲烷、乙醇、甲醇、丙 酮、丙三醇、乙酸乙酯、N，N-二甲基甲酰胺、水、醋酸或其混合物;縮合劑選自1-(3_二甲氨基 丙基)-3_乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC1)、二環(huán)己基碳二亞胺(DCC);催化劑選用4-二甲氨基吡 啶。
[0021]上述關(guān)于本發(fā)明的含高能磷酸鍵熒光染料的制備方法的描述中，各個取代基的定 義，即對Ri、R2、R3、L、和M的定義，均與上述對化合物的描述中的定義相同。
[0022]本發(fā)明所述的含高能磷酸鍵熒光染料可以近紅外定靶激發(fā)，在細胞和組織內(nèi)對三 磷酸腺苷酶有強的熒光響應(yīng)信號，可用于特異專一性的比例標記和定量、實時動態(tài)檢測活 細胞活組織中三磷酸腺苷酶活性的小分子熒光染料。并且這類熒光染料具有良好的水溶 性，以及優(yōu)秀的細胞膜通透性。同時還具有較低的生物毒性、光毒性、光漂白性。其光譜范圍 與生物樣品的光譜范圍有足夠大的差異，可以避免生物自發(fā)熒光的產(chǎn)生。
[0023]因此，本發(fā)明再一方面的目的在于提供上述含高能磷酸鍵熒光染料在生物檢測與 標記中的應(yīng)用。尤其優(yōu)選應(yīng)用于目標物為活細胞或腫瘤組織中的三磷酸腺苷酶活動的實時 動態(tài)監(jiān)測與標記。
【附圖說明】
[0024]本發(fā)明附圖14幅：
[0025]圖1是本發(fā)明的含高能磷酸鍵的熒光染料的結(jié)構(gòu)通式I。
[0026]圖2是化合物心的水溶性檢測試驗結(jié)果。
[0027]圖3是化合物心活細胞內(nèi)成像試驗的測定結(jié)果。
[0028]圖4是化合物心在活細胞內(nèi)對三磷酸腺苷酶比例識別成像結(jié)果。
[0029]圖5是化合物心在水溶液中對三磷酸腺苷酶的識別試驗結(jié)果。
[0030]圖6是化合物知對活細胞中三磷酸腺苷酶的識別試驗結(jié)果。
[0031]圖7是熒光染料化合物六2在水溶液中對光的穩(wěn)定性的檢測試驗結(jié)果。
[0032]圖8是化合物知在水溶液中對三磷酸腺苷酶的識別試驗結(jié)果。
[0033]圖9是化合物A3對活細胞中線粒體共定位成像結(jié)果。
[0034]圖10是化合物A3在水溶液中對三磷酸腺苷酶的檢測試驗結(jié)果。
[0035]圖11是化合物A3對活細胞中三磷酸腺苷酶的識別試驗結(jié)果。
[0036]圖12是化合物A4對活細胞的細胞毒性測試結(jié)果。
[0037]圖13是化合物A4的水溶解性表征結(jié)果。
[0038]圖14是化合物A4對活細胞中三磷酸腺苷酶的識別試驗結(jié)果。
【具體實施方式】
[0039]除另有說明外，本文中使用的術(shù)語具有以下含義。
[0040] 本文中使用的術(shù)語"烷基"包括直鏈烷基、支鏈烷基和環(huán)烷基。如提及具體烷基名 稱，如"丙基"、"異丙基"或"環(huán)丙基"，特指具體碳原子數(shù)目的直連烷基、支鏈烷基和環(huán)烷基。 如概括形式的描述，如"&- 8烷基"，則包括碳原子數(shù)滿足要求的所有基團，"&-8烷基"包括但 不限于&-6烷基、&- 5烷基、甲基、乙基、正丙基、異丙基、叔丁基、環(huán)丙基、環(huán)丁基、甲基環(huán)丙基 等。類似的規(guī)則也適用于本說明書中使用的其它基團。
[0041] 本發(fā)明首先提供一類含高能磷酸鍵的熒光染料，具有通式I的結(jié)構(gòu)：
[0043] 通式I中：辦、1?2和R3為不同取代基;M為熒光團；L為連接臂。
[0044]所述的心和1?2各自獨立選自：Cn烷基、-0 (CH2) nCH3、-0 (CH2) n0H、-0 (CH2) nNH2、-0 (CH2)nNHCH3、-0(CH2)nN(CH3)2、-0P(0)(CH2)nCH 3、-0P(0)(CH2)n0H、-0P(0)(CH2)nNH2、-0P(0) (CH2) nNHCH3、-0P(0)(CH2)nN(CH3)2、-0P(0)(CH2)nP(0)CH 3、-0P(0)(CH2)nP(0)0H、-0P(0) (CH2)nP(0)NH2、-0P(0)(CH2) nP(0)NHCH3、-0P(0)(CH2)nP(0)N(CH3)2、H0[P(0)(0H)0-] n、H0[P (0) (CH3)0-]n、CH3[P(0) (CH3)0-]n、-〇H 或-H〇
[0045] 優(yōu)選的實施方式中，所述的以和心各自獨立地選自：-0P(0)(CH2) nCH3、-0P(0) (CH2)n0H、-0P(0)(CH2)nNH 2、-0P(0)(CH2)nNHCH3、-0P(0)(CH 2)nN(CH3)2、-0P(0)(CH2) nP(0) CH3、-0P(0)(CH2)nP(0)0H、-0P(0)(CH2)nP(0)NH2、-0P(0)(CH2) nP(0)NHCH3、-0P(0)(CH2)nP(0) N(CH3)2、H0[P(0) (0H)0-]n、H0[P(0) (CH3)0-]n、CH3[P(0) (CH3)0-]n、-〇H 或-H〇
[0046] 更為優(yōu)選地，所述的RjPR2各自獨立地選自H0[P(0)(0H)0-]n、H0[P(0)(CH 3)0-]n、 CH3[P(0)(CH3)0-]n、H0[P(0)(0H)0-] n、H0[P(0)(CH3)0-]n、-0P(0)(CH2) nP(0)0H、-0P(0) (CH2)n0H、-OH〇
[0047] 進一步優(yōu)選的實施方式中，所述的心和辦各自獨立地選自H0[P(0)(0H)0-]n、H0[P (0) (CH3)0-]n 和 CH3[P(0) (CH3)0-]n。
[0048]再進一步的優(yōu)選實施方式中，所述的辦和辦各自獨立地選自H0[P(0)(0H)0-]J^H0 [P(0)(CH3)0-]n〇
[0049] 上述對取代基心和辦的描述中，所述及的P(0)代表磷氧雙鍵，H0[P(0)(0H)0-]n、H0
[P(0)(CH3)0-]n、CH3[P(0)(CH3)0-]r^ v別表示為式 i、ii 和 iii:
[0051 ] 上述對取代基Ri和R2的描述中，n是1-8的整數(shù)，優(yōu)選1-4的整數(shù)。
[0052]上述通式I 中，R3 選自：CP 烷基、-CN、-(CH2)P0H、-(CH2)P0CH 3、-(CH2)P0(CH2)q0H、-NH (CH2) PCH3、-NH (CH2) PNH2、_ (CH2) PNH (CH2) qCH3、-NH (CH2) P0 (CH2) qCH3、_ (CH2) PNH2、-NH (CH2) PNH (CH2) qCH3、-N(CH3) (CH2) PCH3或-(CH2)PN(CH3) (CH2) qCH3;優(yōu)選所述的R3選自 CP烷基、-CN、-(CH2) P0H、- (CH2) P0CH3、_NH (CH2) PCH3、_NH (CH2) PNH2、_NH (CH2) P0 (CH2) qCH3、_ (CH2) PNH2、_NH (CH2) PNH (CH2) qCH3、-N(CH3) (CH2) PCH3或-(CH2) PN (CH3) (CH2) qCH3;更優(yōu)選所述的R3選自 CP烷 基、-CN、-NH (CH2) PCH3、-NH (CH2) P0 (CH2) qCH3、-NH (CH2) PNH (CH2) qCH3、-N (CH3) (CH2) PCH3;最為 優(yōu)選的，所述的R3優(yōu)選CP烷基和-CN。
[0053] 上述對取代基R3的描述中，p和q各自分別選自1-8的整數(shù)，優(yōu)選各自獨立地選自1- 4的整數(shù)。
[0054]上述通式 I 中，所述的 L 選自：Cx 烷基、-0(CH2)x-、-(CH2)x0-、-0(CH 2)x0-、-0(CH2)x0 (CH2)y-、-0(CH2)x0(CH2)y0-、-NH(CH2) x-、-(CH2)xNH-、-NH(CH2)xNH-、-NH(CH2) xNHC(0)-、-NH (CH2) XC (0) NH-、-NH (CH2) XNH (CH2) y_、-NH (CH2) XNH (CH2) yNH-、-0 (CH2) XNH-、-NH (CH2) x〇-、-0 (CH2) x0 (CH2) yNH-、-NH (CH2) x0 (CH2) yNH-或-0 (CH2) XNH (CH2) y0-;優(yōu)選所述的 L選自 Cx 烷基、-0 (CH2)x-、-(CH2)x0-、-0(CH 2)x0-、-0(CH2)x0(CH2) y-、-0(CH2)x0(CH2)y0-、-NH(CH 2)x-、-(CH2) XNH-、-NH (CH2) XNH-、-NH (CH2) XNHC (0) -、-NH (CH2) XC (0) NH-、-NH (CH2) XNH (CH2) y-、-NH (CH2) XNH (CH2) yNH-、-0 (CH2) XNH-、-NH (CH2) x〇-、-0 (CH2) x0 (CH2) yNH-、-NH (CH2) x0 (CH2) yNH-或-0 (CH2) XNH(CH2) y0-;更為優(yōu)選的，所述的L選自-NH(CH2) XNH-、-NH (CH2) XNH (CH2) yNH-、-NH (CH2) x0 (CH2)yNH-或-NH(CH2) XC(0) NH-、。所述的L尤其優(yōu)選-NH(CH2)XNH-或-NH(CH2) XC(0) NH-〇
[0055]上述對L的描述中，所述的x和y各自獨立地選自1-8的整數(shù);優(yōu)選1-4的整數(shù)。
[0056] 上述通式I中，所述的M選自：
[0058] 優(yōu)選的技術(shù)方案中，M選自或M5
[0059] 最為優(yōu)選地，所述的M選自M2或M5。
[0060] 以上所描述的各優(yōu)選技術(shù)特征可以相互組合，所得技術(shù)方案應(yīng)當完全包括于本發(fā) 明所述及的范圍。
[0061] 優(yōu)選技術(shù)特征的組合之實例，為本發(fā)明具體的實施方案是之一，所述的高能磷酸 鍵的熒光染料，選自化合物Ai-A4:
[0063] 另一方面，本發(fā)明提供了上述本發(fā)明含高能磷酸鍵的熒光染料的制備方法，包括 如下步驟：
[0064] 1)H-M-Br與R3-H按摩爾比1:1-1:5反應(yīng)，制備化合物R3-M-Br;
[0065] 反應(yīng)溫度為0_200°C，反應(yīng)時間為1-24小時，反應(yīng)溶劑選自二氯甲烷、乙醇、甲醇、 丙酮、1，4-二氧六環(huán)、丙三醇、乙酸乙酯、醋酸或其混合物；
[0066]【具體實施方式】中，所述步驟1)的反應(yīng)溫度優(yōu)選25-180°C，更優(yōu)選50-180°C，最優(yōu)選 60-150°C;所述的反應(yīng)時間優(yōu)選1-23小時，更優(yōu)選1-22小時，最優(yōu)選1-20小時;所述的反應(yīng) 溶劑優(yōu)選二氯甲烷、乙醇、甲醇、丙酮、1，4_二氧六環(huán)、丙三醇、乙酸乙酯、醋酸或其混合物， 更優(yōu)選二氯甲烷、乙醇、甲醇、1，4_二氧六環(huán)、丙三醇、乙酸乙酯、醋酸或其混合物，最優(yōu)選乙 醇、甲醇、丙三醇、乙酸乙酯、醋酸或其混合物；
[0067] 2)化合物R3-M-Br與化合物H-L-H按摩爾比1:1-1:15反應(yīng)，制備化合物R 3-M-L-H:
[0068] 反應(yīng)溫度0-180°C，反應(yīng)時間1-36小時，反應(yīng)溶劑選自二氯甲烷、乙醇、甲醇、丙酮、 丙三醇、乙酸乙酯、醋酸、乙二醇甲醚、乙二醇乙醚或其混合物；
[0069]【具體實施方式】中，所述步驟2)的反應(yīng)溫度優(yōu)選30-180°C，更優(yōu)選30-160°C，最優(yōu)選 30-140 °C;所述的反應(yīng)時間優(yōu)選1-30小時，更優(yōu)選1-28小時，最優(yōu)選2-24小時;所述的反應(yīng) 溶劑優(yōu)選乙醇、甲醇、丙酮、丙三醇、乙酸乙酯、醋酸、乙二醇甲醚、乙二醇乙醚或其混合物， 更優(yōu)選乙醇、甲醇、丙三醇、乙酸乙酯、醋酸、乙二醇甲醚、乙二醇乙醚或其混合物，最優(yōu)選乙 醇、乙酸乙酯、醋酸、乙二醇甲醚、乙二醇乙醚或其混合物;化合物R 3-M-Br與化合物H-L-H進 行反應(yīng)優(yōu)選摩爾比1:1-1:4.5,更優(yōu)選1:1-1:4,最優(yōu)選1:2-1: 4。
[0070] 3)化合物R3-M-L-H與化合物B按照摩爾比1:1-1:6反應(yīng)，制備化合物I:
[0072] 反應(yīng)溫度25-160°C，反應(yīng)時間1-15小時，反應(yīng)溶劑選自二氯甲烷、乙醇、甲醇、丙 酮、丙三醇、乙酸乙酯、N，N-二甲基甲酰胺、水、醋酸或其混合物;縮合劑選自1-(3_二甲氨基 丙基)-3_乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC1)、二環(huán)己基碳二亞胺(DCC);催化劑選用4-二甲氨基吡 啶。
[0073]【具體實施方式】中，所述步驟3)的反應(yīng)溫度優(yōu)選30_160°C，更優(yōu)選30_150°C，最優(yōu)選 30-140 °C;所述的反應(yīng)時間優(yōu)選1-14小時，更優(yōu)選4-13小時，最優(yōu)選5-12小時;所述的反應(yīng) 溶劑優(yōu)選乙醇、甲醇、丙酮、丙三醇、乙酸乙酯、N，N-二甲基甲酰胺、水、醋酸或其混合物，更 優(yōu)選乙醇、丙三醇、乙酸乙酯、N，N-二甲基甲酰胺、水、醋酸或其混合物，最優(yōu)選乙醇、乙酸乙 酯、N，N-二甲基甲酰胺、醋酸或其混合物;R 3-M-L-H與化合物B進行反應(yīng)優(yōu)選摩爾比1:1-1: 5.5,更優(yōu)選 1:1-1:5,最優(yōu)選 1:1-1:4.5。
[0074] 對本發(fā)明采用上述方法合成的含高能磷酸鍵的熒光染料化合物，采用核磁共振譜 圖或質(zhì)譜來確認其結(jié)構(gòu)。
[0075] 本發(fā)明所述的含高能磷酸鍵的熒光染料具備以下優(yōu)點：
[0076] 所述染料化合物引入了與三磷酸腺苷酶特異性結(jié)合位點，提高了染料對活細胞和 組織中三磷酸腺苷酶檢測和識別的專一性、特異性。
[0077]所述染料化合物具有優(yōu)異的光學性能，應(yīng)用于生物樣品成像時具有低的生物光漂 白、光損傷和生物毒性。
[0078]所述染料化合物毒副性小，原料易得，結(jié)構(gòu)簡單，易于制備，易產(chǎn)業(yè)化。
[0079] 鑒于此，本發(fā)明所述的熒光染料可用于活細胞中三磷酸腺苷酶的標記。除了以本 文中所述的形式直接用于活細胞中三磷酸腺苷酶的標記，含有本發(fā)明的熒光染料化合物的 組合物也可以用于活細胞中三磷酸腺苷酶的標記和實時動態(tài)監(jiān)測。所述組合物中應(yīng)當包含 有效量的本發(fā)明所提供的熒光染料化合物之一。另外，還可以包含生物樣品染色所需要的 其它組分，例如溶劑、pH調(diào)節(jié)劑等。這些組分都是本行業(yè)內(nèi)已知的。上述組合物可以以水溶 液形式存在，或者可以以臨用前用水配制為溶液的其它合適形式存在。
[0080] 本發(fā)明還提供使用上述本發(fā)明的熒光染料化合物標記和動態(tài)實時監(jiān)測活細胞中 三磷酸腺苷酶的方法，該方法包括使所述化合物與生物樣品接觸的步驟。本文中使用的術(shù) 語"接觸"可包括在溶液或固相中接觸。
[0081] 下述非限制性實施例可以使本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員更全面地理解本發(fā)明，但不以 任何方式限制本發(fā)明。
[0082] 實施例1
[0083]制備熒光染料化合物心，采用如下合成路線：
[0085] (1)化合物1-2的合成
[0086] 將20mmol化合物1-1和30mmola-氨基丙酸加入到含有l(wèi)〇ml乙醇溶液的圓底燒瓶 中，氮氣保護。反應(yīng)加熱回流持續(xù)反應(yīng)16h后停止。混合物倒入冰水中，沉淀析出，抽濾得紫 色固體粉末粗產(chǎn)品，化合物1 -2，收率93 %。
[0087] (2)化合物心的合成
[0088] 將20mmol化合物1-2和120mmol化合物B加入到含有20mmol EDC1及少量DMAP 20ml 乙酸乙酯溶液的圓底燒瓶中，氮氣保護。反應(yīng)加熱125°C回流持續(xù)反應(yīng)12h后停止。減壓蒸出 溶劑，柱色譜分離得深紅色固體粉末化合物Ai，收率42 %。4 NMR(400MHz，DMS0) S10.11 (m， 6H)，7.87-7.89(m，2H)，7.75(s，lH)，7.73(s，lH)，7.47(s，lH)，7.40(s，lH)，6.65(s，lH)， 6.03(s,lH),4.53(s,lH),4.23-4.02(m,3H),3.89(s,1H),3.71-3.69(s,2H),3.31(m,2H), 2.42(m,2H).
[0089] 實施例2
[0090] 熒光染料化合物^的水溶性檢測試驗
[0091] 使用上述實施例合成的熒光染料化合物Ai加入到水中，測定在不同濃度（0.6， 2.0,2.7,3.3,5.0,6.6,9. OyMMi水溶液的最大吸收波長下吸光度。測試結(jié)果為圖2，結(jié)果顯 示：當化合物Ai濃度為9. OyM時，吸光度值未發(fā)生偏移，即熒光染料化合物心在水中的溶解度 為9.OyM。圖2為不同探針Ai濃度的最大吸收波長下吸光度。所用儀器分別是Agilent 8453 紫外分光光度計。
[0092] 實施例3
[0093]熒光染料化合物^活細胞內(nèi)成像試驗
[0094]使用上述實施例合成的熒光染料化合物心，以終濃度為10.0 yM的心分別孵育HepG2 細胞，在37°C，5 %⑶2孵育30分鐘。然后，PBS震蕩漂洗5min X 3，再加入細胞培養(yǎng)基，激光共 聚焦成像。選取代表性區(qū)域，用干鏡(40X)觀察，重復三次。實驗結(jié)果表明：熒光染料化合物 八1在11叩62細胞胞質(zhì)中的有強熒光信號。圖3的熒光采集波段為560-650nm。
[0095] 實施例4
[0096] 熒光染料化合物心在活細胞內(nèi)對三磷酸腺苷酶比例識別成像的試驗
[0097]使用上述實施例合成的熒光染料化合物Ai，以終濃度為孵育HepG2細 胞，在37°C，5%C02孵育30分鐘。實驗組內(nèi)再加入ATP酶抑制劑孵育30分鐘。然后，PBS震蕩漂 洗5minX 3,再加入細胞培養(yǎng)基，激光共聚焦成像。選取代表性區(qū)域，用干鏡(40 X)觀察，重 復三次。熒光采集波段為550-580nm和585-620nm。激發(fā)波長為515nm〇 [0098] 實驗結(jié)果如圖4所示，表明：熒光染料化合物六:對照組HepG2細胞胞質(zhì)中在585- 620nm(對照組圖4a)處有明顯而且強熒光信號，而在550-580nm處基本沒有熒光信號（對照 組圖4b)。當實驗組內(nèi)加入三磷酸腺苷酶抑制劑后，三磷酸腺苷酶含量減少，熒光染料化合 物八1在585-62〇11111(實驗組圖4c)處的熒光信號明顯減弱，而在550-580nm處的熒光明顯減弱 (實驗組圖4d)。因此，550-580nm處熒光強度與585-620nm的熒光強度比例值逐漸降低。此實 驗結(jié)果表明熒光染料化合物^在活細胞內(nèi)可對三磷酸腺苷酶進行比例識別成像。
[0099] 實施例5
[0100]熒光染料化合物^在水溶液中對三磷酸腺苷酶的識別試驗 [0101]使用上述實施例中合成的熒光染料化合物Ai加入到水中，對不同濃度三磷酸腺苷 酶的識別。測試結(jié)果如圖5所示，顯示：當化合物六:濃度為5.OiiM時，隨著三磷酸腺苷酶的增 加，化合物熒光在540nm的強度逐漸減弱。下圖為不同濃度三磷酸腺苷酶作用下Ai熒光 光譜變化。
[0102] 實施例6
[0103] 制備探針化合物A2:
[0105] (1)化合物2-2的合成
[0106] 將20mmol化合物1-1和30mmol溴乙胺加入到含有10ml乙醇溶液的圓底燒瓶中，氮 氣保護。反應(yīng)加熱回流持續(xù)反應(yīng)3h后停止。混合物倒入冰水中，沉淀析出，抽濾得紫色固體 粉末粗產(chǎn)品，化合物2-2，收率87 %。
[0107] (2)化合物A2的合成
[0108] 將20mmol化合物2-2和120mmol化合物B加入到含有20mmol EDC1及少量DMAP 20ml 乙酸乙酯溶液的圓底燒瓶中，氮氣保護。反應(yīng)加熱125°C回流持續(xù)反應(yīng)16h后停止。減壓蒸出 溶劑，柱色譜分離得紫色固體粉末化合物A2，收率53 %。M1R (40OMHz，DMSO) S1 〇 . 14 (m， 6H)，7.87-7.89(m，2H)，7.74(s，lH)，7.68(s，lH)，7.49(s，lH)，7.39(s，lH)，6.66(s，lH)， 6.05(s，lH)，4.54(s，lH)，4.23-4.02(m，3H)，3.89(s，lH)，3.29(m，4H)，2.42(m，2H).
[0109] 實施例7
[0110]熒光染料化合物知對活細胞中三磷酸腺苷酶的識別
[0111] 使用上述實施例合成的熒光染料化合物A2,以終濃度為lO.OyM的厶2分別孵育HepG2 細胞，在37°C，5 %⑶2孵育30分鐘。然后，加入三磷酸腺苷酶抑制劑，孵育lh，PBS震蕩漂洗 5minX 3,再加入細胞培養(yǎng)基，激光共聚焦成像。選取代表性區(qū)域，用干鏡(40 X)觀察，重復 三次。實驗結(jié)果如圖6所示，表明：熒光染料化合物六2在11叩62細胞中隨著三磷酸腺苷酶抑制 劑孵育時間增長，其熒光信號減弱。圖6中：（a)為對照組，未加入三磷酸腺苷酶抑制劑；（b) 為實驗組，加入100.0 yM的三磷酸腺苷酶抑制劑；圖6的熒光采集波段為560-650nm。
[0112] 實施例8
[0113] 熒光染料化合物六2在水溶液中對光的穩(wěn)定性的檢測試驗
[0114] 使用上述實施例合成的熒光染料化合物A2加入到水中，測定在其在不同時間 (5.0、10.0和15min，以及7.Oh)下的A 2熒光光譜變化。測試結(jié)果為圖7,結(jié)果顯示：當化合物A2 濃度為5. OyM時，隨著照射時間的逐漸延長，化合物六2的熒光強度在560-650nm保持不變，時 間可持續(xù)7.Oh。圖7為其在不同時間下的A 2熒光強度變化。所用儀器分別是Agilent熒光分 光光度計。
[0115] 實施例9
[0116] 熒光染料化合物知在水溶液中對三磷酸腺苷酶的識別試驗
[0117] 使用上述實施例中合成的熒光染料化合物A2加入到水中，對不同濃度(2.0,4.0， 6.0，8. Oand 10.0 yM)三磷酸腺苷酶的識別。測試結(jié)果如圖8，顯示：當化合物A2濃度為5. OyM 時，隨著三磷酸腺苷酶的增加，化合物如的熒光在540nm的強度逐漸減弱。下圖為不同濃度 三磷酸腺苷酶作用下知熒光光譜變化。
[0118] 實施例1〇
[0119] 制備熒光染料化合物A3
[0121] (1)化合物3-1的合成
[0122] 將20mmol 4-溴-1，8_萘酐和25mmol丁胺加入到含有10ml乙醇溶液的圓底燒瓶中， 氮氣保護。反應(yīng)加熱回流持續(xù)反應(yīng)l〇h后停止。混合物倒入冰水中，沉淀析出，抽濾得黃色固 體粉末粗產(chǎn)品，化合物3-1，收率92 %。
[0123] (2)化合物3-2的合成
[0124] 將20mmol化合物3-1和200mmol溴乙胺加入到含有10ml乙醇溶液的圓底燒瓶中，氮 氣保護。反應(yīng)加熱回流持續(xù)反應(yīng)12h后停止?；旌衔锏谷氡?，沉淀析出，抽濾得黃色固體 粉末粗產(chǎn)品，化合物3-2，收率87 %。
[0125] (3)熒光染料化合物A3的合成
[0126] 將20mmol化合物3-2和120mmol化合物B加入到含有20mmol EDC1及少量DMAP 20ml 乙酸乙酯溶液的圓底燒瓶中，氮氣保護。反應(yīng)加熱125°C回流持續(xù)反應(yīng)16h后停止。減壓蒸出 溶劑，柱色譜分離得紫色固體粉末化合物A 3，收率33 %。M1R (400MHz，DMS0) S1 〇 . 14 (m， 6H)，7.87-7.89(m，2H)，7.74(s，lH)，7.68(s，lH)，7.54(s，lH)，7.50(s，lH)，7.49(s，lH)， 7.39(s，lH)，6.66(s，lH)，6.05(s，lH)，4.54(s，lH),4.23-4.02(m，3H)，3.89(s，lH)，3.29 (m,4H),2.42(m,2H),1.13-1.02(m,7H).
[0127] 實施例11
[0128] 熒光染料化合物A3對活細胞中線粒體共定位成像
[0129] 使用上述實施例合成的熒光染料化合物A3,以終濃度為lO.OyM的A3分別孵育HepG2 細胞，在37°C，5 %⑶2孵育30分鐘。然后，PBS震蕩漂洗5min X 3，再加入細胞培養(yǎng)基，激光共 聚焦成像。選取代表性區(qū)域，用干鏡(40X)觀察，重復三次。通過數(shù)據(jù)分析，得出圖9的散點 分析結(jié)果。如圖9所示，結(jié)果顯示:熒光染料化合物A 3在HepG2細胞中線粒體有強熒光信號。
[0130] 實施例12
[0131] 熒光染料化合物A3在水溶液中對三磷酸腺苷酶的檢測試驗
[0132] 使用上述實施例合成的熒光染料化合物A3加入到水中，測定在不同濃度（2.0， 4.0，6.0，8. Oand 10.0 yM)三磷酸腺苷酶作用下A3紫外光譜變化。測試結(jié)果為圖10，結(jié)果顯 示：當化合物A3濃度為5. 時，隨著三磷酸腺苷酶的增加，化合物A3的紫外強度逐漸減弱。 圖10為不同濃度三磷酸腺苷酶作用下A3紫外光譜變化。所用儀器分別是Agilent 8453紫外 分光光度計。
[0133] 實施例13
[0134] 熒光染料化合物A3對活細胞中三磷酸腺苷酶的識別
[0135] 使用上述實施例合成的熒光染料化合物A3,以終濃度為lO.OyM的A3孵育HepG2細 胞，在37°C，5%⑶ 2孵育30分鐘。實驗組內(nèi)再加入三磷酸腺苷酶抑制劑孵育30分鐘。然后， PBS震蕩漂洗5min X 3，再加入細胞培養(yǎng)基，激光共聚焦成像。選取代表性區(qū)域，用干鏡(40 X)觀察，重復三次。熒光采集波段為550-580nm和585-620nm。激發(fā)波長為515nm〇
[0136] 實驗結(jié)果如圖11所示，表明：熒光染料化合物A3對照組HepG2細胞胞質(zhì)中在585-620nm(對照組圖11a)處有明顯而且強熒光信號，而在550-580nm處基本沒有熒光信號（對照 組圖1 lb)。當實驗組內(nèi)加入三磷酸腺苷酶抑制劑后，三磷酸腺苷酶含量減少，熒光染料化合 物A3在585-620nm(實驗組圖11c)處的熒光信號明顯減弱，而在550-580nm處的熒光明顯減 弱（實驗組圖lid)。因此，550-580nm處熒光強度與585-620nm的熒光強度比例值逐漸降低。 此實驗結(jié)果表明熒光染料化合物A 3在活細胞內(nèi)可對三磷酸腺苷酶進行比例識別成像。
[0137] 實施例14
[0138] 制備熒光染料化合物A4
[0140] (1)熒光染料化合物A4的合成
[0141] 將20mmol化合物3-2和120mmol化合物B加入到含有20mmol EDC1及少量DMAP 20ml 乙酸乙酯溶液的圓底燒瓶中，氮氣保護。反應(yīng)加熱120°C回流持續(xù)反應(yīng)14h后停止。減壓蒸出 溶劑，柱色譜分離得紫色固體粉末化合物A 3，收率33 %。M1R (400MHz，DMS0) S1 〇 . 14 (m， 3H)，7.87-7.89(m，2H)，7.74(s，lH)，7.68(s，lH)，7.54(s，lH)，7.50(s，lH)，7.49(s，lH)， 7.39(s，lH)，6.66(s，lH)，6.05(s，lH)，4.54(s，lH),4.23-4.02(m，3H)，3.89(s，lH)，3.29 (m，4H)，2?42(m，2H)，1?43-1?39(m，9H)，1?13-1?02(m，7H)?
[0142] 實施例15
[0143] 熒光染料化合物六4對活細胞的細胞毒性
[0144] 使用上述實施例合成的熒光染料化合物A4，以不同終濃度(3.0和1 OyM)的A4分別孵 育HepG 2細胞，在37°C，5%C02孵育24h。然后，PBS震蕩漂洗5min X 3，再加入MTT用酶標儀測 定，重復三次。測試結(jié)果如圖12所示，顯示：不同濃度的熒光染料化合物A4孵育對HepG 2細 胞24小時之后，仍有90 %細胞存活。
[0145] 實施例16
[0146] 熒光染料化合物A4的水溶解性檢測試驗
[0147] 使用上述實施例合成的熒光染料化合物A4加入到水中，測定在不同濃度（2.0， 4.0，6.0，8. Oand 10.0 yM)熒光染料化合物A4水溶液的最大吸收波長下吸光度。測試結(jié)果如 圖13所示，顯示當熒光染料化合物A2濃度為6. OyM時，吸光度值未發(fā)生偏移，即化合物A4在水 中的溶解度為6.OyM。所用儀器分別是Agilent 8453紫外分光光度計。
[0148] 實施例17
[0149] 熒光染料化合物A4對活細胞中三磷酸腺苷酶的識別
[0150] 使用上述實施例合成的熒光染料化合物A4,以終濃度為lO.OyM的A4孵育HepG2細 胞，在37°C，5%⑶2孵育30分鐘。實驗組內(nèi)再加入三磷酸腺苷酶抑制劑孵育30分鐘。然后， PBS震蕩漂洗5min X 3，再加入細胞培養(yǎng)基，激光共聚焦成像。選取代表性區(qū)域，用干鏡(40 X)觀察，重復三次。熒光采集波段為550-580nm和585-620nm。激發(fā)波長為515nm〇
[0151] 實驗結(jié)果如圖14所示，表明：熒光染料化合物A4對照組HepG2細胞胞質(zhì)中在585-620nm(對照組圖14a)處有明顯而且強熒光信號，而在550-580nm處基本沒有熒光信號（對照 組圖14b)。當實驗組內(nèi)加入三磷酸腺苷酶抑制劑后，三磷酸腺苷酶含量減少，熒光染料化合 物A4在585-620nm(實驗組圖14c)處的熒光信號明顯減弱，而在550-580nm處的熒光明顯減 弱（實驗組圖14d)。因此，550-580nm處熒光強度與585-620nm的熒光強度比例值逐漸降低。 此實驗結(jié)果表明熒光染料化合物A 4在活細胞內(nèi)可對三磷酸腺苷酶進行比例識別成像。
[0152] 以上內(nèi)容是結(jié)合具體的優(yōu)選實施方式對本發(fā)明所作的進一步詳細說明，不能認定 本發(fā)明的具體實施只局限于這些說明。對于本發(fā)明所屬技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在 不脫離本發(fā)明構(gòu)思的前提下，還可以做出若干簡單推演或替換，都應(yīng)當視為屬于本發(fā)明的 保護范圍。作為熒光染料是本發(fā)明新化合物的一種用途，不能認定本發(fā)明的化合物僅用于 熒光染料，對于本發(fā)明所屬技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在基于本發(fā)明化合物用作熒光 染料的相同作用機理的考慮下，還可以做出若干簡單推理，得出本發(fā)明的化合物的其他應(yīng) 用用途，都應(yīng)當視為屬于本發(fā)明的保護范圍。
【主權(quán)項】
1. 含高能磷酸鍵的熒光染料，具有通式I的結(jié)構(gòu)：通式I中： 所述的 Ri和R2各自獨立選自：Cn烷基、-0 (CH2) nCH3、-0 (CH2) n0H、-0 (CH2) nNH2、-0 (CH2) nNHCH3、-0(CH2)nN(CH3)2、-0P(0)(CH2)nCH 3、-0P(0)(CH2)n0H、-0P(0)(CH2)nNH2、-0P(0)(CH2) nNHCH3、-0P(0)(CH2)nN(CH3) 2、-0P(0)(CH2)nP(0)CH3、-0P(0)(CH 2)nP(0)0H、-0P(0)(CH2)nP (0)NH2、-0P(0)(CH2) nP(0)NHCH3、-0P(0)(CH2)nP(0)N(CH3)2、H0[P(0)(0H)0-] n、H0[P(0) (〇13)0-]"、〇13[?(0)(〇1 3)0-]11、-0!1或-!1，其中11是1-8的整數(shù)； 所述的 R3選自：CP烷基、-CN、-(CH2)P0H、-(CH2) P0CH3、-(CH2)P0(CH2) q0H、-NH(CH2)PCH3、-NH (CH2) PNH2、- (CH2) PNH (CH2) qCH3、-NH (CH2) P0 (CH2) qCH3、-（ CH2) PNH2、-NH (CH2) PNH (CH2) qCH3、-N( CH3) (CH2) PCH3或-(CH2) PN( CH3) (CH2) qCH3，其中 p和 q各自獨立地選自 1 -8 的整數(shù)； 所述的 L選自：Cx 烷基、-0(CH2)x-、-(CH2)x0-、-0(CH 2)x0-、-0(CH2)x0(CH2) y-、-0(CH2)x0 (CH2)y0-、-NH(CH2)x-、-(CH2)xNH-、-NH(CH2) xNH-、-NH(CH2)xNHC(0)-、-NH(CH2)xC(0)NH-、-NH (CH 2) XNH (CH2) y_、-NH (CH2) XNH (CH2) yNH-、-0 (CH2) XNH-、-NH (CH2) x〇-、-0 (CH2) x0 (CH2) yNH-、-NH(CH2)xO(CH2) yNH-或-〇(CH2)xNH(CH2)y〇-，其中 x和y 各自獨立地選自 1-8 的整數(shù)； 所述的Μ選自：2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的含高能磷酸鍵的熒光染料，其特征在于:所述的RdPR2各自獨 立地選自：-0P (0) (CH2) nCH3、-0P (0) (CH2) n0H、-0P (0) (CH2) nNH2、-0P (0) (CH2) nNHCH3、-0P (0) (CH2)nN(CH3)2、-0P(0)(CH 2)nP(0)CH3、-0P(0)(CH2)nP(0)0H、-0P(0)(CH 2)nP(0)NH2、-0P(0) (CH2) nP(0)NHCH3、-0P(0)(CH2)nP(0)N(CH 3)2、H0[P(0)(0H)0-]n、H0[P(0)(CH3)0-] n、CH3[P(0) (CH3)〇-]n、-〇H或-H，其中n是1-8的整數(shù)。3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的含高能磷酸鍵的熒光染料，其特征在于:所述的RjPR2各自獨 立地選自 H0[P(0)(0H)0-]n、H0[P(0)(CH3)0-]n、CH 3[P(0)(CH3)0-]n、H0[P(0)(0H)0-]n、H0[P (0) (CH3)0-]n、-0P(0) (CH2)nP(0)0H、-0P(0) (CH2)n0H、-OH，其中 η 是 1-8 的整數(shù)。4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的含高能磷酸鍵的熒光染料，其特征在于：所述的R3選自心烷 基、-CN、-(CH2) P0H、-(CH2)P0CH3、-NH(CH2)PCH3、-NH(CH2) PNH2、-NH(CH2)P0(CH2)qCH3、-(CH2) PNH2、-NH (CH2) PNH (CH2) qCH3、-N (CH3) (CH2) PCH3 或-(CH2) PN (CH3) (CH2) qCH3，其中 p 和 q各自分別 選自1-8的整數(shù)。5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的含高能磷酸鍵的熒光染料，其特征在于:所述的所述的R3選自 CP 烷基、-CN、-NH (CH2) PCH3、-NH (CH2) P0 (CH2) qCH3、-NH (CH2) PNH (CH2) qCH3、-N (CH3) (CH2) PCH3， 其中P和q各自分別選自1-8的整數(shù)。6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的含高能磷酸鍵的熒光染料，其特征在于:所述的L選自&烷基、_ 0(CH2) x-、-(CH2)x0-、-0(CH2)x0-、-0(CH 2)x0(CH2)y-、-0(CH2) x0(CH2)y0-、-NH(CH2)x-、-(CH 2) XNH-、-NH (CH2) XNH-、-NH (CH2) XNHC (0) -、-NH (CH2) XC (0) NH-、-NH (CH2) XNH (CH2)廠、-NH (CH2) XNH (CH2) yNH-、-0 (CH2) XNH-、-NH (CH2) x〇-、-0 (CH2) x0 (CH2) yNH-、-NH (CH2) x0 (CH2) yNH-或-0 (CH2)xNH(CH2) y〇-，其中x和y各自分別選自1-8的整數(shù)。7. 權(quán)利要求1所述的含高能磷酸鍵的熒光染料，其特征在于:M選自8. 權(quán)利要求1所述的含高能磷酸鍵的熒光染料的制備方法，包括如下步驟： 1 )H-M-Br與R3-H按摩爾比1:1-1:5反應(yīng)，制備化合物R3-M-Br; 反應(yīng)溫度為0-200 °C，反應(yīng)時間為1-24小時，反應(yīng)溶劑選自二氯甲烷、乙醇、甲醇、丙酮、 1，4-二氧六環(huán)、丙三醇、乙酸乙酯、醋酸或其混合物； 2) 化合物R3-M-Br與化合物H-L-H按摩爾比1:1-1:15反應(yīng)，制備化合物R3-M-L-H : 反應(yīng)溫度0_180°C，反應(yīng)時間1-36小時，反應(yīng)溶劑選自二氯甲烷、乙醇、甲醇、丙酮、丙三 醇、乙酸乙酯、醋酸、乙二醇甲醚、乙二醇乙醚或其混合物； 3) 化合物R3-M-L-H與化合物B按照摩爾比1:1-1:6反應(yīng)，制備化合物I:反應(yīng)溫度25-160°C，反應(yīng)時間1-15小時，反應(yīng)溶劑選自二氯甲烷、乙醇、甲醇、丙酮、丙 三醇、乙酸乙酯、N，N-二甲基甲酰胺、水、醋酸或其混合物；縮合劑選自1-(3-二甲氨基丙 基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC1)、二環(huán)己基碳二亞胺(DCC);催化劑選用4-二甲氨基吡 啶。9. 權(quán)利要求1-7中任一權(quán)利要求所述的含高能磷酸鍵的熒光染料在生物檢測與標記中 的應(yīng)用。10. 權(quán)利要求9所述的應(yīng)用，其特征在于所述的生物檢測與標記目標物為細胞或組織中 的三磷酸腺苷酶。
【文檔編號】C09K11/06GK105820597SQ201610255237
【公開日】2016年8月3日
【申請日】2016年4月24日
【發(fā)明人】仉華, 王亞甫, 吳呈珂, 陳粵華, 郭海明, 程定璽
【申請人】河南師范大學