專利名稱：一種檢測(cè)血漿中亞甲藍(lán)含量的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種檢測(cè)血漿中亞甲藍(lán)含量的方法，屬于臨床檢驗(yàn)、藥物分析、生物分析和分析化學(xué)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
為了降低臨床上輸血感染病毒的危險(xiǎn)，增強(qiáng)輸血的安全性，一般采用亞甲藍(lán)滅活血漿中的病毒，即光化學(xué)病毒滅活法，即通過在血漿中加入一定量的光敏劑亞甲藍(lán)，在光照下產(chǎn)生光化學(xué)反應(yīng)，從而使血漿中病毒失活。為了保證血漿的安全性，在滅活前必須保證血漿中有足夠濃度的光敏劑亞甲藍(lán)(即足夠高的釋放量)，在滅活后的成品血漿中又必然保證 有足夠低濃度的光敏劑亞甲藍(lán)(即足夠低的殘留量)，從上述血漿處置工藝分析，這顯然是互相矛盾的。為了較好地解決這對(duì)矛盾，通常使用成套病毒滅活袋，它由亞甲藍(lán)貯藏裝置、光照病毒滅活袋、亞甲藍(lán)過濾裝置、成品血漿貯藏袋及其相應(yīng)的管線和開關(guān)組成。在血漿注入并通過亞甲藍(lán)貯藏裝置時(shí)，其中的亞甲藍(lán)被釋放出來，隨血漿進(jìn)入光照病毒滅活袋，在病毒滅活之后，通過亞甲藍(lán)過濾裝置濾除大多數(shù)的亞甲藍(lán)，從而獲得臨床用成品血漿。經(jīng)過過濾裝置濾除的血漿，其殘留的亞甲藍(lán)的濃度雖然在安全范圍內(nèi)，但對(duì)于必須大量或長(zhǎng)期輸注血漿或輸血漿后預(yù)期將長(zhǎng)期存活的患者，其影響仍不得而知，特別是致突變的風(fēng)險(xiǎn)有可能增加，所以控制血漿中殘留亞甲藍(lán)濃度有重要意義。目前，檢測(cè)血漿中亞甲藍(lán)含量的測(cè)定方法有分光光度法、化學(xué)發(fā)光法、高效液相色譜法及以金納米微粒為探針的共振瑞利散射法等，這些方法有靈敏度低和/或操作繁瑣等缺點(diǎn)，常常還需要消耗較大量的血漿。2012年版《中國(guó)輸血技術(shù)操作規(guī)程》中報(bào)道了血漿中亞甲藍(lán)殘留量檢測(cè)方法，采用了固相萃取小柱對(duì)血漿樣品和標(biāo)準(zhǔn)品中的亞甲藍(lán)進(jìn)行萃取分離，結(jié)合分光光度法測(cè)定其殘留量。然而，在實(shí)際應(yīng)用中發(fā)現(xiàn)該方法存在兩個(gè)顯著的缺點(diǎn)(1)操作特別煩瑣、費(fèi)時(shí)，血漿消耗量大；(2)樣本測(cè)定吸光度值特別低，通常小于0.01 ;這與《中華人民共和國(guó)藥典》“附錄IV A紫外-可見分光光度法”項(xiàng)下所規(guī)定的準(zhǔn)確測(cè)定含量所需要的吸光度0.3、. 7比較，所測(cè)定殘留量顯然是不準(zhǔn)確的。而事實(shí)上，在低殘留量時(shí)，吸光度的重現(xiàn)性特別差，預(yù)示著測(cè)定結(jié)果的不可靠。這一點(diǎn)與文獻(xiàn)報(bào)道也是一致的。對(duì)于通常的亞甲藍(lán)殘留量為0.13umol/L(微摩爾/升)時(shí)，楊夏等[病毒滅活血漿亞甲藍(lán)含量的檢測(cè)及質(zhì)量控制，中國(guó)輸血雜志，2011，24 =881-883]的方法測(cè)定，其吸光度應(yīng)為0. 0076，白莉等[固相萃取法檢測(cè)病毒滅活血漿中的亞甲藍(lán)，醫(yī)藥論壇雜志，2010，31 =108-109]的方法測(cè)定，其吸光度應(yīng)為0.0042，張淑琴等[血漿中亞甲藍(lán)含量的檢測(cè)，臨床輸血與檢驗(yàn)，2010，12 36-38]的方法測(cè)定，其吸光度應(yīng)為0. 0011。由上可見，對(duì)于實(shí)際樣本，這些吸光度值均是如此之低，顯然，固相萃取一紫外可見分光光度法測(cè)定結(jié)果的可靠性極低。針對(duì)上述問題，周群剛等[文獻(xiàn)I : P -環(huán)糊精增敏熒光分光光度法檢測(cè)血漿亞甲藍(lán)，臨床檢驗(yàn)雜志，2011，29 (5) =344-345]公開了一種P _環(huán)糊精增敏熒光分光光度法測(cè)定血漿中光敏劑亞甲藍(lán)，相對(duì)于上述方法，該方法明顯克服了上述兩個(gè)缺點(diǎn)。但是，該方法能準(zhǔn)確檢測(cè)的最低定量限為0. 089 iimol/L，即略低于通常的亞甲藍(lán)殘留量(目前，對(duì)于通常使用的 成套病毒滅活袋，其亞甲藍(lán)殘留通常在0. 13umol/L左右)。事實(shí)上，實(shí)際血漿樣本中最低殘留量往往會(huì)低于0. 089 u mol/L,如文獻(xiàn)2 [亞甲藍(lán)/光化學(xué)法在血漿病毒滅活中應(yīng)用，中國(guó)公共衛(wèi)生，2008,24(11)，1365]中提到該研究中亞甲藍(lán)的最終殘留量為0.071.621! mol/L (文章第四段)。況且，從長(zhǎng)遠(yuǎn)分析，隨著技術(shù)的發(fā)展和人們對(duì)血漿要求的提高，亞甲藍(lán)殘留量將會(huì)越來越低。這顯然會(huì)導(dǎo)致文獻(xiàn)I中的方法失效，無法用于血漿亞甲藍(lán)殘留的常規(guī)檢控。因此，開發(fā)一種檢測(cè)血漿中亞甲藍(lán)含量的方法，以進(jìn)一步降低檢測(cè)限，并提高檢測(cè)靈敏度，具有積極的現(xiàn)實(shí)意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的是提供一種檢測(cè)血漿中亞甲藍(lán)含量的方法，以進(jìn)一步降低檢測(cè)限，并提聞檢測(cè)靈敏度。為達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是一種檢測(cè)血漿中亞甲藍(lán)含量的方法，包括如下步驟
(a)向空白血漿中加入羧甲基-￠-環(huán)糊精飽和溶液，使其濃度為f4.5mmol/L，定容，得血漿空白樣本，采用熒光分光光度計(jì)進(jìn)行檢測(cè)，測(cè)得熒光峰強(qiáng)度或熒光峰面積為Fo ；
(b)向空白血漿中加入定量的亞甲藍(lán)溶液，并加入羧甲基-￠-環(huán)糊精飽和溶液，加入濃度與上述血漿空白樣本相同，定容，得含亞甲藍(lán)濃度為Cs的血漿標(biāo)準(zhǔn)樣本，采用熒光分光光度計(jì)進(jìn)行檢測(cè)，測(cè)得熒光峰強(qiáng)度或熒光峰面積為Fs ；
(C)向含亞甲藍(lán)的待測(cè)血漿樣本中加入羧甲基-￠-環(huán)糊精飽和溶液，加入濃度與上述血漿空白樣本相同，定容，得含亞甲藍(lán)濃度為Cx的血漿待測(cè)樣本，采用熒光分光光度計(jì)進(jìn)行檢測(cè)，測(cè)得熒光峰強(qiáng)度或熒光峰面積為Fx ；
然后按對(duì)照品比較法計(jì)算即可得到待測(cè)血漿樣本中的亞甲藍(lán)濃度Cx ；
所述步驟(a)、(b)和(C)中采用的熒光分光光度計(jì)進(jìn)行檢測(cè)的條件相同，激發(fā)波長(zhǎng)為665±8nm，發(fā)射波長(zhǎng)掃描范圍為67(T715nm，激發(fā)狹縫寬度2 10nm，發(fā)射狹縫寬度2 10nm，掃描速度100 1000nm/min,激發(fā)光程2 IOmm,發(fā)射光程2 10mm。上文中，所述向空白血漿中加入羧甲基-￠-環(huán)糊精飽和溶液，使其濃度為1^4. 5mmol/L,這里的濃度是指加入羧甲基-P -環(huán)糊精飽和溶液之后的血漿中的羧甲基-￠-環(huán)糊精的摩爾濃度。上述技術(shù)方案中，所述步驟(a)、(b)和(C)中的定容采用緩沖液或二蒸水進(jìn)行，所述PBS緩沖液、Tris-HCl緩沖液或磷酸二氫鈉緩沖液。優(yōu)選的，所述緩沖液為PBS緩沖液。其pH值為7. 2。與之相應(yīng)的另一種技術(shù)方案，一種檢測(cè)血漿中亞甲藍(lán)含量的方法，包括如下步驟
(a)向至少5個(gè)空白血漿中分別加入不同量的亞甲藍(lán)溶液，并加入羧甲基-￠-環(huán)糊精飽和溶液，加入濃度與上述血漿空白樣本相同，定容，得含亞甲藍(lán)系列濃度的血漿標(biāo)準(zhǔn)樣本，采用熒光分光光度計(jì)進(jìn)行檢測(cè)，測(cè)得一系列熒光峰強(qiáng)度或熒光峰面積；(b)向含亞甲藍(lán)的待測(cè)血漿樣本中加入羧甲基-￠-環(huán)糊精飽和溶液，加入濃度與上述空白血漿樣本相同，定容，得含亞甲藍(lán)濃度為Cx的血漿待測(cè)樣本，采用熒光分光光度計(jì)進(jìn)行檢測(cè)，測(cè)得熒光峰強(qiáng)度或熒光峰面積為Fx ；
按標(biāo)準(zhǔn)曲線法計(jì)算即可得到待測(cè)血漿樣本中的亞甲藍(lán)濃度Cx ；
所述步驟(a)和(b)中采用的熒光分光光度計(jì)進(jìn)行檢測(cè)的條件相同，激發(fā)波長(zhǎng)為665±8nm，發(fā)射波長(zhǎng)掃描范圍為67(T715nm，激發(fā)狹縫寬度2 10nm，發(fā)射狹縫寬度2 lOnm，掃描速度IOO lOOOnm/min,激發(fā)光程2 IOmm,發(fā)射光程2 10mm。上述技術(shù)方案中，在步驟(a)之前，還進(jìn)行如下步驟(C):向空白血漿中加入羧甲基-P -環(huán)糊精飽和溶液，使其濃度為廣4. 5mmol/L,定容，得血漿空白樣本，采用熒光分光光度計(jì)進(jìn)行檢測(cè)，測(cè)得熒光峰強(qiáng)度或熒光峰面積為Fo。 上文中，所述向空白血漿中加入羧甲基-￠-環(huán)糊精飽和溶液，使其濃度為1^4. 5mmol/L,這里的濃度是指加入羧甲基-P -環(huán)糊精飽和溶液之后的血漿中的羧甲基-￠-環(huán)糊精的摩爾濃度。上文中，按標(biāo)準(zhǔn)曲線法計(jì)算待測(cè)血漿樣本中的亞甲藍(lán)濃度時(shí)，其中的熒光信號(hào)可以扣除基底，也可以不扣除基底。上述技術(shù)方案中，所述步驟(a)、(b)和(C)中的定容采用緩沖液或二蒸水進(jìn)行，所述緩沖液為PBS緩沖液、Tris-HCl緩沖液或磷酸二氫鈉緩沖液。優(yōu)選的，所述緩沖液為PBS緩沖液。其pH值為7. 2。相對(duì)于周群剛等[文獻(xiàn)I : @ -環(huán)糊精增敏熒光分光光度法檢測(cè)血漿亞甲藍(lán)，臨床檢驗(yàn)雜志，2011，29 (5) =344-345]公開的一種P _環(huán)糊精增敏熒光分光光度法，本發(fā)明既保留了上述方法的優(yōu)點(diǎn)，同時(shí)又克服了上述方法的缺點(diǎn)。其根源在于，本發(fā)明所利用的基本原理與上述方法有顯著的不同。文獻(xiàn)I中的方法是基于￠-環(huán)糊精內(nèi)腔的疏水相互作用導(dǎo)致熒光分子亞甲藍(lán)進(jìn)入該內(nèi)腔，形成超分子包合物，從而增強(qiáng)亞甲藍(lán)的熒光，提高其檢測(cè)靈敏度，降低方法的最低定量限。而本發(fā)明除了利用上述疏水相互作用而增強(qiáng)亞甲藍(lán)熒光以夕卜，還利用了另一個(gè)更為重要的相互作用，即羧甲基-￠-環(huán)糊精所帶的負(fù)電荷與亞甲藍(lán)所帶正電荷之間的強(qiáng)烈的電性相互作用，使亞甲藍(lán)進(jìn)入疏水性內(nèi)腔的程度顯著增加，形成超分子包合物的能力更強(qiáng)，從而導(dǎo)致了本發(fā)明的檢測(cè)靈敏度顯著提高，最低定量限也顯著降低，試驗(yàn)證明本發(fā)明的最低檢測(cè)限已經(jīng)低至0.012 ymol/L，取得了意想不到的效果，使本發(fā)明的方法能夠有效地用于血漿中病毒滅活光敏劑亞甲藍(lán)殘留量的有效檢測(cè)。本發(fā)明的檢測(cè)方法可用于血漿中亞甲藍(lán)的含量測(cè)定和血漿中殘留亞甲藍(lán)的測(cè)定，也可用于血漿病毒滅活之前亞甲藍(lán)的釋放量與釋放效率測(cè)定、以及病毒滅活之后濾器對(duì)亞甲藍(lán)的過濾效率測(cè)定，也可用于成品血漿中光敏劑亞甲藍(lán)的殘留量測(cè)定。由于上述技術(shù)方案運(yùn)用，本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有下列優(yōu)點(diǎn)
I.本發(fā)明開發(fā)了一種新的檢測(cè)血漿中亞甲藍(lán)含量的方法，試驗(yàn)證明本發(fā)明的最低檢測(cè)限已經(jīng)低至0. 012 y mol/L，取得了意想不到的效果。2.本發(fā)明的測(cè)定方法簡(jiǎn)單、快速，不經(jīng)分離、富集直接測(cè)定血漿中亞甲藍(lán)，且血漿消耗量較少，節(jié)約寶貴的血漿資源，特別適用于血漿制品病毒滅活過程中的亞甲藍(lán)釋放量、濾除量及其殘留量的常規(guī)檢控。3.本發(fā)明的標(biāo)準(zhǔn)曲線線性回歸性好，定量限低；本發(fā)明經(jīng)線性范圍測(cè)定試驗(yàn)，證明亞甲藍(lán)在0. 012^2. 50 u mol/L范圍內(nèi)，濃度與響應(yīng)呈良好的線性關(guān)系，血漿樣品工作曲線為F=91. 223C+4. 942，r = 0. 9987，能夠滿足血漿中亞甲藍(lán)的質(zhì)控要求。4.實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明在線性范圍內(nèi)的回收率為99. 7 106. 1%;中濃度亞甲藍(lán)(I. 07 u mol/L)測(cè)定的日內(nèi)變異系數(shù)(CV)為0. 13%、日間CV為3. 4% ;具有較高的檢測(cè)精密度和準(zhǔn)確度。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步描述
實(shí)施例一
一種檢測(cè)血漿中亞甲藍(lán)含量的方法，包括如下步驟 120 iiL，得血漿空白樣本；
向300 u L空白血漿中加入5 u mol/L亞甲藍(lán)儲(chǔ)備液56 y L，并加入羧甲基-@ -環(huán)糊精飽和溶液280 u L，加入PBS緩沖液64 u L，得含亞甲藍(lán)的血漿標(biāo)準(zhǔn)樣本；
向300 ii L含亞甲藍(lán)的待測(cè)血漿樣本中加入羧甲基-@ -環(huán)糊精飽和溶液280 u L，加入PBS緩沖液120 u L，得血漿待測(cè)樣本；
采用熒光分光光度計(jì)進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)條件為激發(fā)波長(zhǎng)665nm，發(fā)射波長(zhǎng)680nm，激發(fā)和發(fā)射狹縫寬度均為5nm,掃描速度100nm/min,激發(fā)光程IOmm,發(fā)射光程IOmm,測(cè)定上述樣本的熒光強(qiáng)度，據(jù)此數(shù)據(jù)按照對(duì)照品比較法計(jì)算待測(cè)血漿樣本中亞甲藍(lán)濃度。
采用實(shí)施例一所述的方法，做了一系列測(cè)定，并與文獻(xiàn)I [ P -環(huán)糊精增敏熒光分光光度法檢測(cè)血漿亞甲藍(lán)，臨床檢驗(yàn)雜志，2011，29 (5) =344-345]公開的P -環(huán)糊精增敏熒光分光光度法做對(duì)比，結(jié)果如下
權(quán)利要求
1.一種檢測(cè)血漿中亞甲藍(lán)含量的方法，其特征在于，包括如下步驟 (a)向空白血漿中加入羧甲基-￠-環(huán)糊精飽和溶液，使其濃度為f4.5mmol/L，定容，得血漿空白樣本，采用熒光分光光度計(jì)進(jìn)行檢測(cè)，測(cè)得熒光峰強(qiáng)度或熒光峰面積為Fo ； (b)向空白血漿中加入定量的亞甲藍(lán)溶液，并加入羧甲基-￠-環(huán)糊精飽和溶液，加入濃度與上述血漿空白樣本相同，定容，得含亞甲藍(lán)濃度為Cs的血漿標(biāo)準(zhǔn)樣本，采用熒光分光光度計(jì)進(jìn)行檢測(cè)，測(cè)得熒光峰強(qiáng)度或熒光峰面積為Fs ； (C)向含亞甲藍(lán)的待測(cè)血漿樣本中加入羧甲基-￠-環(huán)糊精飽和溶液，加入濃度與上述血漿空白樣本相同，定容，得含亞甲藍(lán)濃度為Cx的血漿待測(cè)樣本，采用熒光分光光度計(jì)進(jìn)行檢測(cè)，測(cè)得熒光峰強(qiáng)度或熒光峰面積為Fx ； 然后按對(duì)照品比較法計(jì)算即可得到待測(cè)血漿樣本中的亞甲藍(lán)濃度Cx ； 所述步驟(a)、(b)和(C)中采用的熒光分光光度計(jì)進(jìn)行檢測(cè)的條件相同，激發(fā)波長(zhǎng)為665±8nm，發(fā)射波長(zhǎng)掃描范圍為67(T715nm，激發(fā)狹縫寬度2 10nm，發(fā)射狹縫寬度2 10nm，掃描速度100 1000nm/min,激發(fā)光程2 IOmm,發(fā)射光程2 10mm。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的檢測(cè)血漿中亞甲藍(lán)含量的方法，其特征在于所述步驟(a)、(b)和(c)中的定容采用緩沖液或二蒸水進(jìn)行，所述緩沖液為PBS緩沖液、Tris-HCl緩沖液或磷酸二氫鈉緩沖液。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的檢測(cè)血漿中亞甲藍(lán)含量的方法，其特征在于所述緩沖液為PBS緩沖液。
4.一種檢測(cè)血漿中亞甲藍(lán)含量的方法，其特征在于，包括如下步驟 (a)向至少5個(gè)空白血漿中分別加入不同量的亞甲藍(lán)溶液，并加入羧甲基-￠-環(huán)糊精飽和溶液，加入濃度與上述血漿空白樣本相同，定容，得含亞甲藍(lán)系列濃度的血漿標(biāo)準(zhǔn)樣本，采用熒光分光光度計(jì)進(jìn)行檢測(cè)，測(cè)得一系列熒光峰強(qiáng)度或熒光峰面積； (b)向含亞甲藍(lán)的待測(cè)血漿樣本中加入羧甲基-￠-環(huán)糊精飽和溶液，加入濃度與上述空白血漿樣本相同，定容，得含亞甲藍(lán)濃度為Cx的血漿待測(cè)樣本，采用熒光分光光度計(jì)進(jìn)行檢測(cè)，測(cè)得熒光峰強(qiáng)度或熒光峰面積為Fx ； 按標(biāo)準(zhǔn)曲線法計(jì)算即可得到待測(cè)血漿樣本中的亞甲藍(lán)濃度Cx ； 所述步驟(a)和(b)中采用的熒光分光光度計(jì)進(jìn)行檢測(cè)的條件相同，激發(fā)波長(zhǎng)為665±8nm，發(fā)射波長(zhǎng)掃描范圍為67(T715nm，激發(fā)狹縫寬度2 10nm，發(fā)射狹縫寬度2 10nm，掃描速度100 1000nm/min,激發(fā)光程2 IOmm,發(fā)射光程2 10mm。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的檢測(cè)血漿中亞甲藍(lán)含量的方法，其特征在于，在步驟(a)之前，還進(jìn)行如下步驟(C):向空白血漿中加入羧甲基-￠-環(huán)糊精飽和溶液，使其濃度為r4. 5mmol/L，定容，得血漿空白樣本，采用熒光分光光度計(jì)進(jìn)行檢測(cè)，測(cè)得熒光峰強(qiáng)度或熒光峰面積為Fo。
6.根據(jù)權(quán)利要求4或5所述的檢測(cè)血漿中亞甲藍(lán)含量的方法，其特征在于所述步驟(a)、(b)和(c)中的定容采用緩沖液或二蒸水進(jìn)行，所述緩沖液為PBS緩沖液、Tris-HCl緩沖液或磷酸二氫鈉緩沖液。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的檢測(cè)血漿中亞甲藍(lán)含量的方法，其特征在于所述緩沖液為PBS緩沖液。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種檢測(cè)血漿中亞甲藍(lán)含量的方法，包括如下步驟(a)向空白血漿中加入羧甲基-β-環(huán)糊精飽和溶液，使其濃度為1～4.5mmol/L，定容，得血漿空白樣本；(b)向空白血漿中加入定量的亞甲藍(lán)溶液，并加入羧甲基-β-環(huán)糊精飽和溶液，得含亞甲藍(lán)濃度為Cs的血漿標(biāo)準(zhǔn)樣本；(c)向含亞甲藍(lán)的待測(cè)血漿樣本中加入羧甲基-β-環(huán)糊精飽和溶液，得含亞甲藍(lán)濃度為Cx的血漿待測(cè)樣本，檢測(cè)上述樣本的熒光峰強(qiáng)度或熒光峰面積；然后按對(duì)照品比較法計(jì)算即可得到待測(cè)血漿樣本中的亞甲藍(lán)濃度Cx。本發(fā)明的最低檢測(cè)限已經(jīng)低至0.012μmol/L，取得了意想不到的效果。
文檔編號(hào)G01N21/64GK102706844SQ20121018615
公開日2012年10月3日 申請(qǐng)日期2012年6月7日 優(yōu)先權(quán)日2012年6月7日
發(fā)明者周群剛, 唐建華, 徐軍, 方敏, 王明元, 謝洪平, 謝蓮 申請(qǐng)人:蘇州大學(xué), 蘇州市中心血站