專(zhuān)利名稱(chēng)：多表位測(cè)定的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及親和力測(cè)定的領(lǐng)域。具體地，本發(fā)明涉及一種在親和力測(cè)定中檢測(cè)生物學(xué)靶標(biāo)的方法以及生物學(xué)靶標(biāo)的檢測(cè)配置。
背景技術(shù)：
親和力測(cè)定是測(cè)量溶液中的物質(zhì)，分析物的存在或濃度的生物化學(xué)測(cè)試，所述溶液通常包含物質(zhì)的復(fù)雜混合物，例如生物學(xué)液體，如血液、唾液、血清或尿。這樣的測(cè)定基于給定分子或所述分子的特定部分如抗體以高特異性結(jié)合至一種或非常有限組的其他分子的能力。測(cè)定的特異性取決于分析物能夠結(jié)合至其特異性結(jié)合伙伴以排除待分析的樣品中的所有其他物質(zhì)的程度。
除了需要特異性，必須選擇對(duì)分析物具有足夠高親和力的結(jié)合伙伴以產(chǎn)生準(zhǔn)確和可重復(fù)的測(cè)量，即可測(cè)量信號(hào)。在歷史上，這通過(guò)測(cè)量一些物理特征如光散射的變化或折射率的變化來(lái)完成。通過(guò)現(xiàn)代儀器，這類(lèi)方法再次越來(lái)越受歡迎。然而，現(xiàn)在的大多數(shù)免疫測(cè)定依賴(lài)于使用分析試劑以結(jié)合至分析物，所述分析試劑與可檢測(cè)的標(biāo)記相關(guān)。已證實(shí)各種標(biāo)記，包括用于放射免疫測(cè)定的放射性元素；酶；熒光、磷光和化學(xué)發(fā)光染料；乳膠和磁性顆粒；染料微晶、金、銀和硒膠體顆粒；金屬螯合物；輔酶；電活性基團(tuán)；寡核苷酸、穩(wěn)定的自由基、聚合物等。這類(lèi)標(biāo)記用于分離游離和結(jié)合的標(biāo)記試劑之后檢測(cè)和定量結(jié)合事件，或者通過(guò)以結(jié)合事件影響標(biāo)記產(chǎn)生的信號(hào)的變化這樣的方式設(shè)計(jì)系統(tǒng)來(lái)檢測(cè)和定量結(jié)合事件。
親和力測(cè)定通常探測(cè)肽、蛋白、寡核苷酸、寡糖或小分子如適配體與固定的結(jié)合伙伴的相互作用。典型的結(jié)合伙伴包括蛋白，其可以為受體、酶或抗體，但是還包括多肽和多氨基酸(例如，鎳結(jié)合位點(diǎn)的多His標(biāo)簽、酰胺或Schiff堿連接的多賴(lài)氨酸、硫醚連接的多半胱氨酸)。例如，基于固定方案的鏈霉親和素廣泛用于將生物素化的生物學(xué)元素連接至測(cè)定表面。
例如，親和力測(cè)定可以進(jìn)一步分類(lèi)為競(jìng)爭(zhēng)性和非競(jìng)爭(zhēng)性測(cè)定。在競(jìng)爭(zhēng)性親和力測(cè)定中，生物學(xué)樣品中的分析物與標(biāo)記的分析物類(lèi)似物競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合其伙伴。然后測(cè)量結(jié)合至伙伴的標(biāo)記的分析物類(lèi)似物的量。在這種方法中，反應(yīng)信號(hào)與生物學(xué)樣品中分析物的濃度成反比。這是因?yàn)榉磻?yīng)信號(hào)越大，樣品中越少分析物可用于與標(biāo)記的分析物類(lèi)似物競(jìng)爭(zhēng)。
在非競(jìng)爭(zhēng)性親和力測(cè)定中，其也稱(chēng)為“夾心測(cè)定”，生物學(xué)樣品中的分析物結(jié)合至其伙伴，然后標(biāo)記試劑結(jié)合至所述分析物。然后測(cè)量位點(diǎn)上標(biāo)記試劑的量。不像競(jìng)爭(zhēng)性方法，非競(jìng)爭(zhēng)性方法即夾心測(cè)定的結(jié)果直接與生物學(xué)樣品中分析物的濃度成比例。這是因?yàn)槿绻飳W(xué)樣品中不存在分析物，則標(biāo)記試劑不會(huì)結(jié)合。
親和力測(cè)定，特別是免疫測(cè)定廣泛用作細(xì)菌、病毒、內(nèi)分泌和寄生疾病的診斷工具以及濫用和慢性疾病狀態(tài)的檢測(cè)藥物，一個(gè)實(shí)例是可以導(dǎo)致心臟病發(fā)作的心臟疾病。
各種技術(shù)如放射免疫測(cè)定、免疫過(guò)氧化物酶和ELISA目前用于親和力測(cè)定，特別是免疫測(cè)定。然而，放射免疫測(cè)定具有需要使用危險(xiǎn)和破壞環(huán)境的試劑的缺點(diǎn)。
此外，除了特異性，如上文所述，靈敏度對(duì)于測(cè)定性能是至關(guān)重要的。測(cè)定的靈敏CN 102947703 A書(shū)明說(shuō)2/15 頁(yè)度可以通過(guò)結(jié)合事件產(chǎn)生的特異性信號(hào)與系統(tǒng)的背景噪聲相比的比例來(lái)定義。
降低信噪比(SNR)的因素包括試劑如抗體非特異性結(jié)合至測(cè)定的各種組分。此外，與測(cè)定的試劑如酶底物反應(yīng)的測(cè)定基質(zhì)的一些內(nèi)源性組分的活性?xún)A向于產(chǎn)生“假”反應(yīng)產(chǎn)物，其干擾標(biāo)記的復(fù)合物如標(biāo)記的抗體_抗原復(fù)合物形成的“真正”產(chǎn)物的準(zhǔn)確檢測(cè)。
通常，將添加劑如封閉試劑加入測(cè)定基質(zhì)以降低測(cè)定噪聲并減少假陽(yáng)性信號(hào)。發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種與現(xiàn)有技術(shù)已知的親和力測(cè)定相比具有更高信噪比的親和力測(cè)定。
本發(fā)明的另一目的是提供這樣的親和力測(cè)定，其適合廣泛的分析物。
具體地，本發(fā)明的目的是提供一種適合整合入醫(yī)療點(diǎn)或者臺(tái)面、裝置和微型化的親和力測(cè)定。
本發(fā)明的另一目的是提供一種產(chǎn)生最少假陽(yáng)性結(jié)果的快速和可靠的親和力測(cè)定。
這些目的通過(guò)用獨(dú)立權(quán)利要求所示的親和力測(cè)定檢測(cè)生物學(xué)樣品中的生物學(xué)靶標(biāo)的方法來(lái)實(shí)現(xiàn)。從屬權(quán)利要求表明優(yōu)選的實(shí)施方案。在這種上下文中值得注意的是，以下描述中給出的所有范圍應(yīng)當(dāng)理解為它們包括限定這些范圍的值。·


本發(fā)明的這些和其他方面參考下文所述的實(shí)施方案會(huì)清楚和闡明。
圖I圖示根據(jù)本發(fā)明將捕獲的生物學(xué)靶標(biāo)濃縮為小于生物學(xué)樣品體積的洗脫體積以及檢測(cè)和/或定量的進(jìn)一步任選存在的步驟的一個(gè)實(shí)例。
圖2圖示根據(jù)本發(fā)明在親和力測(cè)定中檢測(cè)生物學(xué)靶標(biāo)的方法的一個(gè)實(shí)例。
圖3示出本發(fā)明怎樣實(shí)現(xiàn)增加信噪比的目的的另一方面。
圖4示出第一捕獲部分的組織的實(shí)例。
圖5示出合適的接頭的模塊設(shè)計(jì)的一些實(shí)例。
圖6示出富集的3-表位親和力測(cè)定的概念驗(yàn)證。
圖7示出來(lái)自建立心肌肌鈣蛋白-I (cTnl)和前列腺特異性抗原(PSA)的3_表位親和力測(cè)定的初步實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。
圖8圖示熱切割然后競(jìng)爭(zhēng)性親和力測(cè)定的實(shí)例。
圖9更詳細(xì)地示出3-表位測(cè)定中的第一捕獲部分不干擾檢測(cè)。
圖10示出捕獲時(shí)間常數(shù)的確定。
圖11示出步驟c)的評(píng)價(jià)，即對(duì)各種體積濃縮因素的生物學(xué)靶標(biāo)濃縮的評(píng)價(jià)。
圖12示出步驟c)的劑量反應(yīng)曲線，即生物學(xué)靶標(biāo)濃縮的劑量反應(yīng)曲線。
具體實(shí)施方式
根據(jù)本發(fā)明，通過(guò)親和力測(cè)定檢測(cè)生物學(xué)樣品中的生物學(xué)靶標(biāo)的方法包括以下步驟
a)提供包含所述生物學(xué)靶標(biāo)的生物學(xué)樣品體積；
b)將第一捕獲部分加入包含所述生物學(xué)靶標(biāo)的生物學(xué)樣品體積，其中所述第一捕5獲部分粘附至顆粒；
c)將捕獲的生物學(xué)靶標(biāo)濃縮為小于步驟a)中的生物學(xué)樣品體積的洗脫體積；
d)從所述顆粒切割所述第一捕獲部分或所述生物學(xué)靶標(biāo)；
e)以?shī)A心或競(jìng)爭(zhēng)性親和力測(cè)定形式直接或間接檢測(cè)和/或定量所述生物學(xué)靶標(biāo)， 其中所述生物學(xué)靶標(biāo)與至少一種捕獲部分相關(guān)，優(yōu)選與至少兩種捕獲部分相關(guān)。
這種親和力測(cè)定具有這樣的優(yōu)勢(shì)，將生物學(xué)靶標(biāo)濃縮并去除可以干擾檢測(cè)的因素，因此導(dǎo)致增加的特異性結(jié)合和減少的非特異性結(jié)合，從而導(dǎo)致測(cè)定的大大增加的信噪比和更高的靈敏度。
具體地，生物學(xué)靶標(biāo)結(jié)合至第一捕獲部分與生物學(xué)靶標(biāo)的檢測(cè)和/或定量分開(kāi)是有益的。因此第一捕獲部分的量與粘附的顆粒可以是大的，以便捕獲盡可能多的生物學(xué)靶標(biāo)，但是第一捕獲部分與粘附的顆粒不干擾生物學(xué)靶標(biāo)的檢測(cè)和/或定量。例如，如果第一捕獲部分與粘附至它們的大磁性顆粒用來(lái)捕獲大體積的生物學(xué)靶標(biāo)，例如生物學(xué)樣品，其比較小的顆粒更易于驅(qū)動(dòng)。因此，更易于從大體積(生物學(xué)樣品)收集這些較 大的顆粒，并且將它們和結(jié)合的生物學(xué)靶標(biāo)轉(zhuǎn)移至較小的體積(洗脫體積)。
如本文所用，術(shù)語(yǔ)“生物學(xué)靶標(biāo)”指待檢測(cè)的生物學(xué)來(lái)源的物質(zhì)。生物學(xué)靶標(biāo)的非限制性實(shí)例為蛋白、肽、抗體、毒性物質(zhì)、脂質(zhì)、氨基酸、胺、信使或小分子、碳水化合物、細(xì)胞組分、病毒、細(xì)胞外基質(zhì)的組分、細(xì)胞、細(xì)胞片段、核酸、半抗原和/或藥物。
如本文所用，術(shù)語(yǔ)“親和力測(cè)定”指測(cè)量生物學(xué)靶標(biāo)的存在或濃度的生物化學(xué)測(cè)試，其基于捕獲部分以高特異性結(jié)合至生物學(xué)靶標(biāo)以及任選地結(jié)合至一種或非常有限組的其他分子的能力。
如本文所用，術(shù)語(yǔ)“生物學(xué)樣品體積”指其中最初提供生物學(xué)靶標(biāo)的體積或部分體積。
如本文所用，術(shù)語(yǔ)“捕獲部分”指結(jié)合元件，例如這樣的部分，其包含選擇性結(jié)合至生物學(xué)靶標(biāo)的表位的互補(bǔ)性決定區(qū)域并可以結(jié)合至至少一種其他實(shí)體如顆粒，并且可以具有與其相關(guān)的試劑。
在一優(yōu)選實(shí)施方案中，捕獲部分為抗體，例如動(dòng)物抗體、人抗體、人嵌合抗體和人源化抗體及其片段，如Fab片段等，或者為適配體，或者為核酸或多肽或包含結(jié)合位點(diǎn)的任何物質(zhì)。
如本文所用，術(shù)語(yǔ)“結(jié)合元件”指另一元件可以結(jié)合或關(guān)聯(lián)的位點(diǎn)。在本發(fā)明的一優(yōu)選實(shí)施方案中，結(jié)合位點(diǎn)為表位，即抗原決定簇，即被免疫系統(tǒng)，特別是抗體、B細(xì)胞或T 細(xì)胞識(shí)別的抗原部分。
適配體是結(jié)合至特異性祀分子的寡核酸(oligonucleic acid)或肽分子。適配體通常通過(guò)從大的隨機(jī)序列池選擇來(lái)產(chǎn)生，但是天然適配體還存在于核糖開(kāi)關(guān)(riboswitch) 中。
如本文所用，術(shù)語(yǔ)“顆?！敝改軌蛑С植东@部分的粘附的結(jié)構(gòu)，例如珠。顆?？梢灾苽渥原傊?、聚苯乙烯、乳膠、聚乙烯醇、硅。在一優(yōu)選實(shí)施方案中，顆?？梢跃哂?5 μ m-o. I μ 的直徑，更優(yōu)選 I μ m-0. 3 μ m,即彡 O. 3、0· 4、0· 5、0· 6、0· 7、0· 8、0· 9 和 / 或 < I μ m0
如本文所用，術(shù)語(yǔ)“切割”指從顆粒分離捕獲部分或者從捕獲部分分離生物學(xué)靶標(biāo)。
如本文所用，術(shù)語(yǔ)“粘附至”指捕獲部分通過(guò)接頭粘附至顆粒之一的情況。
如本文所用，術(shù)語(yǔ)“接頭”指允許從顆粒分離第一捕獲部分的結(jié)構(gòu)。接頭可以位于第一捕獲部分上和/或顆粒中。例如，如果采用PH誘導(dǎo)的切割就可以是這樣。或者，接頭可以是偶聯(lián)至捕獲部分和/或顆粒的分離結(jié)構(gòu)。
接頭可以利用模塊設(shè)計(jì)來(lái)構(gòu)建；圖5給出一些實(shí)例。原則上可以使用任何偶聯(lián)(生物)化學(xué)(羧基、胺、sulfhydride、馬來(lái)酰亞胺等)，優(yōu)選互相不同。此外,接頭應(yīng)當(dāng)包含可切割的實(shí)體?？汕懈畹膶?shí)體的實(shí)例和切割的方法包括但不限于
可以通過(guò)蛋白酶切割的肽(優(yōu)選特異性氨基酸序列)；和/或
可以通過(guò)核酸酶切割的核酸序列(優(yōu)選特異性序列/核酸酶)；和/或
光致斷裂兀件(Photocleavableelement);和 / 或
溫度誘導(dǎo)的切割；和/或
化學(xué)誘導(dǎo)的切割(例如S-S鍵的還原)；和/或
pH誘導(dǎo)的切割。
接頭的實(shí)例為包含限制位點(diǎn)的合成DNA片段，但是接頭的許多不同選擇是可用的。
如本文所用，術(shù)語(yǔ)“相關(guān)”指物理關(guān)聯(lián)。
如本文所用，術(shù)語(yǔ)“直接檢測(cè)和/或定量”表示檢測(cè)和/或定量生物學(xué)靶標(biāo)本身。
如本文所用，術(shù)語(yǔ)“間接檢測(cè)和/或定量”表示使用競(jìng)爭(zhēng)性親和力測(cè)定，其中不檢測(cè)和/或定量生物學(xué)靶標(biāo)本身，但是檢測(cè)和/或定量與生物學(xué)靶標(biāo)競(jìng)爭(zhēng)步驟e)的至少一種捕獲部分的實(shí)體，例如生物學(xué)靶標(biāo)的類(lèi)似物。
在一優(yōu)選實(shí)施方案中，步驟e)中的至少一種捕獲部分為檢測(cè)表面的一部分。
如本文所用，術(shù)語(yǔ)“檢測(cè)表面”指能夠結(jié)合生物學(xué)靶標(biāo)以及使得能夠檢測(cè)的表面。 為了本發(fā)明的目的，檢測(cè)表面可以是生物的、非生物的、有機(jī)的、無(wú)機(jī)的或者它們的組合，并且可以為顆粒、鏈、沉淀、凝膠、片、管、球、容器、毛細(xì)管、墊、薄片、膜、玻片等的形式，具有任何方便的形狀，包括圓盤(pán)、球形、圓形等，只要其允許檢測(cè)結(jié)合的生物學(xué)靶標(biāo)。
在這樣的設(shè)定中，特別優(yōu)選步驟e)中的至少一種捕獲部分包含以這樣的方式構(gòu)建的生物化學(xué)分子或結(jié)構(gòu)，其允許結(jié)合至支持物以及生物學(xué)靶標(biāo)。這樣的生物化學(xué)分子或結(jié)構(gòu)的實(shí)例為核酸，優(yōu)選多達(dá)200個(gè)堿基的DNA寡核苷酸，以及蛋白和半抗原如抗體或凝集素，其可以結(jié)合分子結(jié)構(gòu)如DNA序列、抗體、抗原或酶。
步驟e)中的至少一種捕獲部分還可以包含強(qiáng)結(jié)合物質(zhì)如鏈霉親和素。
如本文所用，術(shù)語(yǔ)“檢測(cè)”指確定生物學(xué)靶標(biāo)的物理存在和/或定量檢測(cè)生物學(xué)靶標(biāo)。
在一優(yōu)選實(shí)施方案中，親和力測(cè)定為免疫測(cè)定，即該測(cè)定利用抗體特異性結(jié)合分析物，即生物學(xué)靶標(biāo)。這有利于可獲得具有不同結(jié)合位點(diǎn)的不同抗體的良好選擇的那些生物學(xué)靶標(biāo)，因?yàn)榭贵w_抗原結(jié)合通常是高度特異性和非常靈敏的。
在另一優(yōu)選實(shí)施方案中，步驟a)-d)順序應(yīng)用一次或多次。這是有利的，因?yàn)槠湓试S更高地富集和/或純化溶液中的生物學(xué)靶標(biāo)。
此外，優(yōu)選生物學(xué)靶標(biāo)與步驟e)中的至少兩種捕獲部分相關(guān)，其中所述兩種捕獲部分中的一種為檢測(cè)表面的一部分，而另一種使得能夠在這種表面上檢測(cè)。換句話說(shuō)，生物學(xué)靶標(biāo)直接結(jié)合至檢測(cè)表面。
這種生物學(xué)靶標(biāo)直接結(jié)合至檢測(cè)表面的捕獲部分具有這樣的優(yōu)勢(shì)，檢測(cè)和/或定量生物學(xué)靶標(biāo)不需要額外的系列結(jié)合步驟。
在本發(fā)明的方法的另一優(yōu)選實(shí)施方案中，在步驟e)中，第一捕獲部分或第二捕獲部分與另一捕獲部分相關(guān)。
因此，如果第一捕獲部分與生物學(xué)靶標(biāo)一起從顆粒切割，第一捕獲部分或其一部分可以用來(lái)結(jié)合至另一捕獲部分。優(yōu)選地，額外的捕獲部分是檢測(cè)表面的一部分。這樣，生物學(xué)靶標(biāo)間接結(jié)合至額外的捕獲部分并因此結(jié)合至檢測(cè)表面，從而使得能夠檢測(cè)(參見(jiàn)例如圖3B)。
如本文所用，術(shù)語(yǔ)“間接結(jié)合”表示生物學(xué)靶標(biāo)本身不結(jié)合至檢測(cè)表面。取而代之， 第一捕獲部分的一部分如第三實(shí)體或標(biāo)簽結(jié)合至檢測(cè)表面(參見(jiàn)例如圖3B和圖3C)。
如果生物學(xué)靶標(biāo)僅具有一個(gè)捕獲部分可以結(jié)合的位點(diǎn)，則間接結(jié)合特別有利，因?yàn)樵跈z測(cè)表面上的生物學(xué)靶標(biāo)的重新捕獲發(fā)生時(shí)這個(gè)位點(diǎn)已被第一捕獲部分占據(jù)。
或者，無(wú)論第一捕獲部分是否與生物學(xué)靶標(biāo)一起從顆粒切割，第二捕獲部分均可以結(jié)合至生物學(xué)靶標(biāo)，并且這種第二捕獲部分轉(zhuǎn)而可以用來(lái)結(jié)合至另一捕獲部分。因此同樣地，如果額外的捕獲部分是檢測(cè)表面的一部分，則生物學(xué)靶標(biāo)間接結(jié)合至額外的捕獲部分并因此結(jié)合至檢測(cè)表面，從而使得能夠檢測(cè)(參見(jiàn)例如圖3C)。
在本發(fā)明的方法的另一優(yōu)選實(shí)施方案中，在步驟e)中，生物學(xué)靶標(biāo)與進(jìn)一步的捕獲部分相關(guān)。
因此在這個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，生物學(xué)靶標(biāo)與至少3種捕獲部分相關(guān)。例如，這些可以是與生物學(xué)靶標(biāo)一起從顆粒切割的第一捕獲部分以及兩種額外的捕獲部分，其中一種是檢測(cè)表面的一部分，而另一種使得能夠在這種表面上檢測(cè)。換句話說(shuō)，生物學(xué)靶標(biāo)直接結(jié)合至檢測(cè)表面(參見(jiàn)例如圖3D)。
這種生物學(xué)靶標(biāo)直接結(jié)合至檢測(cè)表面的捕獲部分具有這樣的優(yōu)勢(shì)，檢測(cè)和/或定量生物學(xué)靶標(biāo)不需要額外的系列結(jié)合步驟。
此外，生物學(xué)靶標(biāo)可以與4種捕獲部分相關(guān)，如果第一捕獲部分與生物學(xué)靶標(biāo)一起從顆粒切割就可以是這樣?？赡軄?lái)自生物學(xué)靶標(biāo)的第二輪濃縮并在切割之后還保持連接至生物學(xué)靶標(biāo)的第二捕獲部分結(jié)合至第三捕獲部分，其是檢測(cè)表面的一部分，而第四捕獲部分連接至顆粒，使得能夠在這種檢測(cè)表面上檢測(cè)。第二部分可以通過(guò)DNA-接頭結(jié)合至第三捕獲部分，所述DNA-接頭具有第三捕獲部分識(shí)別的表位。
例如，如果檢測(cè)表面的捕獲部分即第三捕獲部分與第二捕獲部分之間的結(jié)合通過(guò)強(qiáng)結(jié)合物質(zhì)介導(dǎo)，如生物素與鏈霉親和素之間的相互作用，則這種配置是有利的。
在本發(fā)明的方法的另一優(yōu)選實(shí)施方案中，試劑與至少一種捕獲部分相關(guān)，或者在競(jìng)爭(zhēng)性親和力測(cè)定形式的情況下，與步驟e)中的生物學(xué)靶標(biāo)的類(lèi)似物相關(guān)。
如本文所用，術(shù)語(yǔ)“試劑”指使得能夠在親和力測(cè)定中檢測(cè)生物學(xué)靶標(biāo)和/或促進(jìn)在親和力測(cè)定中檢測(cè)生物學(xué)靶標(biāo)的物質(zhì)。
如本文所用，術(shù)語(yǔ)“生物學(xué)靶標(biāo)的類(lèi)似物”指在競(jìng)爭(zhēng)性親和力測(cè)定中與生物學(xué)靶標(biāo)競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合位點(diǎn)的物質(zhì)。
包含這個(gè)額外步驟的親和力測(cè)定是有利的，因?yàn)樵噭┛梢允桥c本領(lǐng)域已知的公認(rèn)的檢測(cè)系統(tǒng)一起工作的許多物質(zhì)中的任何一種。因此，無(wú)論測(cè)定的生物學(xué)靶標(biāo)，實(shí)際的檢測(cè)反應(yīng)可以從多種已知的方法中選擇。
如果親和力測(cè)定包含這個(gè)額外步驟，如果接頭包含間隔元件，這是有益的，因?yàn)闄z測(cè)表面與試劑之間的距離增加，這允許非特異性與特異性結(jié)合之間更好的區(qū)別。
優(yōu)選地，所述試劑選自
放射性同位素；和/或
固相，例如磁珠或乳膠珠或檢測(cè)表面；和/或
熒光、磷光和/或化學(xué)發(fā)光染料；和/或
酶和/或酶底物；和/或
核酸序列、肽；和/或
膠體或納米顆粒；和/或
聚合物或大分子，例如樹(shù)狀聚體或脂質(zhì)體。
在本發(fā)明的優(yōu)選方法中，將捕獲的生物學(xué)靶標(biāo)濃縮為小于步驟a)中的生物學(xué)樣品體積的第二體積通過(guò)磁性分離或重力來(lái)進(jìn)行。
優(yōu)選地，在濃縮步驟中，生物學(xué)樣品體積以1:2-1:1000的比例減小，S卩1:2、1:3、 1:4、1:5、1:6、1:7、1:8、1:9、1:10、1:20、1:30、1:40、1:50、1:100、1:200、1:500 和 / 或 1:1000。
此外，生物學(xué)樣品體積優(yōu)選具有I μ l-5ml的體積，即彡I μ 1,2 μ 1,3 μ 1,4 μ I, 5 μ 1、6μ 1、7μ 1、8μ 1、9μ 1、10μ 1、11μ 1、12μ 1、13μ 1、14μ 1、15μ 1、16μ 1、17μ I、 18 μ 1、19μ I >20 μ 1、21μ I >22 μ 1、23μ I >24 μ 1、25μ I、26 μ 1、27μ 1、28μ I、29 μ I、 30 μ 1,50 μ I、100 μ 1,300 μ 1,500 μ l、lml、3ml 和 / 或 5ml。
濃縮步驟之后的生物學(xué)樣品體積，這里也稱(chēng)為洗脫體積，對(duì)于酶促洗脫可以高達(dá)例如5 μ L,而對(duì)于光化學(xué)洗脫可以高達(dá)例如15 μ L。
可用于濃縮步驟a)中的生物學(xué)靶標(biāo)的兩種方法磁性分離或重力是快速、可靠的技術(shù)。
在一可選實(shí)施方案中，生物學(xué)樣品體積比生物學(xué)靶標(biāo)比例的減小通過(guò)過(guò)濾來(lái)進(jìn)行。在這種情況下，顆?？梢詾镠is-標(biāo)簽，即由至少5個(gè)組氨酸(His)殘基組成的氨基酸基序，并且過(guò)濾可以利用親和介質(zhì)如Ni Sepharose> NTA-瓊脂糖、His60Ni、HisPur樹(shù)脂或 Talon樹(shù)脂來(lái)進(jìn)行。
優(yōu)選地，顆粒為磁性顆粒和/或超順磁顆粒。這是有益的，因?yàn)榇判灶w粒和/或超順磁顆粒具有高表面比體積比例，并且磁性顆粒使得生物學(xué)樣品體積比生物學(xué)靶標(biāo)的比例能夠通過(guò)磁性分離而減小。
例如，如果顆粒為磁性顆粒，則本發(fā)明的方法可以如下進(jìn)行首先，將包含生物學(xué)靶標(biāo)的生物學(xué)樣品體積提供在第一室中。然后，加入粘附至磁性顆粒的第一捕獲部分。在足夠的生物學(xué)靶標(biāo)與粘附至磁性顆粒的第一捕獲部分之間的結(jié)合發(fā)生之后，利用磁力將捕獲部分與生物學(xué)靶標(biāo)轉(zhuǎn)移至第二個(gè)較小的室，從而減小生物學(xué)樣品體積比生物學(xué)靶標(biāo)的比例。隨后，從磁性顆粒切割第一捕獲部分，并且將磁性顆粒從第二個(gè)較小的室去除。最后， 在檢測(cè)表面上重新捕獲生物學(xué)靶標(biāo)，并且在檢測(cè)表面上檢測(cè)和/或定量生物學(xué)靶標(biāo)。
利用這種方法，大量磁性顆?？梢杂脕?lái)分離和濃縮生物學(xué)樣品體積內(nèi)的生物學(xué)靶標(biāo)而不干擾隨后的檢測(cè)步驟。
在本發(fā)明的另一優(yōu)選方法中，從顆粒切割第一捕獲部分通過(guò)酶促、熱和/或光化學(xué)切割進(jìn)行。
還可以平行或順序(after each other)聯(lián)合使用的每種不同的切割方法具有其特定優(yōu)勢(shì)。然而，所有切割方法均可以與親和力測(cè)定聯(lián)合使用，因?yàn)樗星懈罘椒ň鹱钚「蓴_和流體的最小污染?？蛇x方法，例如通過(guò)降低PH切割或化學(xué)誘導(dǎo)的切割如還原反應(yīng)可以強(qiáng)烈影響生物學(xué)靶標(biāo)的狀態(tài)和構(gòu)象，并且可以改變?nèi)芤旱幕瘜W(xué)條件，從而強(qiáng)烈干擾隨后的親和力測(cè)定。雖然最后這兩種方法均為簡(jiǎn)單的公知的從抗體洗脫分析物的方式，但是它們具有在過(guò)程中以后影響生物學(xué)靶標(biāo)的親和力測(cè)定的缺點(diǎn)。
例如酶促切割可以用于所有靶標(biāo)，并且它是溫和的過(guò)程，可以用于是蛋白的生物學(xué)靶標(biāo)，因?yàn)樗ǔ２蛔冃缘鞍住Ｒ虼?，本發(fā)明的方法對(duì)于濃縮即蛋白的富集特別有利，濃縮的進(jìn)行通常非常具有挑戰(zhàn)性，這是由于蛋白分子對(duì)溫度的敏感性和緩沖制劑的變化。此外，酶促切割允許隨后的免疫測(cè)定。使用DNA的優(yōu)勢(shì)是測(cè)定的性能可以通過(guò)在抗體結(jié)合以外的地方放置限制位點(diǎn)來(lái)增強(qiáng)。剩余的DNA接頭可以用來(lái)增加最終測(cè)定上的檢測(cè)信號(hào)。
切割的優(yōu)選酶為DNase和EcoRl。對(duì)于優(yōu)選實(shí)施方案，DNAse表現(xiàn)出比EcoRl更高的收率?？梢允褂萌魏翁禺愋院怂崦?，具有對(duì)DNA序列的最小影響。這里,在優(yōu)選實(shí)施方案中，EcoRI用來(lái)顯示系統(tǒng)可以是可適應(yīng)的，并且還顯示核酸檢測(cè)方法的通用性。
熱切割具有這樣的優(yōu)勢(shì)，切割位點(diǎn)具有比酶促切割少的特異性要求，其特別適合可以耐受高溫的生物學(xué)靶標(biāo)，例如小分子。然而，如果小心不要使用可以變性蛋白的溫度， 則還可以對(duì)是蛋白的生物學(xué)靶標(biāo)進(jìn)行熱切割。
在熱切割的情況下，從顆粒切割第一捕獲部分的步驟可以被從第一捕獲部分切割生物學(xué)靶標(biāo)代替。然而，當(dāng)然還可能將熱切割位點(diǎn)構(gòu)建入接頭和/或第一捕獲部分本身。
光化學(xué)切割是有益的，因?yàn)椴恍枰尤肫渌孜?，例如酶促反?yīng)的酶。關(guān)于將這種測(cè)定整合入緊湊型裝置，光化學(xué)切割也表現(xiàn)出一些優(yōu)勢(shì)。
然而，用這種形式的切割，測(cè)定需要在允許光穿透的環(huán)境如暗盒(cartridge)中進(jìn)行。
此外，優(yōu)選的檢測(cè)和/或定量方法選自
-光學(xué)檢測(cè),例如突光、磷光、化學(xué)發(fā)光、吸收、散射、成像、瞬逝場(chǎng)技術(shù)、受抑全內(nèi)反射、表面等離子共振、拉曼、光譜學(xué)；和/或
-酶反應(yīng)；和/或
-核酸擴(kuò)增技術(shù)，例如免疫-PCR、滾環(huán)擴(kuò)增；和/或
-磁性檢測(cè)，例如通過(guò)磁致電阻、霍爾效應(yīng)、線圈；和/或
-聲波檢測(cè)，例如表面聲波、體聲波、懸臂、石英晶體；和/或
-電檢測(cè)，例如電導(dǎo)、阻抗、電流、氧化還原循環(huán)、電荷；和/或
-光磁檢測(cè)。
一種光學(xué)檢測(cè)技術(shù)為受抑全內(nèi)反射(FTIR)。在正確的角度照明，通常反射擊中傳感器的活性表面下側(cè)的光強(qiáng)度沒(méi)有任何損失，這是全內(nèi)反射。然而，當(dāng)納米顆粒結(jié)合至表面的對(duì)側(cè)時(shí)，它們散射并吸收光，減少反射光束的強(qiáng)度。通過(guò)傳感器檢測(cè)對(duì)應(yīng)于結(jié)合的納米顆CN 102947703 A書(shū)明說(shuō)8/15 頁(yè)粒的數(shù)量的反射光束的這些強(qiáng)度變化，例如與數(shù)碼相機(jī)中使用的相似的CMOS圖像傳感器。 這是FTIR。
各種合適的酶反應(yīng)如辣根過(guò)氧化物酶是本領(lǐng)域公知的。
免疫-PCR為抗原檢測(cè)系統(tǒng)，其中特異性DNA分子用作標(biāo)記，并且PCR用來(lái)檢測(cè)這種標(biāo)記。
如果試劑為磁性顆粒，檢測(cè)的優(yōu)選方法為FTIR，因?yàn)槠淇煽?、快速，并且可以在小體積中工作。
在本發(fā)明的方法的一優(yōu)選實(shí)施方案中，切割為酶促的，試劑為磁珠，并且生物學(xué)靶標(biāo)與進(jìn)一步的捕獲部分相關(guān)。
在另一優(yōu)選實(shí)施方案中，生物學(xué)靶標(biāo)結(jié)合至第一捕獲部分、第二捕獲部分和第三捕獲部分全部通過(guò)生物學(xué)靶標(biāo)上的結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行。
在這樣的情況下，生物學(xué)靶標(biāo)上的3個(gè)結(jié)合位點(diǎn)被與試劑相關(guān)的第一捕獲部分、 第二捕獲部分以及第三捕獲部分占據(jù)，所述第三捕獲部分優(yōu)選為檢測(cè)表面的一部分。
本發(fā)明的發(fā)明人令人驚訝地發(fā)現(xiàn)雖然生物學(xué)靶標(biāo)上的2個(gè)結(jié)合位點(diǎn)已被占據(jù)，靶標(biāo)仍然可以通過(guò)第三結(jié)合位點(diǎn)直接結(jié)合至檢測(cè)表面。換句話說(shuō)，已結(jié)合的元件不空間上阻礙生物學(xué)靶分子的檢測(cè)，即使在磁珠作為試劑，第二捕獲部分試劑復(fù)合物非常大的情況下也是如此。
在另一優(yōu)選實(shí)施方案中，生物學(xué)靶標(biāo)結(jié)合至第一捕獲部分、第二捕獲部分和第三捕獲部分全部通過(guò)結(jié)合至表位進(jìn)行，即結(jié)合至生物學(xué)靶標(biāo)的抗原決定簇。
這種“3-表位_測(cè)定”是有利的，因?yàn)槠渚哂懈咛禺愋?，這是由于結(jié)合至生物學(xué)靶標(biāo)的3個(gè)抗原決定簇。此外，由于從顆粒酶促切割第一捕獲部分，生物學(xué)靶標(biāo)在空間上對(duì)于試劑相關(guān)的第二捕獲部分非常易于接近，并且直接結(jié)合至檢測(cè)表面。
在一可選實(shí)施方案中，提供生物學(xué)靶標(biāo)的檢測(cè)配置，其包含第一、第二和第三捕獲部分，其中試劑與第二和/或第三捕獲部分相關(guān)，并且生物學(xué)靶標(biāo)直接結(jié)合至所有三個(gè)捕獲部分，從而使得能夠檢測(cè)。
在這種檢測(cè)配置的一優(yōu)選實(shí)施方案中，生物學(xué)靶標(biāo)通過(guò)表位結(jié)合至所有捕獲部分。
在另一可選實(shí)施方案中，提供捕獲部分，其包含
a)用于附著至顆粒的第一實(shí)體，
b)用于切割對(duì)顆粒的附著的第二實(shí)體，以及
c)用于附著至檢測(cè)表面的第三實(shí)體。
優(yōu)選地，權(quán)利要求13的捕獲部分在權(quán)利要求1-10中任一項(xiàng)的方法中用作第一捕獲部分。
因此，當(dāng)使用這個(gè)實(shí)施方案時(shí)，第一捕獲部分結(jié)合至生物學(xué)靶標(biāo)，并且與生物學(xué)靶標(biāo)一起從顆粒切割。
優(yōu)選地，檢測(cè)表面包含進(jìn)一步的捕獲部分。
與上述3-表位測(cè)定相反，結(jié)合至檢測(cè)表面是間接的，因?yàn)榈谌龑?shí)體結(jié)合至檢測(cè)表面而不是生物學(xué)靶標(biāo)。
在這種情況下，如果接頭包含間隔是有益的，因?yàn)檫@增加檢測(cè)表面上第三實(shí)體的11結(jié)合面積。具體地，間隔增加在檢測(cè)表面上找到結(jié)合位置的面積，因?yàn)槠渲械谌龑?shí)體可以成功地結(jié)合更多方向或空間。
一般來(lái)說(shuō)，可以研究本發(fā)明的方法的步驟b)期間發(fā)生的第一捕獲反應(yīng)作為時(shí)間和顆粒濃度的函數(shù)。步驟b)期間發(fā)生的第一捕獲部分與生物學(xué)靶標(biāo)之間的相互作用可以模擬為一階速率表達(dá)式及之后的重排；捕獲效率(ε capt)如下
權(quán)利要求
1.一種在親和力測(cè)定中檢測(cè)生物學(xué)靶標(biāo)的方法，所述方法包括以下步驟a)提供包含所述生物學(xué)靶標(biāo)的生物學(xué)樣品體積；b)將第一捕獲部分加入包含所述生物學(xué)靶標(biāo)的生物學(xué)樣品體積，其中所述第一捕獲部分粘附至顆粒；c)將捕獲的生物學(xué)靶標(biāo)濃縮為小于步驟a)中的生物學(xué)樣品體積的洗脫體積；d)從所述顆粒切割所述第一捕獲部分或所述生物學(xué)靶標(biāo)；e)以?shī)A心或競(jìng)爭(zhēng)性親和力測(cè)定形式直接或間接檢測(cè)和/或定量所述生物學(xué)靶標(biāo)，其中所述生物學(xué)靶標(biāo)與至少一種捕獲部分相關(guān)，優(yōu)選與至少兩種捕獲部分相關(guān)。
2.如權(quán)利要求I所述的方法，其中在步驟e)中，所述第一捕獲部分或第二捕獲部分與另一捕獲部分相關(guān)。
3.如權(quán)利要求I或2所述的方法，其中在步驟e)中，所述生物學(xué)靶標(biāo)與進(jìn)一步的捕獲部分相關(guān)。
4.如前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其中在步驟e)中，試劑與至少一種捕獲部分相關(guān)，或者在競(jìng)爭(zhēng)性親和力測(cè)定形式的情況下，與所述生物學(xué)靶標(biāo)的類(lèi)似物相關(guān)。
5.如權(quán)利要求4所述的方法，其中所述試劑選自放射性同位素；和/或固相，例如磁珠或乳膠珠或檢測(cè)表面；和/或熒光、磷光和/或化學(xué)發(fā)光染料；和/或酶和/或酶底物；和/或核酸序列、肽；和/或膠體或納米顆粒；和/或聚合物或大分子，例如樹(shù)狀聚體或脂質(zhì)體。
6.如前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其中將所述捕獲的生物學(xué)靶標(biāo)濃縮為小于步驟a)中的生物學(xué)樣品體積的洗脫體積通過(guò)磁性分離或重力來(lái)進(jìn)行。
7.如前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述顆粒為磁性顆粒。
8.如前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其中從所述顆粒切割所述第一捕獲部分或所述生物學(xué)靶標(biāo)通過(guò)酶促、熱和/或光化學(xué)切割進(jìn)行。
9.如前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述檢測(cè)和/或定量方法選自-光學(xué)檢測(cè)，例如熒光、磷光、化學(xué)發(fā)光、吸收、散射、成像、瞬逝場(chǎng)技術(shù)、FTIR、表面等離子共振、拉曼、光譜學(xué)；和/或 _酶反應(yīng)；和/或-核酸擴(kuò)增技術(shù)，例如免疫-PCR、滾環(huán)擴(kuò)增；和/或 -磁性檢測(cè)，例如通過(guò)磁致電阻、霍爾效應(yīng)、線圈；和/或 -聲波檢測(cè)，例如表面聲波、體聲波、懸臂、石英晶體；和/或 -電檢測(cè)，例如電導(dǎo)、阻抗、電流、氧化還原循環(huán)、電荷。
10.如權(quán)利要求3-9中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述切割是酶促的，所述試劑為磁珠， 并且所述生物學(xué)靶標(biāo)與進(jìn)一步的捕獲部分相關(guān)。
11.一種生物學(xué)靶標(biāo)的檢測(cè)配置，其包括生物學(xué)靶標(biāo)，第一、第二和第三捕獲部分，其中試劑與第二和/或第三捕獲部分相關(guān)，并且所述生物學(xué)靶標(biāo)直接結(jié)合至所有三個(gè)捕獲部分，從而使得能夠檢測(cè)。
12.如權(quán)利要求11所述的檢測(cè)配置，其中所述生物學(xué)靶標(biāo)通過(guò)表位結(jié)合至所有捕獲部分。
13.—種用于如權(quán)利要求1-10所述的方法的捕獲部分,其包含a)用于附著至顆粒的第一實(shí)體(404)，b)用于切割對(duì)顆粒的附著的第二實(shí)體(406)，以及c)用于附著至檢測(cè)表面的第三實(shí)體(407)。
14.如權(quán)利要求1-10中任一項(xiàng)所述的方法，其中加入所述生物學(xué)樣品體積的第一捕獲部分包含a)用于附著至顆粒的第一實(shí)體(404)，b)用于切割對(duì)顆粒的附著的第二實(shí)體(406)，以及c)用于附著至檢測(cè)表面的第三實(shí)體(407)。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種在親和力測(cè)定中檢測(cè)生物學(xué)靶標(biāo)的方法，所述方法包括以下步驟提供包含所述生物學(xué)靶標(biāo)的生物學(xué)樣品體積；將第一捕獲部分加入包含所述生物學(xué)靶標(biāo)的生物學(xué)樣品體積，其中所述第一捕獲部分粘附至顆粒；將捕獲的生物學(xué)靶標(biāo)濃縮為小于步驟a)中的生物學(xué)樣品體積的洗脫體積；從所述顆粒切割所述第一捕獲部分或所述生物學(xué)靶標(biāo)以及以?shī)A心或競(jìng)爭(zhēng)性親和力測(cè)定形式直接或間接檢測(cè)和/或定量所述生物學(xué)靶標(biāo)，其中所述生物學(xué)靶標(biāo)與至少一種捕獲部分相關(guān)，優(yōu)選與至少兩種捕獲部分相關(guān)。
文檔編號(hào)G01N33/543GK102947703SQ201180029393
公開(kāi)日2013年2月27日 申請(qǐng)日期2011年6月14日 優(yōu)先權(quán)日2010年6月17日
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