專利名稱：變應(yīng)原微陣列的制作方法
變應(yīng)原微陣列本發(fā)明涉及一種用于評(píng)估對(duì)象是否已發(fā)生哮喘、結(jié)膜炎或鼻炎或具有其發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)的方法。本發(fā)明還涉及用于所述方法的抗原集合，所述方法包括鑒定與此類風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)的抗原。
背景技術(shù)：
哮喘被普遍認(rèn)為是一種主要的全球性健康問題。在過去的五十年中，它是影響成人和兒童的最常見的疾病之一，其導(dǎo)致了全世界多達(dá)3億個(gè)病例，并且令人擔(dān)憂的是它出現(xiàn)頻率在逐年上升。遺傳因素(細(xì)胞因子和免疫應(yīng)答基因)和環(huán)境因素(如病毒性感染、變應(yīng)原和職業(yè)性暴露)均與哮喘易感性、發(fā)作年齡和嚴(yán)重程度有關(guān)。但是，該疾病的發(fā)病機(jī)理還未被完全闡明?！ひ粋€(gè)主要的風(fēng)險(xiǎn)因素是發(fā)生對(duì)外源抗原的免疫應(yīng)答，所述免疫應(yīng)答的特征在于產(chǎn)生抗原-特異性IgE。此概念最先來自于下述現(xiàn)象，哮喘的患病率與血清IgE水平緊密相關(guān)?，F(xiàn)在，壓倒性的證據(jù)已經(jīng)確證IgE在特應(yīng)性哮喘中的作用，而數(shù)個(gè)研究還揭示了 IgE和非特應(yīng)性哮喘之間的關(guān)聯(lián)性。更多的爭(zhēng)論是抗原特異性IgE在決定疾病的發(fā)作和嚴(yán)重程度中的作用。因?yàn)榘l(fā)現(xiàn)房塵螨是灰塵中變應(yīng)原的主要來源，所以數(shù)個(gè)研究將抗特異性螨變應(yīng)原的血清IgE的存在與哮喘相聯(lián)系。但是，在世界范圍內(nèi)有大量個(gè)體(尤其生活在美國(guó)和斯堪的納維亞的一些地區(qū)的那些)通常在他們的生活中不與螨抗原接觸。有意思的是，這些個(gè)體在哮喘的患病率和嚴(yán)重程度的方面不會(huì)顯示出任何降低。因此，很有可能另一些抗原單獨(dú)地或組合地在該疾病的發(fā)病中起重要的作用。遺憾的是，抗原接觸、IgE產(chǎn)生與哮喘的發(fā)生和/或嚴(yán)重程度之間的任何關(guān)聯(lián)性似乎都涉及出乎意料地大量的因素，并且接觸與應(yīng)答之間似乎存在非線性關(guān)系。迄今為止，試圖確定特異性IgE和哮喘之間關(guān)聯(lián)性的研究集中在要么分析一種抗原要么同時(shí)分析少數(shù)幾種抗原，如描述房塵螨作用的那些研究。與此相反，目前尚沒有針對(duì)IgE對(duì)大抗原庫(kù)的應(yīng)答和哮喘發(fā)生進(jìn)行調(diào)查的研究。已知變應(yīng)原的數(shù)目和已經(jīng)分析的抗原的數(shù)目之間的不均衡性可很好地解釋在建立特異性IgE在哮喘的發(fā)病中作用之中所遇到的困難。例如，大多數(shù)患有哮喘的患者具有針對(duì)多于一種變應(yīng)原的血清IgE，并且其每一種在疾病表現(xiàn)和癥狀中的相對(duì)貢獻(xiàn)仍然是未知的。因而，盡管通過針對(duì)常見變應(yīng)原的特異性IgE的存在所定義的特應(yīng)性與哮喘相關(guān)聯(lián)，但是特異性IgE的高血清水平并不總是與特應(yīng)性相關(guān)聯(lián)。結(jié)果，全部的或特異性的IgE與哮喘應(yīng)答模式之間的相關(guān)性仍是不清楚的。因此，盡管確定患者或?qū)ο笫欠耧@示對(duì)特定抗原的免疫應(yīng)答是相對(duì)直接的，但是并沒有簡(jiǎn)單的方式來確定同一患者或?qū)ο笫欠窬哂邪l(fā)生更嚴(yán)重病癥(如哮喘、結(jié)膜炎或鼻炎)的風(fēng)險(xiǎn)。目前，本發(fā)明人出人意料地發(fā)現(xiàn)預(yù)測(cè)發(fā)生此類病癥的風(fēng)險(xiǎn)是可能的。

發(fā)明內(nèi)容
在本發(fā)明的第一個(gè)方面中，提供鑒定生物標(biāo)志物集合的方法，更特別地鑒定與哮喘、結(jié)膜炎或鼻炎顯著相關(guān)的抗原集合。所述方法包括(a)在分離自一組無癥狀對(duì)象的多個(gè)第一樣品中測(cè)量IgE對(duì)多種抗原反應(yīng)性的水平，(b)在分離自一組患有哮喘、結(jié)膜炎或鼻炎的對(duì)象的多個(gè)第二樣品中測(cè)量IgE對(duì)多種抗原反應(yīng)性的水平，(C)鑒定對(duì)象組之間IgE反應(yīng)性水平顯示出顯著差異的所述多種抗原的子集，其中IgE對(duì)所述子集反應(yīng)性的水平與哮喘、結(jié)膜炎或鼻炎的臨床診斷相關(guān)。在某些實(shí)施方案中，盡管可對(duì)每個(gè)個(gè)體樣品分開進(jìn)行評(píng)估，但基本上同時(shí)測(cè)量每個(gè)樣品內(nèi)的所述多種抗原的反應(yīng)性水平。 優(yōu)選地，在第一和/或多個(gè)第二樣品中的樣品數(shù)目為30至800個(gè)樣品，優(yōu)選為50至800個(gè)樣品。因此，樣品的數(shù)目可以是30至800之間的任何數(shù)目；例如，30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700或800，或者其中的任何范圍。優(yōu)選地，所述多種抗原包含30至400種抗原，優(yōu)選為50至400種抗原。因此，抗原的數(shù)目可以是30至400之間的任何數(shù)目，例如30、40、50、60、70、80、90、100、200、300或400，或者其中的任何范圍。在一些具體的實(shí)施方案中，抗原被選擇為在特定地區(qū)出現(xiàn)率最高的抗原。在一個(gè)實(shí)施方案中，通過將所述多種抗原與分離自所述對(duì)象組的血清相接觸以及使用抗IgE抗體測(cè)定與每種抗原結(jié)合的IgE的量來確定IgE反應(yīng)性的水平。在一些具體的實(shí)施方案中，所述抗IgE抗體是帶標(biāo)記的抗體。在另一些實(shí)施方案中，所述抗IgE抗體是未標(biāo)記的并且通過使用帶標(biāo)記的抗體進(jìn)行檢測(cè)。所述帶標(biāo)記的抗體可包含熒光標(biāo)記。在一些優(yōu)選的實(shí)施方案中，通過使用熒光檢測(cè)來確定與每個(gè)抗原結(jié)合的IgE的量。在某些實(shí)施方案中，所述多種抗原結(jié)合于至少一個(gè)具有多個(gè)地址的固體支持物，其中每個(gè)地址具有一種獨(dú)特的抗原布置于其上。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述固體支持物包含多個(gè)可分開識(shí)別的珠子(separately identifiable bead)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述固體支持物是微陣列。當(dāng)所述固體支持物是微陣列時(shí)，抗原的點(diǎn)樣濃度為O. 008mg/ml至3mg/ml ο在第二個(gè)方面中，本發(fā)明提供用于評(píng)估對(duì)象是否已經(jīng)發(fā)生哮喘、結(jié)膜炎或鼻炎或者具有其發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)的方法。在某些實(shí)施方案中，所述方法包括測(cè)量在分離自對(duì)象的樣品中IgE對(duì)生物標(biāo)志物集合的反應(yīng)性水平。優(yōu)選地，所述生物標(biāo)志物是預(yù)先確定與哮喘、結(jié)膜炎或鼻炎的臨床診斷相關(guān)聯(lián)的抗原，例如通過本發(fā)明的第一個(gè)方面預(yù)先確定的。在一些具體的實(shí)施方案中，IgE對(duì)生物標(biāo)志物集合中的至少75%的反應(yīng)性水平高于3. 511U/ml，這表明該對(duì)象可能發(fā)生或已經(jīng)發(fā)生哮喘、結(jié)膜炎或鼻炎。在某些實(shí)施方案中，所述生物標(biāo)志物集合包含9至51種抗原。在一些具體的實(shí)施方案中，所述生物標(biāo)志物集合選自以下抗原C2、DU D2、D3、D70、D71、D72、D73、EU E3、E81、E82、F4、F16、F25、F35、F49、F84、F95、Gl、G2、G3、G4、G5、G6、G8、G12、G14、G15、G18、16、K87、Ml、M3、M4、M5、M6、T4、Τ6、Τ7、T9、Τ14、Τ901、Wl、W6、Χ902、Χ903、Χ904、Χ905、Χ907和 Χ910。在一個(gè)實(shí)施方案中，通過將所述多種抗原與分離自所述對(duì)象的血清相接觸以及使用抗IgE抗體測(cè)定與每種抗原結(jié)合的IgE的量來確定IgE反應(yīng)性的水平。在某些實(shí)施方案中，所述抗IgE抗體是帶標(biāo)記的抗體。在另一些實(shí)施方案中，所述抗IgE抗體是未標(biāo)記的并且通過使用帶標(biāo)記的抗體對(duì)其進(jìn)行檢測(cè)。所述帶標(biāo)記的抗體可包含熒光標(biāo)記并且通過熒光檢測(cè)確定與每種抗原結(jié)合的IgE的量。在一些優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述抗原與固體支持物結(jié)合。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述固體支持物是微陣列。在某些實(shí)施方案中，所述抗原的點(diǎn)樣濃度為O. 008mg/ml至3mg/ml。優(yōu)選地，基本上同時(shí)測(cè)量與生物標(biāo)志物集合中每種抗原結(jié)合的IgE的量。在第三個(gè)方面中，本發(fā)明提供用于診斷哮喘、結(jié)膜炎或鼻炎或者確定其發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)的抗原微陣列。所述微陣列包含與哮喘、結(jié)膜炎或鼻炎相關(guān)聯(lián)的生物標(biāo)志物集合。在某些實(shí)施方案中，所述微陣列包含抗原F95、Gl、G3、G4、G12、G14、G15和G18以及任選地一種或更多種選自以下的抗原C2、D1、D2、D3、D70、D71、D72、D73、E1、E3、E81、E82、F4、F16、F25、F35、F49、F84、G2、G5、G6、G8、16、K87、Ml、M3、M4、M5、M6、T4、T6、T7、T9、T14、T901、Wl、W6、Χ902、Χ903、Χ904、Χ905、Χ907 和 Χ910。 在本發(fā)明的第四個(gè)方面中，提供用于確定發(fā)生哮喘、結(jié)膜炎或鼻炎的風(fēng)險(xiǎn)的試劑盒。在另一些實(shí)施方案中，所述試劑盒可用于診斷哮喘、結(jié)膜炎或鼻炎。此類試劑盒可包含⑴抗原F95、G1、G3、G4、G12、G14、G15和G18，(ii)任選地一種或更多種以下的抗原C2、D1、D2、D3、D70、D71、D72、D73、E1、E3、E81、E82、F4、F16、F25、F35、F49、F84、G2、G5、G6、G8、
16、K87、Ml、M3、M4、M5、M6、T4、Τ6、Τ7、T9、Τ14、Τ901、Wl、W6、Χ902、Χ903、Χ904、Χ905、Χ907和 Χ910，(iii)抗 IgE 抗體。在一些具體的實(shí)施方案中，所述試劑盒可包含在微陣列上的抗原C2、DU D2、D3、D70、D71、D72、D73、El、E3、E81、E82、F4、F16、F25、F35、F49、F84、F95、Gl、G2、G3、G4、G5、G6、G8、G12、G14、G15、G18、16、K87、Ml、M3、M4、M5、M6、T4、T6、T7、T9、T14、T901、Wl、W6、X902、X903、X904、X905、X907 和 X910。在本發(fā)明的第五個(gè)方面中，提供根據(jù)第一個(gè)或第二個(gè)方面的方法、根據(jù)第三個(gè)方面的微陣列或根據(jù)第四個(gè)方面的試劑盒用于評(píng)估對(duì)象是否已經(jīng)發(fā)生哮喘、結(jié)膜炎或鼻炎或者具有其發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)的用途。在本發(fā)明的第六個(gè)方面中，提供前述方面的方法、微陣列或試劑盒用于篩選可用于治療哮喘、結(jié)膜炎或鼻炎的化合物的用途。


圖I :表I列出了 103種抗原，它們排列成陣列并用作第一抗原集合以用于篩選?？乖瓨?biāo)示符與ImiliunoCAPi^應(yīng)原產(chǎn)品貨號(hào)相對(duì)應(yīng)，例如可得自Phadia AB。圖2 :表2舉例說明了根據(jù)年齡、性別和包括哮喘在內(nèi)的多種特應(yīng)性疾病的發(fā)生對(duì)實(shí)施例中所述研究群體的分層。圖3 :表3例證了對(duì)103種變應(yīng)原的聚類反應(yīng)性特征譜的相關(guān)性分析。分析了三個(gè)聚類在性別頻率、結(jié)膜炎、濕疹、鼻炎、哮喘以及哮喘持續(xù)性、哮喘嚴(yán)重程度和發(fā)作年齡上的差異。通過在SPSS中使用X 2檢驗(yàn)，或者對(duì)于發(fā)作年齡，通過使用平等性(equality)的Kruskal-Wallis秩和檢驗(yàn)評(píng)估相關(guān)性。圖4 :表4列出了排成陣列的變應(yīng)原子集，當(dāng)在Mann-Whitney檢驗(yàn)中比較哮喘的和非哮喘的個(gè)體時(shí)，其顯示IgE血清反應(yīng)性上的最高差異。
圖5 :針對(duì)排成陣列的103種變應(yīng)原(行)的872個(gè)血清(列)的血清反應(yīng)性特征譜的K-均值聚類分析。顯現(xiàn)出每個(gè)聚類(節(jié)點(diǎn))中的特異性血清反應(yīng)性模式，圖5a——節(jié)點(diǎn)O、圖5b——節(jié)點(diǎn)I和圖5c——節(jié)點(diǎn)2 ;將個(gè)體變應(yīng)原的血清反應(yīng)性特征譜分類為陽(yáng)性(白框——分類得分I 5)和陰性(黑框——分類得分O)。圖6 :針對(duì)排成陣列的顯著的所選擇的51個(gè)變應(yīng)原(行)的872個(gè)血清(列)的血清反應(yīng)性特征譜的K-均值聚類分析。顯現(xiàn)出每個(gè)聚類(節(jié)點(diǎn))中的特異性血清反應(yīng)性模式，圖6a——節(jié)點(diǎn)3、圖6b——節(jié)點(diǎn)4和圖6c——節(jié)點(diǎn)5。將個(gè)體變應(yīng)原的血清反應(yīng)性特征譜分類為陽(yáng)性(白框——分類得分I 5)和陰性(黑框——分類得分O)。圖7 :在對(duì)多個(gè)比較進(jìn)行Bonferroni校正后，使用皮爾遜(Pearson' s) x 2試驗(yàn)評(píng)估聚類和變量之間的相關(guān)性。圖7a列出了所有103種抗原的結(jié)果，圖7b列出了 51種抗原子集的結(jié)果。
圖8 :示例了基于RBF的ANN哮喘分類器的廣義結(jié)構(gòu)和性能。RBF網(wǎng)絡(luò)由三層組成，分別為輸入層(框I 51)、隱層(圈I 8)和輸出層(黑框中的哮喘分類)。圖9a ANN的預(yù)測(cè)-觀察性能圖表。框圖代表了 RFB輸出種類的預(yù)測(cè)假概率；對(duì)于合并的訓(xùn)練和測(cè)試樣品，針對(duì)已知臨床狀況的哮喘患者(I)哮喘患者(2)繪制的哮喘(灰色)和非哮喘(白色)圖。圖％ :對(duì)合并的訓(xùn)練和測(cè)試樣品計(jì)算ROC曲線，哮喘(黑色)，非哮喘(灰色)。圖10示例了 ANN哮喘分類器的一致性性能。針對(duì)所選個(gè)體之已知的臨床狀況，基于皮爾遜X 2檢驗(yàn)評(píng)估盲性樣品的ANN預(yù)測(cè)的哮喘狀況。發(fā)明詳述本發(fā)明人已發(fā)現(xiàn)對(duì)象將發(fā)生或已經(jīng)發(fā)生哮喘、結(jié)膜炎或鼻炎的傾向性或可能性可能與來自該對(duì)象的針對(duì)特定抗原和抗原集合的特異性IgE的存在和/或結(jié)合水平相關(guān)聯(lián)。所述抗原是可用于預(yù)測(cè)、診斷或確定治療有效性的生物標(biāo)志物。這個(gè)發(fā)現(xiàn)是出人意料的，因?yàn)樵跓o癥狀對(duì)象組和有癥狀對(duì)象組之間以及在每個(gè)組內(nèi)個(gè)體之間特異性IgE結(jié)合程度存在非常大的變異性。該發(fā)現(xiàn)是哮喘、結(jié)膜炎和鼻炎的治療和診斷中的顯著進(jìn)步。本發(fā)明公開了用于鑒定診斷性生物標(biāo)志物的方法，所述生物標(biāo)志物與這些臨床狀況具有統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著的相關(guān)性。所述方法鑒定了無癥狀患者和有癥狀患者之間的差異，從而揭示出臨床癥狀與特異性IgE的存在或缺乏之間之前不為所知的相關(guān)性。因此，可產(chǎn)生疾病特異性模式并將其用于篩選或診斷。為了鑒定疾病特異性模式，首先需要獲得來自至少兩組對(duì)象的樣品一第一組為健康的、無癥狀的對(duì)象以及第二組為有癥狀的對(duì)象。優(yōu)選地，有癥狀的對(duì)象已被臨床診斷為哮喘、結(jié)膜炎、鼻炎或這些的組合。但是，顯然對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員而言，本發(fā)明的方法也可施用于其他的(尤其是變應(yīng)性的)病癥或疾病，如皮炎、濕疹、炎癥、蕁麻疹、支氣管狹窄等。為了獲得結(jié)果或數(shù)據(jù)，通常，任何樣品一般包含或期望包含一種或更多種免疫球蛋白E抗體(IgE)或其結(jié)合片段。分離自患者或?qū)ο蟮臉悠穬?yōu)選為全血樣品。此類全血樣品可以是，例如靜脈或毛細(xì)血管樣品，或者可以是此類樣品的級(jí)分(例如血漿或血清)。溶血樣品、脂血癥樣品或黃疸樣品或者包含添加劑的樣品也被設(shè)想適于使用，所述添加劑常見于用以收集血液的管中，如EDTA、肝素和檸檬酸鹽。也可使用其他體液(bodily fluid),如淋巴液、初乳、乳汁、唾液、眼淚、尿液或這些流體的級(jí)分。在另一些實(shí)施方案中，樣品可來源于細(xì)胞培養(yǎng)物、細(xì)胞培養(yǎng)液或上清液或者液化的固體樣品，例如來源于組織活檢。所述患者或?qū)ο笫遣溉閯?dòng)物以及可以是人或下列動(dòng)物，例如但不限于，貓、狗、兔、小鼠、豚鼠、雪貂、猴、馬、奶牛或駱駝。在該方法的第一個(gè)步驟中，在分離自每組中對(duì)象的樣品中測(cè)量IgE對(duì)多種抗原的反應(yīng)性水平。例如，為了避免統(tǒng)計(jì)學(xué)或系統(tǒng)偏差，對(duì)象可在分析之前分配至特定的組(即有癥狀的或無癥狀的)或者可在測(cè)試后分配至特定的組。正常情況下，在來自對(duì)象的樣品中檢測(cè)不到針對(duì)特異性變應(yīng)原的免疫球蛋白E (IgE)，只有當(dāng)對(duì)象變得對(duì)該變應(yīng)原致敏時(shí)才會(huì)產(chǎn)生所述IgE。針對(duì)特定抗原并且只與該抗原反應(yīng)的IgE通常被稱為特異性IgE(SlgE)。對(duì)象可具有針對(duì)多于一種變應(yīng)原的特異性 IgE0反應(yīng)性用來表示特定抗體與其配體之間相結(jié)合從而形成免疫復(fù)合物的結(jié)合水平。在本發(fā)明的背景下，抗體是特異性IgE，配體是抗原。通常，特異性IgE與特定抗原結(jié)合。反應(yīng)性的水平可定義為IU/ml，或者可替代地，可定義為分配為分類得分值的范圍。例如，分類O為少于O. 35IU/ml ;分類I為O. 35至O. 7IU/ml ;分類2為O. 71至3. 5IU/ml ;分類3為
3.51 至 17. 5IU/ml ;分類 4 為 17. 51 至 50IU/ml 和分類 5 為 50. 01 至 100IU/ml?；蛘?，IgE對(duì)特定抗原的反應(yīng)性可被認(rèn)為是陽(yáng)性/存在或者是陰性/缺乏，例如低于閾值時(shí)，應(yīng)答被視為陰性/缺乏；高于閾值時(shí)，應(yīng)答是陽(yáng)性/存在。通常，水平> (大于)0. 35IU/ml表明陽(yáng)性結(jié)果，換言之，特異性IgE與其配體結(jié)合。事實(shí)上，使用合適的測(cè)定對(duì)樣品中特異性IgE與其配體(在本發(fā)明情況下為抗原)之間的相互作用形成的抗體-抗原復(fù)合物進(jìn)行測(cè)定。在本發(fā)明的背景下，術(shù)語(yǔ)變應(yīng)原意指可觸發(fā)由IgE抗體介導(dǎo)的變應(yīng)性反應(yīng)的特定抗原類型。本發(fā)明的方法和制備延展至此類變應(yīng)原及變應(yīng)原片段或充當(dāng)變應(yīng)原的半抗原的廣義類別。這些可包括可在變應(yīng)對(duì)象中引起IgE介導(dǎo)應(yīng)答的所有特異性過變應(yīng)原。變應(yīng)原可以是重組的或制備自天然來源的，并且其可包含單一表位或者具有兩個(gè)或更多個(gè)表位的更復(fù)雜的混合物，所述兩個(gè)或更多個(gè)表位來自單一抗原或者兩種或更多種變應(yīng)原個(gè)體。術(shù)語(yǔ)“變應(yīng)原”和“抗原”通?？苫Q。本文所使用的術(shù)語(yǔ)“多個(gè)”定義為兩個(gè)或多于兩個(gè)。在本發(fā)明的第一個(gè)方面的背景中，所用樣品的數(shù)目應(yīng)是足以產(chǎn)生統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性結(jié)果的數(shù)目。對(duì)于特定的抗原，該結(jié)果應(yīng)確定所述抗原與來自有癥狀對(duì)象的特異性IgE之間沒有相關(guān)性，或者確定所述抗原與來自有癥狀對(duì)象的特異性IgE之間有相關(guān)性；換言之，確定特定抗原與哮喘、結(jié)膜炎或鼻炎的存在之間是否有關(guān)聯(lián)性。 優(yōu)選地，為了鑒定任何相關(guān)性，應(yīng)測(cè)試大量的個(gè)體對(duì)象，例如總計(jì)30至1000個(gè)，優(yōu)選為總計(jì)50至1000個(gè)。通常，在每個(gè)實(shí)驗(yàn)或研究中只分析來自每個(gè)個(gè)體對(duì)象的一個(gè)樣品。取自每組的樣品數(shù)可大致相等，即當(dāng)總共使用了 1000個(gè)樣品時(shí)，500個(gè)來自無癥狀的對(duì)象，而500個(gè)來自有癥狀的對(duì)象。但是,對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員而言很清楚,對(duì)象和樣品的數(shù)目可根據(jù)許多因素(如患者招募)的不同而不同，并且不一定相等。因此，所用對(duì)象和樣品的數(shù)目應(yīng)是足以精確地建立相關(guān)性的數(shù)目。優(yōu)選地，所述多種抗原將是包含大量抗原的集合，例如大于10、20、30、40、50、60、70、80、90、100 種，更具體地，大于 150、200、250、300、350、400、450 或 500 種。通過使每個(gè)個(gè)體樣品(包含特異性IgE)分開地與多種抗原基本上平行地相接觸以及測(cè)定來自所述樣品的與每種抗原結(jié)合的每種特定抗原的量來確定IgE反應(yīng)性的水平。通常，該方法的特征在于包括兩個(gè)分開的步驟(a)在分離自無癥狀對(duì)象組的多個(gè)第一樣品中測(cè)量針對(duì)多種抗原的IgE反應(yīng)性水平，(b)在分離自患有哮喘、結(jié)膜炎或鼻炎的對(duì)象組的多個(gè)第二樣品中測(cè)量針對(duì)多種抗原的IgE反應(yīng)性水平。為避免疑義，對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員而言很清楚，這種分成兩個(gè)單獨(dú)步驟的分開是出于書面描述目的的人為分離?；旧?，兩個(gè)步驟是相同的，只有樣品取自的組不同。因而，在實(shí)驗(yàn)室中，(a)和(b)可概括為對(duì)于來自每組的每個(gè)樣品重復(fù)的單一步驟，即(ab)在分 離自對(duì)象的樣品中測(cè)量針對(duì)多種抗原的IgE反應(yīng)性水平。對(duì)于“η”個(gè)樣品，步驟(ab)重復(fù)至少“η”次。因此，當(dāng)多個(gè)第一樣品包含“χ”個(gè)樣品且多個(gè)第二樣品包含“y”個(gè)樣品時(shí)，χ+y等于重復(fù)的數(shù)目n。所以，顯然步驟(a)和
(b)可以以任何順序平行地或者依次地進(jìn)行，或者根據(jù)需要重復(fù)步驟(ab)直到測(cè)試完所有樣品。優(yōu)選地，通過使用抗IgE抗體的免疫測(cè)定的方法測(cè)量針對(duì)多種抗原的IgE反應(yīng)性的水平?？笽gE抗體與人免疫球蛋白的IgE同種型反應(yīng)。因此，在某些實(shí)施方案中，通過使用抗IgE抗體確定或定量與每種抗原結(jié)合的IgE的量?？笽gE抗體可以是多克隆抗體、單克隆抗體、雙特異性抗體、人源化抗體或嵌合抗體，盡管通常優(yōu)選為親和純化抗體，更特別地為單克隆抗體。此類抗IgE抗體可以是常規(guī)抗體或重組抗體并且可由單鏈組成，但優(yōu)選為由至少輕鏈或重鏈組成。但是，應(yīng)了解，為了結(jié)合靶標(biāo)(如抗體特異性結(jié)合的抗原)需要至少一個(gè)互補(bǔ)決定區(qū)(⑶幻。制備抗IgE抗體的方法為本領(lǐng)域所知。例如，如果期望多克隆抗體，那么可使用所選抗原(如異源抗原IgE)免疫接種選擇的哺乳動(dòng)物如人、小鼠、兔、豬、綿羊、駱駝、山羊或馬。之后收集并處理來自經(jīng)免疫的動(dòng)物的血清以獲得抗體，例如通過免疫親和層析。單克隆抗IgE抗體可通過本領(lǐng)域已知的方法生產(chǎn)。使用雜交瘤技術(shù)制備單克隆抗體的一般性方法是公知的(參見，例如，Kohler, G和Milstein, C, Nature 256 495-497 (1975) ；Kozbor 等，Immunology Today 4:72(1983) ；Cole 等，MonoclonalAntibodies and Cancer Therapy 中的第 77 96 頁(yè)，Alan R. Liss, Inc. (1985))。本文所提及的一種抗IgE抗體應(yīng)由表位結(jié)合區(qū)(如CDR)組成。該抗體可以是任何合適的分類，包括IgE、IgM、IgD、IgA以及特別是IgG。還考慮了這些抗體的多種亞類。在一些具體的實(shí)施方案中，可使用抗IgE抗體或保留抗IgE抗體結(jié)合特異性的來源于此類抗體的多肽。此類片段包括，但不限于抗體片段，如Fab、Fab’、F(ab’)2和Fv，其全部都能結(jié)合至表位。術(shù)語(yǔ)“抗IgE抗體”還擴(kuò)展至任何多種天然或人工抗體以及可獲得的抗體衍生蛋白質(zhì)以及衍生物，例如包括但不限于多克隆抗體，單克隆抗體，嵌合抗體，人源化抗體，人抗體，單結(jié)構(gòu)域抗體，全抗體，抗體片段如F(ab’)2和F(ab)片段、Fv片段(非共價(jià)異二聚體)，單鏈抗體如單鏈Fv分子(scFv)、微型抗體、寡聚抗體(oligobody)、二聚或三聚抗體片段或者構(gòu)建體，等等。術(shù)語(yǔ)“抗IgE抗體”不暗示任何特定來源，其包括通過非常規(guī)方法所獲得的抗體，如噬菌體展示。本發(fā)明的抗體可以是任何的同種型(例如IgA、IgG、IgM即α、Y或μ重鏈)并且可以具有K (kappa)或λ (lambda)輕鏈。因此，本發(fā)明擴(kuò)展至抗IgE抗體和具有用于本發(fā)明的IgE結(jié)合特異性的結(jié)合片段的用途。術(shù)語(yǔ)“特異地結(jié)合”或“結(jié)合特異性”指抗體或其片段以大于結(jié)合非靶表位的親和性結(jié)合靶標(biāo)的能力。例如，抗體與靶表位的結(jié)合可導(dǎo)致比非靶表位的結(jié)合親和性高至少10、50、100、250、500或1000倍的結(jié)合親和性。在某些實(shí)施方案中，結(jié)合親和性由親和ELISA測(cè)定所確定。在一些替代性實(shí)施方案中，親和性由BIAcore測(cè)定所確定?；蛘撸Y(jié)合親和性可由動(dòng)力學(xué)方法確定。在一些具體的實(shí)施方案中，抗IgE抗體是帶標(biāo)記的抗體。作為非限制性的實(shí)例，標(biāo)記可通過與酶(如過氧化物酶)或者化學(xué)發(fā)光或突光化合物(Alexa Fluor 555)或質(zhì)量標(biāo) 簽(mass tag)相綴合。在另一些實(shí)施方案中，抗IgE抗體是未標(biāo)記的并且通過使用另外的抗體檢測(cè)，另外的抗體一般稱為第二抗體，如所述其可以是帶標(biāo)記的。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，抗IgE抗體是抗IgE的未標(biāo)記小鼠單克隆抗體，其使用帶標(biāo)記的第二抗體來檢測(cè)，如抗小鼠IgG。在某些實(shí)施方案中，一個(gè)或更多個(gè)發(fā)光的或發(fā)熒光的部分可結(jié)合親和素/鏈霉親和素，所述親和素/鏈霉親和素繼而可結(jié)合與抗體化學(xué)綴合的生物素。在另一些實(shí)施方案中，凝集素(蛋白A/G/L)可連接發(fā)光或熒光分子，該分子還可連接抗體或其他蛋白質(zhì)綴合物。在一些優(yōu)選的實(shí)施方案中，使用了酪胺信號(hào)放大系統(tǒng)(tyramide signal amplification system),其使用辣根過氧化物酶(HRP)的催化活性以產(chǎn)生抗體的高密度標(biāo)記。合適的標(biāo)記和標(biāo)記方法是本領(lǐng)域已知的并且對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員而目是清楚的。在一些具體的實(shí)施方案中，帶標(biāo)記的抗體包含熒光標(biāo)記。適當(dāng)?shù)臒晒鈽?biāo)記為本領(lǐng)域所熟知，例如，非限制性的實(shí)例可包括Alexa Fluor488,Alexa Fluor 555、R-藻紅蛋白、Aqua、德克薩斯-紅(Texas-Red)、FITC、羅丹明、羅丹明衍生物、熒光素、熒光素衍生物、級(jí)聯(lián)藍(lán)(cascade blue)、Cy5或Cy3。檢測(cè)方法可以是本領(lǐng)域已知的任何合適的方法，如通過光學(xué)檢測(cè)，包括熒光測(cè)量、比色法、流式細(xì)胞術(shù)、化學(xué)發(fā)光等。其他方法包括電化學(xué)法、放射性方法、壓電法等。檢測(cè)結(jié)合的另一些方法可以是表面等離子體共振(surface Plasmon resonance, SPR)、表面等離子體顯微鏡(surface Plasmon microscopy, SPM)、表面等離子體突光光譜(surfacePlasmon fluorescence spectroscopy)或SELDI質(zhì)譜等。技術(shù)人員將了解可通過使用檢測(cè)方法的組合進(jìn)行檢測(cè)。具體地，通過發(fā)光信號(hào)的測(cè)量/檢測(cè)進(jìn)行結(jié)合的檢測(cè)，例如通過化學(xué)發(fā)光化合物產(chǎn)生的化學(xué)發(fā)光。盡管群體所接觸的許多抗原在一個(gè)地理區(qū)域和另一個(gè)區(qū)域之間是共有的，但是可能有特定的抗原在一些區(qū)域是常見的但在另一些區(qū)域是稀有的。因此，對(duì)于每次分析或每一次實(shí)施所述方法，合適的抗原可選自在特定地理區(qū)域或國(guó)家中最常見的抗原，并且所述合適抗原可以變化。表I中鑒定了合適的多種抗原，具體為103種抗原。本領(lǐng)域的技術(shù)人員能夠選擇適當(dāng)?shù)目乖秃线m的抗原并且抗原制品為普遍可商購(gòu)的。盡管一般分開地評(píng)估每個(gè)個(gè)體樣品，但是優(yōu)選地，基本上同時(shí)測(cè)量每個(gè)樣品中對(duì)所述多種抗原的反應(yīng)性水平。例如，如果所述多種抗原包含50種抗原，那么對(duì)于1000個(gè)對(duì)象的組，將進(jìn)行1000個(gè)單獨(dú)的測(cè)定并且測(cè)量50，000個(gè)反應(yīng)的結(jié)果。一個(gè)接一個(gè)測(cè)量如此大量的反應(yīng)，盡管是可能的，但通常是不可行的并且將花費(fèi)大量的時(shí)間和人力去完成。因而，為了有助于平行處理大量的抗原，優(yōu)選地，所述多種抗原結(jié)合至至少一個(gè)具有多個(gè)地址的固體支持物，所述地址每個(gè)具有一個(gè)獨(dú)特的(即特異性)抗原布置于其上。固體支持物的使用是有利的，因?yàn)槠淠軌蚱叫刑幚泶罅康目乖瑫r(shí)盡可能地減少所需的時(shí)間和人力。所述固體支持物可以是本領(lǐng)域已知的任何材料，例如玻璃載體、合成載體、硅片或膜。合適的材料包括塑料、玻璃、硅、陶瓷或有機(jī)聚合物(包括聚苯乙烯、聚碳酸酯、聚丙烯、聚乙烯、纖維素和硝化纖維)。其自身表面可以是如下形式或其部分載玻片、片、微量培養(yǎng)·板或微量滴定板、托盤、膜、纖維、孔、丸、棒、棍、管、珠等。所使用的術(shù)語(yǔ)“結(jié)合”意指物質(zhì)(在本發(fā)明情況下為抗原)在分子水平(即，通過共價(jià)或非共價(jià)鍵或相互作用)上保留、固定或基本上結(jié)合至表面。所使用的固定方法應(yīng)當(dāng)是可再現(xiàn)的，適用于不同特性(大小、親水性、疏水性)的抗體、可用于高通量和自動(dòng)化，并且維持抗原與抗體形成復(fù)合物的能力。非限制性的實(shí)例是本領(lǐng)域已知的非限制性的合適方法包括被動(dòng)吸收、基于親和性的結(jié)合、與化學(xué)活化表面共價(jià)偶聯(lián)、光化學(xué)交叉偶聯(lián)等。術(shù)語(yǔ)“地址”用于指固體支持物或固體支持物上確定位置的獨(dú)特特征，其允許識(shí)別特定抗原，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)針對(duì)特定抗原的IgE反應(yīng)性水平的測(cè)定。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述固體支持物是多個(gè)珠子，其每個(gè)可通過地址分別識(shí)別。合適的地址包括RFID標(biāo)簽、質(zhì)量標(biāo)簽、熒光標(biāo)簽、光學(xué)編碼、數(shù)字磁性標(biāo)簽、光譜編碼等。在另一些實(shí)施方案中，所述固體支持物為微陣列。本文所使用的術(shù)語(yǔ)“微陣列”指用于結(jié)合IgE抗體的點(diǎn)的有序陣列。本發(fā)明的微陣列包含至少2個(gè)、至少9個(gè)、至少50個(gè)、至少100個(gè)、至少500個(gè)或至少1000個(gè)點(diǎn)。在一些實(shí)施方案中，微陣列可包含至少10,000、40，000,100, 000或I, 000，000個(gè)不同且獨(dú)特的點(diǎn)。點(diǎn)的密度為約100個(gè)/cm2至約1000個(gè)/cm2或更高。“點(diǎn)”表示放置于陣列表面上特定地址(在本發(fā)明情況下為物理位置)的一種或更多種試劑(在本發(fā)明的情況下為特定抗原或變應(yīng)原制備物)。通常情況下，點(diǎn)的特征在于存在一種或更多種特異性分子(例如，特定的蛋白質(zhì)、變應(yīng)原提取物、抗原等)。點(diǎn)直徑可為10至2000 μ m，50至500μπι或150至250 μ m。為了形成陣列，抗原可以以O(shè). 008mg/ml至3mg/ml的點(diǎn)樣濃度施于固體支持物的表面。適于測(cè)量或讀取來自微陣列的熒光信號(hào)的系統(tǒng)是已知的。通常，通過在激光點(diǎn)下二維掃描載玻片來構(gòu)建圖像。在約I分鐘內(nèi)可取得圖像，但是在圖像分析處理方面，分析是復(fù)雜的。由于所產(chǎn)生的大量數(shù)據(jù)以及產(chǎn)生來自每個(gè)點(diǎn)或微點(diǎn)的集成信號(hào)的清晰測(cè)定所需的分析算法，這些處理可以是復(fù)雜的。在本發(fā)明人之前的專利申請(qǐng)(公開為W0/2003/091712)中，為了逐個(gè)像素的構(gòu)建每個(gè)點(diǎn)的圖像，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)有可能通過下述方式讀取熒光，即通過照射陣列上每個(gè)點(diǎn)的整體以及在單一測(cè)量中測(cè)量整個(gè)點(diǎn)的熒光，而不是分?jǐn)?shù)次對(duì)每個(gè)點(diǎn)的一部分進(jìn)行掃描和照射。這個(gè)方法使得低成本光源LED可用作發(fā)光源。每個(gè)熒光分子接受相同的光能，如同如果相干光源被用作發(fā)光源時(shí)那樣。但是檢測(cè)器產(chǎn)生單一閱讀，不需要進(jìn)一步信號(hào)分析(而不是400像素圖像/點(diǎn)，其需要復(fù)雜的圖像處理以計(jì)算整個(gè)測(cè)量)。在一些情況下，由于干涉作用而在信號(hào)中引入的額外噪音，相干光源的使用是不利的。在另一些實(shí)施方案中，如在國(guó)際專利公開W02006/138161中所公開的設(shè)想使用微懸臂梁。在另一些實(shí)施方案中，使用一個(gè)或更多個(gè)微流體芯片進(jìn)行測(cè)定。該方法的第三個(gè)步驟包括，(C)鑒定在對(duì)象組之間顯示出IgE反應(yīng)性水平顯著差異的所述多種抗原的子集，其中針對(duì)所述子集的IgE反應(yīng)性水平與哮喘、結(jié)膜炎或鼻炎的臨床診斷相關(guān)聯(lián)。 可通過使用統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)分析方法來確定對(duì)象組之間的顯著差異的IgE反應(yīng)性水平。數(shù)據(jù)集的統(tǒng)計(jì)分析可被用以確定一種或更多種抗原是否與哮喘、結(jié)膜炎或鼻炎的臨床診斷相關(guān)，即相關(guān)聯(lián)。例如，根據(jù)針對(duì)特定抗原的IgE反應(yīng)性水平，對(duì)象可被分為至少兩個(gè)分類。之后，通過聚類或?qū)W習(xí)算法分析IgE反應(yīng)性和健康狀況之間的相關(guān)性。作為非限制性的實(shí)例，合適的方法包括有監(jiān)督和/或無監(jiān)督聚類算法、k-均值、主成分分析、分層聚類、最近鄰分析、支持向量機(jī)、人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)等。特定的聚類或分類中的顯著量對(duì)象(例如，至少50%、60%、70^^80^^90%或更多)可具有第一健康狀況，以及在一個(gè)或更多個(gè)其他分類中的顯著量患者可具有不同的健康狀況。從而，相對(duì)于另一組對(duì)象，可鑒定IgE對(duì)第一組對(duì)象中多種抗原的反應(yīng)性的差異。對(duì)此類抗原反應(yīng)性的水平可用作生物標(biāo)志物用于預(yù)測(cè)/確定對(duì)象的健康狀況、臨床效果或治療效果。與臨床病癥相關(guān)的并經(jīng)鑒定的反應(yīng)性水平代表了反應(yīng)性的理想模式，該模式是不同健康狀況的對(duì)象的代表。結(jié)果，此類疾病特定的模式或特征譜可進(jìn)行比較以預(yù)測(cè)/確定對(duì)象的健康狀況、臨床或治療效果。合適的方法如下例證，其包括聚類分析以將數(shù)據(jù)分配到子集或聚類。分析的終點(diǎn)是與哮喘、結(jié)膜炎或鼻炎的臨床診斷相關(guān)或相關(guān)聯(lián)的來自所述多種抗原的抗原子集的鑒定。針對(duì)抗原的子集IgE反應(yīng)性可用以制備可用于比較的針對(duì)特定臨床狀況的一般性反應(yīng)性特征譜。在下面的實(shí)驗(yàn)部分例證了鑒定與此類臨床診斷相關(guān)的51種抗原的子集。表4中列出了包含所述抗原子集的抗原。顯然，任何特定子集的組成取決于所使用的多種抗原的組成。更顯然，可合并與臨床診斷相關(guān)聯(lián)的抗原子集。例如，第一集合包含20種抗原，第二子集包含30種抗原，假定所述子集之間沒有共有的抗原，合并的子集將包含50種抗原。但是，子集之間可能有一些交叉，使得在組合的子集中抗原的總數(shù)可能少于組合前每個(gè)子集中抗原數(shù)目的總和。在這種情況下，所使用的術(shù)語(yǔ)合并簡(jiǎn)單地意指所述抗原一起使用，例如分別放置在同一微陣列上。本發(fā)明的第二個(gè)方面提供了評(píng)估對(duì)象是否已經(jīng)發(fā)生哮喘、結(jié)膜炎或鼻炎或者具有其發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)的方法。該方法包括(a)在分離自所述對(duì)象的樣品中測(cè)量針對(duì)生物標(biāo)志物集合的IgE反應(yīng)性水平的步驟。在本發(fā)明的背景中，至少一定比例的生物標(biāo)志物來源于與哮喘、結(jié)膜炎或鼻炎的臨床診斷相關(guān)的抗原子集。優(yōu)選地，所述抗原已根據(jù)本發(fā)明的第一個(gè)方面被鑒定。從而，此類抗原已知與臨床診斷相關(guān)聯(lián)。因此，本文所使用的術(shù)語(yǔ)“預(yù)先確定相關(guān)聯(lián)”指，在用于所述方法之前，一個(gè)要素(例如抗原)的反應(yīng)性已顯示出與所關(guān)心疾病或異常具有統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著的相關(guān)性。在下文的實(shí)驗(yàn)章節(jié)中并根據(jù)本發(fā)明的第一個(gè)方面例證了用于確定此類相關(guān)性的合適方法。所使用的術(shù)語(yǔ)“比例”意指至少10 %的生物標(biāo)志物是預(yù)先確定與關(guān)心的疾病或異常相關(guān)的抗原。更具體地，至少15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%或50%，或者至少55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%或95%的生物標(biāo)志物預(yù)先確定與關(guān)心的疾病或異常相關(guān)。在某些實(shí)施方案中，所有的生物標(biāo)志物(100% )預(yù)先確定與關(guān)心的疾病或異常相關(guān)。對(duì)象的IgE反應(yīng)性特征譜之間的相似或差異指示了對(duì)象的分類成員及其各自的健康狀況。相似或差異可由任何合適的方法確定，例如由上述的統(tǒng)計(jì)學(xué)方法。比較可以是 定性的、定量的或其兩者。針對(duì)抗原子集的IgE反應(yīng)性可用以制備反應(yīng)性特征譜，其可用于與特定的臨床病癥的一般性特征譜進(jìn)行比較。對(duì)象的生物標(biāo)志物特征譜可與參照特征譜(手動(dòng)地或電子地)相比較。在一個(gè)實(shí)例中，通過將針對(duì)特定抗原的每個(gè)IgE反應(yīng)性水平與參照數(shù)據(jù)集或特征譜中針對(duì)特定抗原的一般性IgE反應(yīng)性水平進(jìn)行比較，來實(shí)施所述比較。針對(duì)特定抗原的IgE反應(yīng)性可具有絕對(duì)值或歸一化的值?？赏ㄟ^倍數(shù)變化、絕對(duì)差、模式識(shí)別或比較或者其他合適的方法(包括算法)來評(píng)估針對(duì)對(duì)象的特定抗原的IgE反應(yīng)性與參照特征譜或數(shù)據(jù)集之間的差異。在某些實(shí)施方案中，在來自對(duì)象的樣品中，針對(duì)生物標(biāo)志物集合中至少75%的IgE反應(yīng)性水平高于3. 51 IU/ml表明對(duì)象可能發(fā)生或已經(jīng)發(fā)生哮喘、結(jié)膜炎或鼻炎。在另一些實(shí)施方案中，反應(yīng)性水平可高于O. 71IU/ml、高于3. 51IU/ml、高于
17.51IU/ml或高于50.01IU/ml。顯然，IgE反應(yīng)性與針對(duì)抗原的應(yīng)答將有變異性。因此，優(yōu)選地,針對(duì)至少75%、至少80%、至少85%、至少90%或至少91 %、92%、93%、94%、95%、96^^97^^98^^99%或100%的所述多種抗原的陽(yáng)性反應(yīng)表明對(duì)象可能發(fā)生或已經(jīng)發(fā)生哮喘、結(jié)膜炎或鼻炎。另外，顯然可以有指示臨床狀況但在抗原之間有所差異的特定的反應(yīng)性閾值水平。因此，為了診斷或預(yù)測(cè)的目的，17.51IU/ml的反應(yīng)性水平可指示一個(gè)抗原的陽(yáng)性結(jié)果，但是指示另一個(gè)的陰性結(jié)果。在一些具體的實(shí)施方案中，生物標(biāo)志物集合包含9至51種預(yù)先確定與關(guān)心的疾病或異常相關(guān)的抗原。預(yù)先確定與關(guān)心的疾病或異常相關(guān)的抗原包括抗原C2、D1、D2、D3、D70、D71、D72、D73、E1、E3、E81、E82、F4、F16、F25、F35、F49、F84、F95、G1、G2、G3、G4、G5、G6、G8、G12、G14、G15、G18、I6、K87、M1、M3、M4、M5、M6、T4、T6、T7、T9、T14、T901、W1、W6、X902、X903、X904、X905、X907和X910。在下面的實(shí)驗(yàn)部分中例證這些抗原的鑒定。在一些具體的實(shí)施方案中，優(yōu)選地至少包括抗原F95、G1、G3、G4、G12、G14、G15和G18。如上所討論的，關(guān)于本發(fā)明的第一個(gè)方面，可通過將所述多種抗原或生物標(biāo)志物與分離自對(duì)象的血清相接觸以及通過使用抗IgE抗體測(cè)定與每種抗原結(jié)合的IgE的量來確定IgE的反應(yīng)性水平。IgE抗體的檢測(cè)表明致敏過程已經(jīng)開始。伴隨癥狀和陽(yáng)性病史，其確認(rèn)了臨床診斷；或者，在沒有癥狀的情況下，其可預(yù)測(cè)變應(yīng)性疾病隨后的發(fā)展。常常發(fā)現(xiàn)，特異性IgE抗體應(yīng)答先于癥狀出現(xiàn)，而癥狀隨時(shí)間隨后才發(fā)生。再次，如上述，關(guān)于本發(fā)明的第一個(gè)方面，所述抗原與固體支持物結(jié)合。因而，在本發(fā)明的第三個(gè)方面中，提供了抗原微陣列，其用于評(píng)估對(duì)象是否已經(jīng)發(fā)生哮喘、結(jié)膜炎或鼻炎或者具有其發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)的方法，所述抗原微陣列包含抗原F95、GU G3、G4、G12、G14、G15和G18和任選地一種或更多種選自以下的抗原C2、Dl、D2、D3、D70、D71、D72、D73、E1、E3、E81、E82、F4、F16、F25、F35、F49、F84、G2、G5、G6、G8、I6、K87、M1、M3、M4、M5、M6、T4、T6、T7、T9、T14、T901、W1、W6、X902、X903、X904、X905、X907 和 X910。優(yōu)選地，明確地排除不根據(jù)本發(fā)明的第一個(gè)或第二個(gè)方面使用的或者不用于評(píng)估對(duì)象是否已經(jīng)發(fā)生哮喘、結(jié)膜炎或鼻炎或者具有其發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)的抗原微陣列。 在本發(fā)明的第四個(gè)方面中，提供試劑盒，其包含(i)抗原F95、G1、G3、G4、G12、G14、G15 和 G18 以及(ii)任選地一種或更多種抗原 C2、D1、D2、D3、D70、D71、D72、D73、E1、E3、E81、E82、F4、F16、F25、F35、F49、F84、G2、G5、G6、G8、I6、K87、M1、M3、M4、M5、M6、T4、T6、T7、T9、T14、T901、Wl、W6、X902、X903、X904、X905、X907 和 X910。以適用于根據(jù)第一個(gè)和第二
個(gè)方面的方法或適用于根據(jù)本發(fā)明的第三個(gè)方面的制備微陣列的形式提供抗原。此類試劑盒還可包含其他組分，例如抗IgE抗體、洗滌緩沖液、稀釋劑、抗體(即一抗、二抗、三抗)、檢測(cè)劑、熒光團(tuán)、手套、移液器槍頭、操作說明書等。優(yōu)選地，抗原以微陣列上點(diǎn)的形式提供并且還可包括對(duì)照和標(biāo)準(zhǔn)品等。因而，所述試劑盒可包含陣列，其由下列抗原組成C2、Dl、D2、D3、D70、D71、D72、D73、E1、E3、E81、E82、F4、F16、F25、F35、F49、F84、F95、G1、G2、G3、G4、G5、G6、G8、G12、G14、G15、G18、I6、K87、M1、M3、M4、M5、M6、T4、T6、T7、T9、T14、T901、W1、W6、X902、X903、X904、X905、X907和X910?；蛘?，所述試劑盒可包含陣列，其包含抗原C2、DU D2、D3、D70、D71、D72、D73、E1、E3、E81、E82、F4、F16、F25、F35、F49、F84、F95、G1、G2、G3、G4、G5、G6、G8、G12、G14、G15、G18、16、K87、Ml、M3、M4、M5、M6、T4、Τ6、Τ7、T9、Τ14、Τ901、Wl、W6、Χ902、Χ903、Χ904、Χ905、Χ907和 Χ910。在本發(fā)明的第五個(gè)方面中，以及如在實(shí)驗(yàn)部分所例證的，提供了第一個(gè)和第二個(gè)方面的方法、第三個(gè)方面的微陣列或第四個(gè)方面的試劑盒的用途，其用于評(píng)估對(duì)象是否已經(jīng)發(fā)生哮喘、結(jié)膜炎或鼻炎或者具有其發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)。在本發(fā)明的第六個(gè)方面中，提供了前述方面的方法、微陣列或試劑盒在篩選用于治療哮喘、結(jié)膜炎或鼻炎的化合物中的用途。例如，所述方法可包括以下步驟(a)在分離自對(duì)象的第一樣品中測(cè)量針對(duì)生物標(biāo)志物集合的IgE的反應(yīng)性水平；(b)在分離自對(duì)象的第二樣品中測(cè)量針對(duì)生物標(biāo)志物集合的反應(yīng)性水平和(c)比較IgE的反應(yīng)性水平以確定任何具有以下特征的差異，即一定比例的生物標(biāo)志物是預(yù)先確定為與哮喘、結(jié)膜炎或鼻炎的臨床診斷相關(guān)的抗原。在一個(gè)實(shí)施方案中，第一樣品可在用藥物或藥品治療前取自對(duì)象。第二樣品可在用藥物或藥品治療后取自同一對(duì)象。在第一和第二樣品之間的反應(yīng)性水平的任何改變可指示特定的藥物或樣品在治療哮喘、結(jié)膜炎或鼻炎中有用或者具有臨床應(yīng)用。或者，該結(jié)果可指示針對(duì)個(gè)體對(duì)象的治療方案的效力。顯然，根據(jù)第一個(gè)、第二個(gè)、第五個(gè)和第六個(gè)方面的方法或其每個(gè)階段之間，可包括任選的洗滌、干燥和/或孵育步驟。所述方法還可任選地包括所述方法的一個(gè)或更多個(gè)步驟之間的“封閉步驟”，例如其中將非相互作用蛋白(如牛血清白蛋白(BSA))的濃溶液添加至例如微量滴定板的全部孔中。此類蛋白阻斷了其他蛋白的非特異性吸附并且在降低可干擾測(cè)定靈敏度的“背景”假象中可能是有益的。通過引用下列描述和實(shí)施例可更好的理解本發(fā)明，下列描述和實(shí)施例意圖作為本發(fā)明的方法的示例。
實(shí)施例群體案例研究這個(gè)研究包括后代患特應(yīng)性哮喘的家族。所有的哮喘患者是特應(yīng)性的。在4年的 時(shí)期內(nèi)收集特應(yīng)性哮喘的兄弟姐妹兩人(同胞親屬)和三人，主要來自兒科和肺病中心。為了避免擬表型(phenocopy)，所有的患者滿足下列標(biāo)準(zhǔn)至少3代為撒丁島人來源和訪視時(shí)年齡> 6歲。在募集時(shí)期，每個(gè)對(duì)象接受面試,通過身體檢查確定疾病狀況,請(qǐng)求使用個(gè)人健康記錄的許可，以及收集血液樣品。每個(gè)參與者簽署經(jīng)當(dāng)?shù)貍惱砦瘑T會(huì)(Azienda SanitariaLocale number 8 protocol 24/Comitato Etico/02, authorization number 4737)批準(zhǔn)的知情同意書。哮喘由肺科醫(yī)師診斷，依照美國(guó)胸科學(xué)會(huì)(American Thoracic Society)標(biāo)準(zhǔn)(I)由肺量測(cè)量法評(píng)價(jià)肺功能用升/分鐘表示I次的用力呼氣量(FEVl)。根據(jù)世界衛(wèi)生組織指南(World Health Organization guideline)(全球哮喘防治創(chuàng)議(GlobalInitiative for Asthma)),醫(yī)師進(jìn)行問卷調(diào)查以收集病史并將哮喘嚴(yán)重程度分為4個(gè)水平。記錄哮喘藥品和任何其他藥劑的使用。使用標(biāo)準(zhǔn)方法通過對(duì)常見吸入性變應(yīng)原的陽(yáng)性皮膚測(cè)試來測(cè)定特應(yīng)性。關(guān)于青春期(18歲)結(jié)束后哮喘癥狀的持續(xù)性由醫(yī)師與具有早期發(fā)作史的患者面談。樣品由總計(jì)872份血清(包含440位父母的及其子女(432個(gè)個(gè)體))組成。在研究組內(nèi)，428位兒童和58位父母(總數(shù)的55. 73% )被診斷為哮喘，341位父母(總數(shù)的39. 11% )被分類為非哮喘，但是他們中的一些患特應(yīng)性相關(guān)的病癥，如鼻炎、結(jié)膜炎和濕疹，剩余的5. 16%被分類為未證實(shí)的哮喘診斷。將這些數(shù)據(jù)列于表2中?；谖㈥嚵械拿庖邷y(cè)定的開發(fā)微陣列免疫測(cè)定法由4個(gè)階段組成(“印刷”、處理、掃描、定量和分析)。微陣列的制備為了產(chǎn)生陣列，將選擇的變應(yīng)原(天然提取物、經(jīng)純化的變應(yīng)原和重組分子)一式兩份地印刷在乙醛活化的玻璃顯微鏡載玻片上亂序的位置，以使得處理錯(cuò)誤的影響最小化。所述陣列還可包含陽(yáng)性和陰性對(duì)照、空白和內(nèi)部劑量應(yīng)答曲線。為了減少標(biāo)準(zhǔn)點(diǎn)樣時(shí)間、減少批次間變異性和增加每次測(cè)試所處理的芯片數(shù)目，在單個(gè)顯微鏡載玻片上印刷兩個(gè)芯片(“變應(yīng)芯片”)。每個(gè)微陣列批次包含120個(gè)載玻片，總計(jì)240個(gè)變應(yīng)芯片(執(zhí)行時(shí)間為14小時(shí))。研究組的分析需要總共480個(gè)經(jīng)印刷的載玻片，相當(dāng)于960個(gè)芯片，并且全部的印刷過程被分成4個(gè)批次。每個(gè)芯片包含使用高速機(jī)器人技術(shù)(Microgrid Compact ；Biorobotics) 一式兩份地印在經(jīng)乙醒活化的玻璃顯微鏡載玻片(CEL Associates)的103種變應(yīng)原。在23°C /60°C濕度下“印刷”陣列并在印刷箱內(nèi)保存過夜。最初在pH7. 4的PBS (重構(gòu)緩沖液)中重構(gòu)變應(yīng)原(由Allergopharma提供)，其終濃度為O. 4至40mg/ml,然后在下列點(diǎn)樣緩沖液中點(diǎn)在陣列上PBS pH7. 4、甘氨酸ρΗ2· 4、硼酸鹽ρΗ9· 4、甘油10%、DTT 5mM、SDS (O. 2%；0. 05% )、吐溫20(0. 01% )D每個(gè)變應(yīng)原的點(diǎn)樣濃度為O. 008至3mg/ml。微陣列加工用含有2% BSA的PBS在室溫下將經(jīng)印刷的載玻片封閉I小時(shí)。之后將載玻片與各個(gè)血清樣品(100μ I)在37°C下孵育60分鐘。為了顯現(xiàn)結(jié)合的IgE，載玻片用抗人IgE的第二小鼠單克隆抗體(O. Hyg/miaOOy I)在37°C下孵育45分鐘，然后用抗小鼠IgG HRP綴 合抗體(1.6 μ g/mL，100 μ I)在37°C下孵育45分鐘，最后用以I : 200稀釋的酪胺-Alexa555 (具有HRP-鏈霉親和素和Alexa Fluor 555酪胺*的TSA Kit#42 *，* 50-150個(gè)載玻片*) (InvitiOgen) (100 μ I)在37°C下孵育15分鐘。在測(cè)量熒光信號(hào)之前，載玻片37°C下干燥。熒光測(cè)量使用突光檢測(cè)掃描儀ScanArray Gx掃描經(jīng)加工的載玻片并且使用由PerkinElmer Life Sciences Inc提供的ScanArray 軟件產(chǎn)生圖像。在相同的設(shè)置下掃描所有的載玻片90%激光功率和60%光電倍增管增益。結(jié)合的IgE的定量使用ProScanArray Express 3. O版軟件獲取突光信號(hào)。針對(duì)內(nèi)部陰性對(duì)照校正各個(gè)點(diǎn)的PMC讀取值，以確定高于背景的信號(hào)。對(duì)各個(gè)變應(yīng)原進(jìn)行一式兩份的測(cè)量。通過具有在每個(gè)微陣列上所印記的內(nèi)部校準(zhǔn)曲線的插值確定變應(yīng)原結(jié)合的IgE的濃度(IU/ml)。校準(zhǔn)曲線由遞減的鏈霉親和素的量(80 μ g/ml ；53. 3 μ g/ml ；35. 6 μ g/ml ；
23.7 μ g/ml ；15.8yg/ml ；10. 5yg/ml ；7. 02 μ g/ml)組成，其捕獲加入至封閉溶液的骨髓瘤生物素化的IgE。為了將IU/ml值賦給校準(zhǔn)曲線，使用由微陣列載玻片產(chǎn)生的外部參考曲線對(duì)不同量的經(jīng)印刷鏈霉親和素下所收集的平均信號(hào)進(jìn)行插值處理，該微陣列載玻片用重復(fù)的山羊抗人IgE印刷并用遞增濃度的人IgE(WH0參考標(biāo)準(zhǔn)0. 35IU/ml, I. 0IU/ml,3. 5IU/ml, 10. 0IU/ml,50. OlU/ml)孵育。使用校準(zhǔn)曲線對(duì)從變應(yīng)原收集的信號(hào)進(jìn)行插值處理，以獲得IU/ml值并轉(zhuǎn)化成在標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)性等級(jí)中通過繪制數(shù)據(jù)的分類得分。分類得分值分類0(少于0.35IU/ml);分類 1(0. 35 0. 71IU/ml);分類 2(0. 71 3. 5IU/ml);分類 3(3. 51 17. 5IU/ml);分類4(17. 51 50IU/ml);分類 5(50. 01 100IU/ml)。使用熒光免疫測(cè)定分析血清IgE反應(yīng)性，其作為基礎(chǔ)并入103種變應(yīng)原的微陣列，這些變應(yīng)原代表了從歐洲中南部與特應(yīng)性疾病最頻繁相關(guān)聯(lián)的變應(yīng)原中選擇的11個(gè)獨(dú)特的變應(yīng)原分類。分析血清反應(yīng)性特征譜在用103-維載體(每個(gè)變應(yīng)原I維)編碼每個(gè)血清反應(yīng)性特征譜之后，使用Cluster 3. 035軟件通過k_均值聚類分析來分析通過血清與陣列免疫測(cè)定一起孵育而產(chǎn)生的反應(yīng)性特征譜，以及使用MapleTree來顯現(xiàn)聚類結(jié)果。通過使用不同數(shù)目的聚類進(jìn)行特征譜分配的嘗試，以鑒定使得聚類內(nèi)相似性和聚類間差異最大化的條件。為此，我們分析了具有數(shù)個(gè)性能指標(biāo)的聚類譜，如由Machaon37、38軟件提供，以驗(yàn)證每種分配嘗試的統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性。在k = 3的條件下(即設(shè)置成獲得3個(gè)聚類的k-均值聚類分析)，5個(gè)性能指標(biāo)中有4個(gè)，如由Machaon得到的最高值所計(jì)算的。分析在k = 3時(shí)使用k_均值聚類分析產(chǎn)生的聚類以尋找與年齡，性別和病理狀態(tài)(哮喘、鼻炎等)存在、其持久性和/或嚴(yán)重程度，發(fā)作年齡等的相關(guān)性。在SPSS軟件內(nèi)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)，如皮爾遜(Pearson' s) χ 2檢驗(yàn)和Kruskall-Wallis非參數(shù)檢驗(yàn)，并且制作Excel以調(diào)查在聚類中是否病理狀態(tài)的頻率是否有顯著差異以及每個(gè)聚類是否與作為整體的研究群體有顯著差異。聚類分析根據(jù)血清反應(yīng)性特征譜的相似性，我們使用k_均值聚類分析將血清分成明顯的·聚類。k_均值算法是一種無監(jiān)督迭代算法，其將對(duì)象分配位固定的用戶定義數(shù)目(k)的聚類，使得聚類內(nèi)部相似但是與外部不相似。為了定義血清之間的距離，使用歐幾里得距離(Euclidean distance)相似性度量。進(jìn)行數(shù)次迭代以盡可能減小每個(gè)聚類內(nèi)距離的總和以及通過收斂提供最佳的聚類分析解決方案。這個(gè)分析顯示在算法的10000次迭代內(nèi)實(shí)現(xiàn)了收斂至最佳的解決方案。應(yīng)用具有不同k值(I至14和20)的多個(gè)統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)，以確定產(chǎn)生彼此顯著不同的聚類的劃分。它們包括(I)輪廓圖驗(yàn)證法(Silhouette Validation method)將輪廓圖(silhouette)的概念定義為聚類緊密度和隔離度的指標(biāo)。良好的劃分過程導(dǎo)致聚類緊密(即每個(gè)聚類內(nèi)的對(duì)象彼此接近)并且良好的分離(即聚類彼此遠(yuǎn)離)，而糟糕的劃分產(chǎn)生彼此太接近(接近到它們可能會(huì)部分重疊的程度)的聚類并且聚類內(nèi)的對(duì)象可能較分散，從而使得難以將一些樣品分配到特定的聚類。對(duì)于第i個(gè)對(duì)象的輪廓圖的數(shù)學(xué)模型，S(i)為“，其中a(i)是在同一聚類中第i個(gè)對(duì)象相對(duì)于全部其他對(duì)象的平均不相似性；b(i)是第i個(gè)對(duì)象相對(duì)于另一個(gè)最接近的聚類中全部對(duì)象的最小平均不相似性。S(i)為-1(錯(cuò)誤分類的對(duì)象)至1(對(duì)象的最佳劃分結(jié)果)。全部聚類對(duì)象的S(i)的算術(shù)平均數(shù)提供了整個(gè)聚類過程的整體性能。指數(shù)越接近1，聚類結(jié)果越好。(2) Dunni s有效性指數(shù)。與輪廓圖法類似，這個(gè)技術(shù)也是基于良好劃分產(chǎn)生緊密的和良好分離的聚類的概念。模擬此類屬性的指數(shù)，Dunn' s有效性指數(shù)，被定義為
'1H- ' +，其中d(ci、cj)是聚類ci和cj之間的距離(聚類間距離)；d’ (ck)是聚類ck
的聚類內(nèi)距離，η是聚類的數(shù)目。在良好的劃分處理中，聚類間的距離是最大的(聚類之間的最大分離)，而聚類內(nèi)的距離是最小的(聚類內(nèi)的最大緊密)。D越高，聚類結(jié)果越好。(3)Davies-Bouldin有效性指數(shù)。另外通過DB指數(shù)來獲得緊密度和隔離度的同一
概念，所述DB指數(shù)被定義為’ ·%(- ；, I5其中η是聚類數(shù)目，Sn是屬于聚類的所有對(duì)象到
其聚類中心的平均距離(緊密度的度量)和S(Qi;Qp是聚類中心之間的距離(隔離度的度量)。如果聚類緊密且彼此遠(yuǎn)離，那么DB很小(良好的聚類結(jié)果)。jj(4) C指數(shù)。C指數(shù)的定義如下·β= _7就單一聚類來說，假設(shè)其所有對(duì)象組
ijIBm
織成對(duì)。假設(shè)在給定的聚類中有I對(duì)。那么S是那些I對(duì)的距離的總和。這可被認(rèn)為是該聚類緊密度的度量。就整個(gè)對(duì)象的集合(即所有聚類)來說，通過在所有可能的對(duì)中(即聚類內(nèi)以及聚類間二者)取可見的I最小距離來計(jì)算另一個(gè)距離總和Smin。類似地，將所有對(duì)中I最大距離的總和計(jì)算為smax。根據(jù)此定義，小的C值是良好聚類結(jié)果的指標(biāo)。(5)分離指數(shù)。這個(gè)技術(shù)是基于以下假設(shè)，如果對(duì)象隸屬于某聚類，那么其最近的鄰居也可能隸屬于同一聚類。在良好的聚類結(jié)果中這個(gè)性質(zhì)應(yīng)被最大化。為了在數(shù)學(xué)上獲取這個(gè)概念，引入了下列表達(dá)其中Xi是第i個(gè)對(duì)象，Vk (Xi)是\的最接近的鄰居的一部分，已被正確地分配到同一聚類，以及η是數(shù)據(jù)集中對(duì)象的總數(shù)。對(duì)于良好的聚類結(jié)果，每個(gè)聚類中每個(gè)對(duì)象具有高的Ik值是理想的。對(duì)于每個(gè)個(gè)體，我們得到了針對(duì)103種獨(dú)特的變應(yīng)原的IgE反應(yīng)性特征譜，這些變應(yīng)原選自歐洲中南部最常見與特應(yīng)性疾病相關(guān)聯(lián)的那些。在分類得分和所識(shí)別的變應(yīng)原的組合方面，個(gè)體特征譜的分析顯示出很高的IgE識(shí)別模式多樣性水平。極少數(shù)的特征譜是相同的，并且許多在其他方面健康的個(gè)體顯示出針對(duì)許多變應(yīng)原的出人意料復(fù)雜的模式。這一多樣性有可能反映了變應(yīng)原暴露與研究群體遺傳多樣性方面的差異。為了鑒定在IgE血清反應(yīng)性方面顯示出相似性的組，按照我們通過實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證使得聚類間相似性和聚類內(nèi)差異性最大化的設(shè)置，我們使用k-均值聚類分析來處理特征譜。每個(gè)聚類的IgE反應(yīng)性特征譜或節(jié)點(diǎn)在圖5a、5b和5c中所示。這個(gè)分析產(chǎn)生了 3個(gè)聚類，其在所識(shí)別的變應(yīng)原的組合以及受不同特應(yīng)性疾病(包括哮喘、鼻炎和結(jié)膜炎)影響的個(gè)體比例方面彼此有顯著差異。特別地，哮喘的個(gè)體貢獻(xiàn)了聚類I反應(yīng)性特征譜的83%。與研究群體中哮喘的個(gè)體的那些百分比相比，這個(gè)百分比顯示了非常高的統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性差異(P< 1E-8)(表 3)。有意思的是，盡管聚類O和聚類2在哮喘的和非哮喘的個(gè)體比例上不顯示顯著性差異，但是它們的組成分析證明了，與聚類I相反，它們富含同一家族核心的成員。我們認(rèn)為，聚類O和2的組成反映了家族成員暴露于包含在微陣列中的常見變應(yīng)原集合。盡管這些變應(yīng)原具有強(qiáng)大致敏能力，但是它們與哮喘無關(guān)，而是貢獻(xiàn)于形成反應(yīng)性特征譜，因此可掩蓋額外的相關(guān)性。鑒定哮喘相關(guān)的變應(yīng)原通過使用Mann-Whitney檢驗(yàn)比較哮喘的和非哮喘個(gè)體針對(duì)每個(gè)變應(yīng)原的反應(yīng)性，以鑒定在兩個(gè)組中顯示最顯著差異的那些變應(yīng)原。研究樣品滿足下列要求以應(yīng)用Mann-Whitney檢驗(yàn)i)哮喘的和非哮喘的組被認(rèn)為是獨(dú)立的；ii)血清反應(yīng)性值可被認(rèn)為是定序型隨機(jī)變量；iii)有足夠數(shù)目的可比較案例。另外，這個(gè)檢驗(yàn)不需要特定的值的分布(例如高斯分布(Gaussian))并且可使用具有不同個(gè)體數(shù)目的兩組(但是相似性給出了較好的執(zhí)行)來進(jìn)行。數(shù)據(jù)分析根據(jù)所指?jìng)€(gè)體的哮喘狀況，在輸入文件中標(biāo)記每個(gè)變應(yīng)原的反應(yīng)性數(shù)據(jù)。哮喘的(對(duì)應(yīng)于標(biāo)記“2”)，非哮喘的(對(duì)應(yīng)于標(biāo)記“I”)。從文件中手動(dòng)刪除對(duì)應(yīng)于具有未證實(shí)的哮喘臨床狀況之個(gè)體的血清(5. 16% )。在排除未證實(shí)的診斷的個(gè)體之后，用于該分析的血清總數(shù)為827。所存在的變應(yīng)原的起始數(shù)目為103。每種變應(yīng)原的反應(yīng)性值為O至5(微陣列記錄的分類得分)。使用SPSS，在進(jìn)行分析之前，將數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換成定序型數(shù)據(jù)(ordinal)。這個(gè)分析產(chǎn)生了 51種變應(yīng)原的列表(表4)，其被用以建立使用k-均值進(jìn)行聚類分析的新的反應(yīng)性特征譜的集合。節(jié)點(diǎn)3、4和5的反應(yīng)性特征譜分別在圖6a、b和c中所示。這些新的聚類顯示了一些有意思且新的特征。在IgE識(shí)別模式和血清組成方面，聚類4與聚類I非常相似，但是在哮喘的個(gè)體百分比上顯示出進(jìn)一步增加至88%以及統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性進(jìn)一步增加。兩個(gè)剩余的聚類也在其組成上顯示出特別顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。聚類3富含非哮喘個(gè)體(69% )，而聚類5含有高百分比的哮喘患者(82% )。聚類中哮喘和結(jié)膜炎(但濕疹并非如此)的分布非常接近地反映了哮喘的分布，其與其他觀察結(jié)果(建立了這些特應(yīng)性疾病中的關(guān)聯(lián))一致。如預(yù)期地，我們沒有觀察到在聚類3、4和5中富含同一家族核心的成員，從而表明相應(yīng)的特征譜與哮喘臨床狀況而不是與接觸變應(yīng)原密切相關(guān)。包含最高比例的哮喘的個(gè)體的兩個(gè)聚類(聚類4和5)具有重疊的IgE識(shí)別特征譜的特征。聚類4的譜顯示了針對(duì)9個(gè)另外的主要來自食物和禾本科的變應(yīng)原的特異性反應(yīng)性。值得注意地，聚類4而不是聚類5顯示了與哮喘嚴(yán)重程度的顯著相關(guān)性，從而揭示一方面的疾病嚴(yán) 重程度與另一方面的IgE應(yīng)答復(fù)雜性和特異性之間的令人意外的相關(guān)性。其他數(shù)據(jù)存在于在圖7a和b中。我們的數(shù)據(jù)證明了哮喘與針對(duì)單一變應(yīng)原的IgE抗體應(yīng)答之間的相關(guān)性顯著低估了針對(duì)變應(yīng)原庫(kù)的個(gè)體反應(yīng)性的內(nèi)在相似性和差異性，這可以與理解疾病的原因、嚴(yán)重程度和進(jìn)展有關(guān)。這也解釋了為什么抗體應(yīng)答與疾病之間的關(guān)聯(lián)性為何難以鑒定。與此相反，通過分析針對(duì)大的變應(yīng)原集合的IgE血清反應(yīng)性特征譜，我們可證明，哮喘的和非哮喘的個(gè)體在所識(shí)別的變應(yīng)原數(shù)目和分類方面具有顯著差異。人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)使用具有ANN專用模塊的專業(yè)軟件應(yīng)用程序，如RBF(徑向基函數(shù)算法(RadialBasis Function Algorithm) -SPSS 17. 0),來開發(fā)分類器。RBF是設(shè)計(jì)用于在SPSS統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件應(yīng)用程序內(nèi)進(jìn)行有監(jiān)督訓(xùn)練，SPSS提供了一整套強(qiáng)大的函數(shù)用于訓(xùn)練專用于分類任務(wù)的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)，例如針對(duì)我們的情況。通過使用作為輸入數(shù)據(jù)的包含51種變應(yīng)原和827個(gè)個(gè)體的血清反應(yīng)性特征譜的樣品數(shù)據(jù)集合來完成神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)分析。在該樣品中，485個(gè)是哮喘陽(yáng)性個(gè)體，342個(gè)是陰性。為了評(píng)估通過減少分類器所考慮的變應(yīng)原數(shù)目而實(shí)現(xiàn)的實(shí)際改善(通過Mann-Whitney檢驗(yàn)的方法，如之前所示例的)，對(duì)整個(gè)變應(yīng)原集合訓(xùn)練分離的RBF，然后其結(jié)果與對(duì)過濾的集合進(jìn)行的RBF進(jìn)行比較。樣品首先是隨機(jī)的(參見樣品章節(jié)的處理)并且所使用的訓(xùn)練樣品的大小為整個(gè)群體的約60%，留下剩余的個(gè)體用于驗(yàn)證目的(10%測(cè)試，以及30%保留(holdout))。使用隨機(jī)化標(biāo)準(zhǔn)選擇訓(xùn)練子集，確保樣品相對(duì)于整個(gè)群體的代表性。這是為了確保RBF復(fù)制了代表全部群體的行為。全部有監(jiān)督訓(xùn)練過程重復(fù)10次，每次都在一個(gè)新的之前未訓(xùn)練過的網(wǎng)絡(luò)上進(jìn)行，而且每次用初始群體的一個(gè)新的隨機(jī)化子集。這是為了觀察可與訓(xùn)練樣品代表性中的變異性相關(guān)聯(lián)的的任何執(zhí)行中的變異性。RBF網(wǎng)絡(luò)中有3個(gè)層(輸入層、RBF層和輸出層)。有許多類型的徑向基函數(shù)；我們使用歸一化的RBF(NRBF)。為了評(píng)估神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的真實(shí)效率，神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)運(yùn)行不同的10次。網(wǎng)絡(luò)的總效率為這10次不同試驗(yàn)的平均值。哮喘被視為因變量，分類得分變應(yīng)原為協(xié)變量。所使用的案例劃分的具體相對(duì)數(shù)目由以下組成訓(xùn)練6(60%)，試驗(yàn)1(10%)和維持3(30%)。圖8示例了 RBF網(wǎng)絡(luò)的圖示，其分別由3層組成輸入層(框I 51)、隱層(圈I 8)和輸出層(在黑框中的哮喘分類)。樣本數(shù)據(jù)的處理為了避免樣本定向偏差，首先將血清隨機(jī)化。通過在Matlab中使用RAND變量實(shí)現(xiàn)隨機(jī)化，得到隨機(jī)數(shù)目I至827，并且用其標(biāo)記每個(gè)血清。之后使用字母順序?qū)ψ畛醯难屙樞蛑匦氯?。使用的設(shè)置為了評(píng)估神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的真實(shí)效率，神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)運(yùn)行不同的10次。網(wǎng)絡(luò)的總效率為這些10次不同試驗(yàn)的平均值。
分析、神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)、徑向基函數(shù)變量因變量哮喘協(xié)變量C2、D01、D02、D03、D70、D71、D72、D73、E01、E03、E081、E082、F04、F16、F25、F35、F49、F84、F95、G01、G02、G03、G04、G05、G06、G08、G12、G14、G15、G18、106、K87、MOUM03、M04、M05、M06、T04、T06、T07、T09、T14、T901、W01、W06、X902、X903、X904、X905、X907、X910協(xié)變量的重標(biāo)度無劃分指定相對(duì)案例數(shù)目訓(xùn)練6(60% )，試驗(yàn) 1(10% )和維持 3(30% )結(jié)構(gòu)隱層中單元數(shù)目激活發(fā)現(xiàn)范圍內(nèi)最佳的單元數(shù)目范圍激活自動(dòng)計(jì)算范圍隱層的激活功能標(biāo)準(zhǔn)化徑向基函數(shù)隱藏單元中的重疊自動(dòng)計(jì)算重疊的量以使得輸出網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)選擇說明、圖表、突觸權(quán)重網(wǎng)絡(luò)性能選擇模型概要、分類結(jié)果、Roc曲線、由所觀察到的圖表的預(yù)測(cè)激活案例的處理概要存儲(chǔ)存儲(chǔ)每個(gè)因變量的預(yù)測(cè)值或種類存儲(chǔ)每個(gè)因變量的預(yù)測(cè)假概率
存儲(chǔ)的變量的名稱選擇自動(dòng)產(chǎn)生的唯一名稱完成輸出激活將突觸權(quán)重評(píng)估輸出至XML文件選項(xiàng) 用戶——遺漏值選擇排除結(jié)果包含103種最常見變應(yīng)原的微陣列免疫測(cè)定用以研究屬于283個(gè)家族的872個(gè)個(gè)體的IgE血清反應(yīng)性，其中所有的子女(I至3個(gè))都受哮喘影響。參與這個(gè)研究的個(gè)體包括父母和所有子女(大部分兒童小于27歲(75%的兒童小于27歲))。從每個(gè)個(gè)體中收集關(guān)于哮喘(發(fā)作年齡、嚴(yán)重程度和持續(xù)性)以及伴隨存在的其他特應(yīng)性疾病的詳細(xì)臨床歷史的信息。對(duì)于每個(gè)血清樣品，對(duì)免疫測(cè)定進(jìn)行校準(zhǔn)以測(cè)量與每個(gè)排成陣列的抗原相結(jié)合的特異性IgE的濃度(O. 35IU/ml至100IU/ml)。將以IU/ml計(jì)的反應(yīng)性值轉(zhuǎn)化為使用經(jīng)驗(yàn)證的O 5級(jí)的分類得分。這個(gè)方法產(chǎn)生了 872個(gè)獨(dú)特的IgE反應(yīng)性特征譜和超過90，000個(gè)抗體-抗原測(cè)定。對(duì)于每份血清，產(chǎn)生了與IgE分類得分(O至5)相匹配的針對(duì)排成陣列的變應(yīng)原的顏色編碼的數(shù)字特征譜(從黑至白)(圖5a、b、c和圖6a、b和c)。血清具有顯著不同的針對(duì)排成陣列的變應(yīng)原的IgE反應(yīng)性。許多收集自非哮喘雙親或哮喘兒童的血清與超過40種變應(yīng)原發(fā)生反應(yīng)，但是哮喘個(gè)體顯示出平均最高數(shù)目的個(gè)體變應(yīng)原抗體反應(yīng)。為了研究反應(yīng)性特征譜的結(jié)構(gòu)，我們使用k-均值聚類分析，通常用以鑒定微陣列數(shù)據(jù)內(nèi)的組結(jié)構(gòu)的劃分方法。聚類算法用不同的k的值(3至14和20)進(jìn)行，以使特征譜分裂成越來越多的聚類。使用5個(gè)特定的指標(biāo)(Silhouette指數(shù)、Dunn指數(shù)、Davies Bouldin、C指數(shù)和分離指數(shù))進(jìn)行的統(tǒng)計(jì)分析，用Machaon計(jì)算,表明k = 3是通過將特征譜排列成3個(gè)聚類使得聚類內(nèi)的相似性和聚類間的差異性最大化的參數(shù)。為了尋找IgE反應(yīng)性特征譜和哮喘之間的關(guān)聯(lián)，我們研究了在k = 3時(shí)產(chǎn)生的聚類在哮喘的和非哮喘個(gè)體的頻率以及其他特征和病理狀態(tài)(年齡、性別、結(jié)膜炎、濕疹、鼻炎、哮喘持久性和嚴(yán)重程度)的分布上是否有顯著差異。許多獨(dú)立的統(tǒng)計(jì)分析(皮爾遜χ2檢驗(yàn)和Kruskal I-Wal I is檢驗(yàn))用以評(píng)估在聚類之間以及每個(gè)聚類與整個(gè)樣品之間的每個(gè)特征和病理狀態(tài)的頻率是否具有顯著差異。特別地，χ2檢驗(yàn)用于分析二元屬性(即，哮喘的對(duì)非哮喘的)，而Kruskal I-Wal I is檢驗(yàn)在離散數(shù)字變量上進(jìn)行(如哮喘發(fā)作的年齡)。這個(gè)分析結(jié)果表明，3個(gè)聚類在哮喘、結(jié)膜炎、濕疹、鼻炎和性別的頻率上具有顯著差異。最突出地，聚類I比其他兩個(gè)聚類和整個(gè)研究樣品顯示出驚人的(83% )顯著更高的比例(χ 2 = 33. 480，P = 2. 16E-08)。在對(duì)多個(gè)比較進(jìn)行Bonferroni校正后沒有影響統(tǒng)計(jì)顯著性。類似地，顯著地關(guān)聯(lián)也可通過聚類I的結(jié)膜炎和鼻炎觀察到。譜的劃分也強(qiáng)調(diào)了聚類中家族核心的有趣分布聚類O和2富含同一家族的成員并且顯示出哮喘的和非哮喘個(gè)體的相似百分比，聚類I包含顯著更高比例的兒童，而雙親非常少。這些發(fā)現(xiàn)表明，分配到聚類O或2的同一家族的成員具有與哮喘無關(guān)的類似IgE識(shí)別模式，這可能是因?yàn)楸┞队谂懦申嚵械淖儜?yīng)原特定集合所產(chǎn)生的占優(yōu)勢(shì)的作用。與此相反，家族成員的分離沒有在聚類I中發(fā)現(xiàn)，這是由于相應(yīng)的IgE血清反應(yīng)性特征譜與所述疾病緊密相關(guān)。在對(duì)研究群體的變應(yīng)原暴露沒有詳細(xì)了解并且對(duì)于引發(fā)哮喘相關(guān)IgE應(yīng)答的特定變應(yīng)原之作用沒有任何事先猜測(cè)的情況下，對(duì)陣列進(jìn)行了設(shè)計(jì)。因此，一些變應(yīng)原很少被識(shí)別而另一些在哮喘的和非哮喘的個(gè)體中顯示出類似的反應(yīng)性百分比，這并不令人驚訝。針對(duì)這些變應(yīng)原的反應(yīng)性為所述特征譜的形成提供了貢獻(xiàn)，并且可代表掩蓋一些相關(guān)性的“背景噪聲”的來源。為了解決這個(gè)問題，我們?cè)噲D通過以下方式鑒定在陣列中對(duì)于哮喘的相關(guān)性作出最大貢獻(xiàn)的變異性，即通過用閾值P < O. 05的曼-惠特尼U檢驗(yàn)(Mann-Whitney U test)過濾所得結(jié)果，以摒除在哮喘和非哮喘個(gè)體之間的IgE反應(yīng)性方面 沒有顯示出差異的那些變應(yīng)原。該分析產(chǎn)生了 51個(gè)相關(guān)變應(yīng)原的列表，其用以產(chǎn)生新的特征譜并在k = 3時(shí)進(jìn)行聚類關(guān)聯(lián)分析。對(duì)新的聚類(聚類3、4和5)進(jìn)行的相關(guān)性研究揭示了 IgE識(shí)別特征譜與哮喘之間相關(guān)性的進(jìn)一步增強(qiáng)。聚類4在其結(jié)構(gòu)和組成方面顯示了與聚類I高的相似性，但是與哮喘相關(guān)性的統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性以及相應(yīng)的反應(yīng)性特征譜進(jìn)一步增加(X 2 = 35. 145，P=9. 18E-09)(圖2B)。其他兩個(gè)聚類與用整個(gè)變應(yīng)原集合所產(chǎn)生的那些有顯著差異。這次，沒有在聚類I中所包含的大多數(shù)哮喘的個(gè)體與聚類5的反應(yīng)性特征譜顯著相關(guān)(χ2=22.958，P = 4.97E-06)，而聚類2包含了大多數(shù)非哮喘的個(gè)體(χ2 = 31. 172，p =
7.08E-08)。甚至在對(duì)多個(gè)比較進(jìn)行Bonferroni校正后，哮喘的和非哮喘個(gè)體分布的差異仍保持高度的顯著性。與其他聚類相比，在聚類I中觀察到針對(duì)結(jié)膜炎和鼻炎的強(qiáng)相關(guān)性。值得注意的是，由過濾的變應(yīng)原集合所產(chǎn)生的聚類沒有顯示出家族成員的共分離。有趣地，兩個(gè)獨(dú)特的反應(yīng)性特征譜4和5與哮喘顯著相關(guān)。這兩個(gè)特征譜具有共同的IgE反應(yīng)性模式，51種變應(yīng)原中的20種被這兩個(gè)聚類的血清所識(shí)別，而聚類4的血清還與主要來自食物和禾本科的9種變應(yīng)原(變應(yīng)原19 23和17 30)發(fā)生反應(yīng)。值得注意的是，與所有其他的聚類和群體研究樣本相比，聚類4顯示了顯著更高比例的被診斷有嚴(yán)重哮喘的個(gè)體(嚴(yán)重程度分類3和4)。使用參考譜的預(yù)測(cè)將一些聚類的反應(yīng)性特征譜與哮喘相關(guān)聯(lián)的異常強(qiáng)的相關(guān)性促使我們生成了人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)(ANN)分類器，其設(shè)計(jì)用于根據(jù)哮喘的和非哮喘個(gè)體的反應(yīng)性特征譜來區(qū)分二者。這是通過使用徑向基函數(shù)(RBF)而開發(fā)的，其支持通過樣品教導(dǎo)(teaching-by-example)的訓(xùn)練方法(又稱監(jiān)督式訓(xùn)練/監(jiān)督式學(xué)習(xí))。在監(jiān)督式訓(xùn)練中所使用的每個(gè)特征譜樣品包含關(guān)于51種經(jīng)過濾的變應(yīng)原的反應(yīng)值和關(guān)于哮喘狀況的個(gè)體的健康狀況的信息(期望的分類結(jié)果)。用于訓(xùn)練RBF(訓(xùn)練集合)的特征譜由整個(gè)研究血清樣品的60%組成。另外10%的譜被保留用以評(píng)估在訓(xùn)練期間(測(cè)試集合)的預(yù)測(cè)精度。留下剩余的個(gè)體(即整體群體的30% )并用于評(píng)估在10次獨(dú)立運(yùn)行中網(wǎng)絡(luò)的性能(保留集合(holdout set))。ANN將82%哮喘的患者正確地分為“哮喘的”，約72%非哮喘患者分為“非哮喘”。RBF的整體性能符合特征譜相關(guān)性分析由RBF分類器將哮喘的患者正確的識(shí)別為哮喘的平均百分比接近在聚類4和5中所存在的哮喘的患者之組合的百分比。圖9a顯示了 ANN通過預(yù)測(cè)-觀察性能圖?？蚓€圖代表了 RFB輸出種類的預(yù)測(cè)的假概率(predicted-pseudo-probability);對(duì)合并的訓(xùn)練和測(cè)試樣品，針對(duì)已知臨床狀況的哮喘⑴哮喘(2)，繪制哮喘的(灰色)和非哮喘的(白色)。圖9b :針對(duì)合并的訓(xùn)練和測(cè)試樣品計(jì)算ROC曲線，其中哮喘(黑色)、非哮喘(灰色)。圖10示例了 ANN哮喘分類器一致性性能。針對(duì)選擇的個(gè)體的已知臨床狀況，基于皮爾遜X2檢驗(yàn)評(píng)估保留樣品的ANN預(yù)測(cè)的哮喘狀況。構(gòu)建來自哮喘患者的組合文庫(kù)為了分離和表征對(duì)與哮喘、結(jié)膜炎或鼻炎相關(guān)的抗原具有特異性的人IgE抗體， 在本研究中構(gòu)建來自哮喘的患者的IgE組合文庫(kù)。外周血單個(gè)核細(xì)胞從150ml肝素化的血液樣品(獲自患者)中獲得。簡(jiǎn)要地，通過菲克帕克(FicolΙ-Paque)密度梯度離心制備細(xì)胞。通過Davis等，1986的異硫氰酸胍法制備RNA。進(jìn)行數(shù)個(gè)獨(dú)立的cDNA合成以及使用RNA PCR試劑盒(Perkin-Elmer)進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)。簡(jiǎn)言之，方案與Steinberger等，1996所使用的相同。將總RNA(20 60 μ g)與對(duì)ε 鏈的恒定區(qū)(Cl，5’ -GCT ACT AGT TTT GTT GTC GACCCA GTC;C2，5’ -CGA CTG TAA ACTAGT CAC GGT GGG CGG GGT G)和對(duì)輕鏈(Ckla，5，_GCG CCG TCT AGA ACT AAC ACT CTC CCCTGT TGAAGC TCT TTG TGA CGG GCA AG ;Ckld，5’ -GCG CCG TCT AGA ATT AAC ACTCTC CCCTGT TGA AGC TCT TTG TGA CGG GCG AAC TCA G;C2，5’ -CGC CGT CTA GAA TTA TGA ACATTC TGT AGG)特異的10 20pmol寡核苷酸引物混合，在65°C加熱5分鐘，之后根據(jù)供應(yīng)商的方案用于2小時(shí)的逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。之后,將逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)和對(duì)重鏈Y,5' -CAC TCC CAG GTG CAG CTG CTC GAG TCTGG ；V,5/ -GTC CTG TCC CAGGTC AAC TTA CTC GAG TCT GG ；V,5/ -GTC CAGGTG GAG GTG CAG CTG CTC GAG TCT GG ；V,5' -GTC CTG TCC CAG GTGCAG CTG CTC GAG TCG GG ；V,5/ -GTC TGT GCC GAG GTG CAGCTG CTCGAG TCT GG ；V,5/ -GTC CTG TCA CAG GTA CAG CTG CTC GAG TCA GG ；V,5/ -AGGTG CAG CTG CTC GAG TCT GG ；V,5/ -CAG GTG CAG CTG CTC GAG TCGGG 和 κ-或-鏈(Vkl,5/ -GAG CCG CAC GAG CCC GAG CTC CAG ATGACC CAG TCT CC ；Vkla,5/ -GAC ATC GAGCTC ACC CAG TCT CCA ；Vk2a,5/ -GAG CCG CAC GAG CCC GAG CTC GTG ATG AC(C/T)CAG TCTCC ；Vk3a,5/ -GAA ATT GAG CTC ACG CAG TCT CCA ；Vk3,5/ -GAG CCG CAC GAG CCC GAGCTCGTG(A/T)TG AC(A/G)CAG TCT CC;VI，5' -AAT TTT GAG CTC ACT CAGCCC CAC ；V3,5/ -TCTGTG GAG CTC CAG CCG CCC TCA GTG)的可變區(qū)特異的寡核苷酸引物用于100 μ I下列條件的熱啟動(dòng)PCR擴(kuò)增一個(gè)循環(huán)的95°C變性5分鐘、54°C退火50秒和72°C延伸50秒，然后40個(gè)循環(huán)的92°C變性I分鐘、54°C退火50秒和72°C延伸50秒。使用每個(gè)恒定區(qū)和可變區(qū)引物的組合完成PCR反應(yīng)并合并以構(gòu)建文庫(kù)。根據(jù)(Kabat等，1987)合成ε鏈和輕鏈的寡核苷酸引物的序列。根據(jù)Persson等(1991)和Kang等(1991b)合成對(duì)重鏈的可變區(qū)和κ -或-鏈的可變和恒定區(qū)特異的寡核苷酸引物。構(gòu)建IgE組合文庫(kù)分別對(duì)編碼IgE Fd和輕鏈的PCR產(chǎn)物進(jìn)行乙醇沉淀、凝膠純化并且用Spe I/XhOI和Sac I/Xba I (Boehringer Mannheim)酶切。經(jīng)消化的PCR產(chǎn)物經(jīng)乙醇沉淀并經(jīng)凝膠純化。為構(gòu)建IgE組合文庫(kù),首先將輕鏈連接至pComb3H的Sac I/Xba I位點(diǎn)并轉(zhuǎn)化至大腸桿菌(Escherichia coli)XL-IBlue以產(chǎn)生3X IO7獨(dú)立克隆的輕鏈文庫(kù)。之后分離包含輕鏈文庫(kù)的質(zhì)粒DNA，用Spe I/XhOI酶切以釋放重鏈填充片段，并經(jīng)凝膠純化。將編碼IgE Fd的cDNA連接至輕鏈質(zhì)粒，產(chǎn)生了 5 X IO7獨(dú)立初級(jí)克隆的輕鏈文庫(kù)。
根據(jù)Carlos F. Barbas 和 Dennis R. Burton 的 Cold Spring Harbor Course onMonoclonal Antibodies from Combinatorial Libraries進(jìn)行用于構(gòu)建IgE組合文庫(kù)的分子生物學(xué)操作。分離表達(dá)具有與哮喘相關(guān)的抗原之特異性的Fab片段的噬菌體克隆用展現(xiàn)與哮喘特征譜有相關(guān)性的51種變應(yīng)原制品(O. 2 μ g/孔)分別包被ELISA板(Costar 3690, Cambridge, MA)。孔用含有3% (w/v)牛血清白蛋白的磷酸鹽緩沖鹽水封閉。將新鮮制備的噬菌體懸液(大約10個(gè)噬斑形成單位)添加至每個(gè)孔，然后在室溫下孵育2小時(shí)。將噬菌體移出，然后將孔用含有O. 05% (v/v)吐溫20的Tris緩沖鹽水洗滌一次。噬菌體用含有l(wèi)mg/ml牛血清白蛋白的O. IM甘氨酸-HCI，pH 2. 2洗脫，然后將洗脫液用2M Tris中和。之后，用該洗脫的噬菌體侵染新鮮生長(zhǎng)的大腸桿菌XL-lBlue。一份用以確定侵染的大腸桿菌的滴度。將培養(yǎng)物在含有50 μ g/ml氨芐青霉素和10 μ g/ml四環(huán)素的SB培養(yǎng)基中生長(zhǎng)。通過使用輔助噬菌體VCS M13侵染，產(chǎn)生了絲狀噬菌體用于下一輪淘選。淘選重復(fù)四次。在隨后的淘選期間，對(duì)孔進(jìn)行額外地洗滌，之后通過ELISA分析各個(gè)克隆以產(chǎn)生抗原特異性Fab。編碼IgE Fd和輕鏈的cDNA的序列分析測(cè)序前，通過ELISA檢查克隆的抗原特異性Fab生產(chǎn)以及通過限制性分析檢查克隆中編碼重鏈片段和輕鏈的cDNA的正確插入。使用Qiagen tips (Hilden, Germany)從重組大腸桿菌XL-IBlue中制備質(zhì)粒DNA。將兩條DNA鏈進(jìn)行測(cè)序。生產(chǎn)具有抗原特異性的可溶性重組Fab片段為了生產(chǎn)可溶性Fab片段，在第五輪淘選之后，從數(shù)個(gè)獨(dú)立的克隆分離DNA。將質(zhì)粒DNA用Spe I和Nhe I消化、回收自I %瓊脂糖凝膠、自連并再轉(zhuǎn)化至大腸桿菌XL-lBlue。包含正確再連接的質(zhì)粒的大腸桿菌用以生產(chǎn)可溶性Fab片段。簡(jiǎn)言之，將單克隆接種至含有20mM MgCl和50 μ g/ml羧芐青霉素的SB培養(yǎng)基中。將培養(yǎng)物在37°C培養(yǎng)6小時(shí)，然后通過添加異丙基-I-硫代-3-D-吡喃半乳糖苷至終濃度為4mM進(jìn)行誘導(dǎo)。之后將經(jīng)誘導(dǎo)的大腸桿菌在30°C培養(yǎng)過夜，然后通過在4°C以3000Xg離心10分鐘收集細(xì)胞。大腸桿菌上清液用于ELISA測(cè)定、免疫印跡和親和純化抗原特異性Fab0通過對(duì)經(jīng)純化的抗原的親和性純化抗原特異性IgE
根據(jù)制造商說明書,將2. 5mg經(jīng)純化的抗原偶聯(lián)至AminoLinkO柱子(Pierce)。將大約200ml包含抗原特異性Fab的大腸桿菌上清液以20，000 X g離心，然后通過折疊濾器(Macherey-NageI, Duren, Germany)過濾以從溶液中移除沉淀。
將上清液于4°C施加于該柱子，之后用磷酸鹽緩沖鹽水徹底地洗滌柱子直到在洗滌級(jí)分中通過光度法在280nm檢測(cè)不到蛋白質(zhì)。用IOOmM甘氨酸-HCl，pH 2. 7洗脫結(jié)合的抗原特異性Fab，然后用3M Tris, pH 9中和。
權(quán)利要求
1.一種鑒定與哮喘、結(jié)膜炎或鼻炎相關(guān)的抗原的方法，其包括 (a)測(cè)定分離自無癥狀對(duì)象組的多個(gè)第一樣品中針對(duì)多種抗原的IgE反應(yīng)性水平； (b)測(cè)定分離自以具有哮喘、結(jié)膜炎或鼻炎為特征的對(duì)象組的多個(gè)第二樣品中針對(duì)多種抗原的IgE反應(yīng)性水平； (c)鑒定在對(duì)象組之間顯示IgE反應(yīng)性水平顯著差異的所述多種抗原的子集，其中針對(duì)所述子集的IgE反應(yīng)性水平與哮喘、結(jié)膜炎或鼻炎的臨床診斷相關(guān)。
2.根據(jù)權(quán)利要求I的方法，其中基本上同時(shí)測(cè)定每個(gè)個(gè)體樣品中的針對(duì)所述多種抗原的反應(yīng)性水平。
3.根據(jù)權(quán)利要求2的方法，其中所述第一和/或多個(gè)第二樣品包含30至800個(gè)樣品。
4.根據(jù)權(quán)利要求1、2或3的方法，其中所述多種抗原包含30至400種抗原。
5.根據(jù)權(quán)利要求4的方法，其中所述抗原選擇為在特定區(qū)域中最常見的抗原。
6.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其中通過將所述多種抗原與分離自所述對(duì)象組的血清相接觸以及使用抗IgE抗體測(cè)定與每種抗原結(jié)合的IgE的量來確定IgE反應(yīng)性水平。
7.根據(jù)權(quán)利要求6的方法，其中所述抗IgE抗體是帶標(biāo)記的抗體。
8.根據(jù)權(quán)利要求6的方法，其中所述抗IgE抗體是非標(biāo)記的并且使用帶標(biāo)記的抗體對(duì)其進(jìn)行檢測(cè)。
9.根據(jù)權(quán)利要求7或8的方法，其中所述帶標(biāo)記抗體包含熒光標(biāo)記。
10.根據(jù)權(quán)利要求9的方法，其中通過熒光檢測(cè)確定所述與每種抗原結(jié)合的IgE的量。
11.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其中所述多種抗原與至少一個(gè)具有多個(gè)地址的固體支持物結(jié)合，其中每個(gè)地址具有獨(dú)特的抗原布置于其上。
12.根據(jù)權(quán)利要求11的方法，其中所述固體支持物包含多個(gè)可分開鑒定的珠子。
13.根據(jù)權(quán)利要求11的方法，其中所述固體支持物是微陣列。
14.根據(jù)權(quán)利要求13的方法,其中所述抗原的點(diǎn)樣濃度為O.008mg/ml至3mg/ml。
15.一種評(píng)估對(duì)象是否已經(jīng)發(fā)生哮喘、結(jié)膜炎或鼻炎或者是否具有其發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)的方法，其包括 (a)測(cè)定分離自所述對(duì)象的樣品中針對(duì)生物標(biāo)志物集合的IgE反應(yīng)性水平； 其特征在于，所述生物標(biāo)志物是預(yù)先確定與哮喘、結(jié)膜炎或鼻炎的臨床診斷相關(guān)的抗原，并且其中針對(duì)生物標(biāo)志物集合中至少75%的IgE反應(yīng)性水平高于3. 51IU/ml表明所述對(duì)象可能發(fā)生或已經(jīng)發(fā)生哮喘、結(jié)膜炎或鼻炎。
16.根據(jù)權(quán)利要求15的方法，其中所述生物標(biāo)志物集合包含9至51種抗原。
17.根據(jù)權(quán)利要求16的方法，其中所述集合選自以下抗原C2、Dl、D2、D3、D70、D71、D72、D73、E1、E3、E81、E82、F4、F16、F25、F35、F49、F84、F95、G1、G2、G3、G4、G5、G6、G8、G12、G14、G15、G18、16、K87、Ml、M3、M4、M5、M6、T4、Τ6、Τ7、T9、Τ14、Τ901、Wl、W6、Χ902、Χ903、Χ904、Χ905、Χ907 和 Χ910。
18.根據(jù)權(quán)利要求15至17的方法，其中通過將所述生物標(biāo)志物集合與分離自所述對(duì)象的血清相接觸以及使用抗IgE抗體測(cè)定與每種抗原結(jié)合的IgE的量來確定IgE反應(yīng)性水平。
19.根據(jù)權(quán)利要求18的方法，其中所述抗IgE抗體是帶標(biāo)記的抗體。
20.根據(jù)權(quán)利要求18的方法，其中所述抗IgE抗體是未標(biāo)記的并且使用帶標(biāo)記的抗體對(duì)其進(jìn)行檢測(cè)。
21.根據(jù)權(quán)利要求19或20的方法，其中所述帶標(biāo)記的抗體包含熒光標(biāo)記。
22.根據(jù)權(quán)利要求21的方法，其中通過熒光檢測(cè)確定所述與每種抗原結(jié)合的IgE的量。
23.根據(jù)權(quán)利要求15至22中任一項(xiàng)的方法，其中所述抗原結(jié)合于固體支持物。
24.根據(jù)權(quán)利要求23中任一項(xiàng)的方法，其中所述固體支持物是微陣列。
25.根據(jù)權(quán)利要求24的方法,其中所述抗原的點(diǎn)樣濃度為O.008mg/ml至3mg/ml。
26.根據(jù)權(quán)利要求24的方法，其中基本上同時(shí)測(cè)量與所述生物標(biāo)志物集合中每種抗原所結(jié)合的IgE的量。
27.一種用于確定哮喘、結(jié)膜炎或鼻炎的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)或?qū)ζ渥鞒鲈\斷的抗原微陣列，其包含抗原F95、G1、G3、G4、G12、G14、G15和G18以及任選地一種或更多種選自以下的抗原C2、D1、D2、D3、D70、D71、D72、D73、E1、E3、E81、E82、F4、F16、F25、F35、F49、F84、G2、G5、G6、G8、16、K87、Ml、M3、M4、M5、M6、T4、Τ6、Τ7、T9、Τ14、Τ901、Wl、W6、Χ902、Χ903、Χ904、Χ905、Χ907和 Χ910。
28.—種試劑盒，其包含(i)抗原F95、G1、G3、G4、G12、G14、G15 和 G18 ； (ii)任選地一種或更多種以下的抗原C2、D1、D2、D3、D70、D71、D72、D73、E1、E3、E81、E82、F4、F16、F25、F35、F49、F84、G2、G5、G6、G8、16、K87、Ml、M3、M4、M5、M6、T4、T6、T7、T9、T14、T901、W1、W6、X902、X903、X904、X905、X907 和 Χ910 ； (iii)抗IgE抗體。
29.根據(jù)權(quán)利要求28的試劑盒，其在微陣列上包含抗原C2、Dl、D2、D3、D70、D71、D72、D73、E1、E3、E81、E82、F4、F16、F25、F35、F49、F84、F95、G1、G2、G3、G4、G5、G6、G8、G12、G14、G15、G18、I6、K87、M1、M3、M4、M5、M6、T4、T6、T7、T9、T14、T901、W1、W6、X902、X903、X904、X905、X907 和 X910。
30.根據(jù)權(quán)利要求15至26的方法、根據(jù)權(quán)利要求27的微陣列或根據(jù)權(quán)利要求28和29的試劑盒在用于評(píng)估對(duì)象是否已經(jīng)發(fā)生哮喘、結(jié)膜炎或鼻炎或是否具有其發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)中的用途。
全文摘要
本發(fā)明涉及用于評(píng)估對(duì)象是否已發(fā)生哮喘、結(jié)膜炎或鼻炎或者具有其發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)的方法。本發(fā)明還涉及用于此類方法的抗原集合，所述方法包括鑒定與哮喘、結(jié)膜炎或鼻炎相關(guān)的其他合適抗原。
文檔編號(hào)G01N33/68GK102893158SQ201180009850
公開日2013年1月23日 申請(qǐng)日期2011年2月16日 優(yōu)先權(quán)日2010年2月16日
發(fā)明者安德烈亞·克里桑蒂, 塔尼亞·多托里尼 申請(qǐng)人:微測(cè)試矩陣有限公司