促進造血損傷修復(fù)的藥物組合物的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及醫(yī)學領(lǐng)域，特別涉及一種促進造血損傷修復(fù)的藥物組合物，具體涉及 包含重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2 (bone morphogenetic protein，rhBMP-2)和人粒細胞刺激 因子（rhG-CSF)的組合物，用于促進造血損傷修復(fù)方面。
【背景技術(shù)】
[0002] 近年來，全球范圍內(nèi)由于環(huán)境污染、化學污染、電離輻射等因素所引發(fā)的惡性腫 瘤、急性放射病及各類血液病的發(fā)病率不斷提高，現(xiàn)階段臨床上主要采用放療和化療手段 治療腫瘤。骨髓抑制是放化療中最常見的毒副作用之一，但當機體受到致死劑量的射線照 射或者接受相當劑量的化療藥物后，會導(dǎo)致造血功能嚴重衰竭，甚至并發(fā)感染及出血等癥 狀，導(dǎo)致死亡，因此恢復(fù)和重建造血功能是造血損傷修復(fù)研宄的重中之重。
[0003] 機體造血重建分為兩個階段，即早期由造血祖細胞主導(dǎo)和晚期由造血干細胞主導(dǎo) 的造血功能的恢復(fù)。前者用來維持和提供移植前期外周血細胞和淋巴免疫細胞，后者的作 用是后期替代并維持永久性正常造血功能。因此通過相關(guān)藥物干預(yù)，同時刺激造血祖細胞 和造血干細胞功能的發(fā)揮，是加快造血損傷修復(fù)的關(guān)鍵。
[0004] 造血細胞因子能夠?qū)υ煅杉毎脑鲋澈头只鸬街匾饔?，在造血功能極度低 下的狀況下，應(yīng)用大劑量的造血細胞因子將有利于促進或加速造血功能的恢復(fù)或成熟血細 胞的生成。目前臨床上主要用集落刺激因子來促進造血功能的恢復(fù)。集落刺激因子（CSFs) 包括粒系集落刺激因子（G-CSF)、粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子（GM-CSF)、M-CSF等。其 中GM-CSF具有促進粒細胞-巨噬細胞集落生成的作用，主要用于腫瘤放射/化療后白細 胞減少的防治、骨髓衰竭病人的白細胞減少等，其常見的不良反應(yīng)有低血壓、發(fā)熱、惡心、水 月中、胸痛和骨痛。G-CSF主要作用是促進粒細胞生成，對造血細胞的生長和分化起介導(dǎo)作用， 具有刺激骨髓細胞增殖和成熟的生物學功能，1991年被批準用于臨床治療，與GM-CSF應(yīng)用 范圍相似，但副作用輕;M-CSF主要功能是通過調(diào)控單個核吞噬細胞，影響其存活、增殖和 分化，從而刺激造血。
[0005] 集落刺激因子雖然療效快，但價格昂貴，此外還存在一些臨床問題，如使用高劑量 會產(chǎn)生骨痛，并伴隨著發(fā)熱等不良反應(yīng)；一些腫瘤細胞，如白血病細胞具有CSF的正常受 體，用藥后可能通過提高宿主殘余腫瘤細胞的增殖，提高腫瘤的復(fù)發(fā)率。另外，由于CSF是 直接刺激無自我更新能力的造血祖細胞的增殖，導(dǎo)致造血祖細胞的耗竭，不利于長期的造 血功能的恢復(fù)，甚至導(dǎo)致骨髓儲備不足，同時，由于其作用穩(wěn)定性差，往往導(dǎo)致外周血及骨 髓象中充滿大量幼稚白細胞，使白細胞計數(shù)呈現(xiàn)成倍增長、成倍下降的現(xiàn)象，患者為維持正 常療程不得不反復(fù)用藥。并且用集落因子動員外周血干細胞用于細胞移植時，很難在一個 給藥療程獲得足量的外周血干細胞用于移植，對于移植供體帶來更多痛苦，同時增加了移 植受體患者的危險率。
[0006] 近年來研宄發(fā)現(xiàn)多種生長因子可以促進高劑量化療組或正常組小鼠外周血干細 胞動員，或提高放化療后骨髓有核細胞數(shù)量，恢復(fù)外周血白細胞數(shù)量，其中包括骨形態(tài)發(fā)生 蛋白。骨形態(tài)發(fā)生蛋白是轉(zhuǎn)化生長因子（TGF-β)超家族的成員，對胚胎骨形成及出生后骨 骼發(fā)育有重要作用。其中BMP-2是最重要的成員之一，已實現(xiàn)了基因工程制備，并已獲得 FDA批準應(yīng)用于臨床骨組織修復(fù)。目前關(guān)于BMP-2的研宄大部分集中在骨修復(fù)方面，近年來 研宄表明，BMP還與動物胚胎時期的造血發(fā)生關(guān)系密切。在BMP家族中，BMP-4已被證明具 有促進造血的功能，并且有文獻報道造血細胞因子與BMP-4合用能顯著促進造血干細胞的 分化。田瓊等（田瓊，張紹章，張發(fā)科.骨形成蛋白對造血的影響[J].中華放射醫(yī)學與 防護雜志，2000(2) : 140.)報道BMP-2對成年動物造血損傷也具有修復(fù)作用。劉昌勝等發(fā) 現(xiàn)，rhBMP-2融合蛋白對放、化療引起的造血損傷有有效的治療作用，但其白細胞數(shù)的恢復(fù) 速度不如粒細胞集落刺激因子快。
[0007] 目前臨床迫切需要能夠快速，穩(wěn)定地對造血損傷起修復(fù)作用且副作用低的藥物。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 本發(fā)明的目的在于提供一種促進造血損傷修復(fù)的藥物組合物。
[0009] 本發(fā)明的第一方面，提供一種藥物組合物，所述藥物組合物包含重組人骨形態(tài)發(fā) 生蛋白-2和人粒細胞刺激因子。
[0010] 在另一優(yōu)選例中，所述藥物組合物還包含藥學上可接受的載體。
[0011] 在另一優(yōu)選例中，所述重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2的序列如SEQ ID NO 2所示。
[0012] 在另一優(yōu)選例中，所述人粒細胞刺激因子為重組人粒細胞刺激因子。
[0013] 在另一優(yōu)選例中，所述重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白_2和人粒細胞刺激因子的重量比 為1-100 :1，較佳地為10-80:1，更佳地為15-50:1，最佳為20-35:1或20-30:1。
[0014] 在另一優(yōu)選例中，所述藥物組合物還包含GM-CSF、EP0、IL-2中的一種或兩種以上 的組合。
[0015] 在另一優(yōu)選例中，所述藥物組合物的劑型選自下組：注射劑、注射用無菌粉末、片 劑、散劑、溶液劑或酊劑。
[0016] 本發(fā)明的第二方面，提供第一方面所述的藥物組合物的制備方法，包括將所述重 組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2和人粒細胞刺激因子進行混合得到所述藥物組合物的步驟。
[0017] 在另一優(yōu)選例中，在混合步驟中還包括加入藥學上可接受的載體，從而得到藥物 組合物。
[0018] 在另一優(yōu)選例中，所述重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白_2和人粒細胞刺激因子的重量比 為1-100 :1，較佳地為10-80:1，更佳地為15-50:1，最佳為20-35:1或20-30:1。
[0019] 本發(fā)明的第三方面，提供一種藥盒，包含：
[0020] (1)第一劑，所述第一劑中含有重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白_2 ;和
[0021] ⑵第二劑，所述第二劑中含有人粒細胞刺激因子。
[0022] 在另一優(yōu)選例中，所述第一劑還包含藥學上可接受的載體。
[0023] 在另一優(yōu)選例中，所述第二劑還包含藥學上可接受的載體。
[0024] 在另一優(yōu)選例中，所述藥盒中還包含藥學上可接受的載體。
[0025] 在另一優(yōu)選例中，所述第一劑為重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2。
[0026] 在另一優(yōu)選例中，所述第二劑為人粒細胞刺激因子。
[0027] 在另一優(yōu)選例中，所述人粒細胞刺激因子為重組人粒細胞刺激因子。
[0028] 本發(fā)明的第四方面，提供第一方面所述的藥物組合物或第三方面的藥盒的用途， 用于體外促進造血祖細胞增殖和/或分化。
[0029] 本發(fā)明的第五方面，提供第一方面所述的藥物組合物或第三方面的藥盒的用途， 用于：
[0030] (1)制備預(yù)防和/或治療白細胞減少癥的藥物；
[0031] (2)制備外周血干細胞移植動員劑；
[0032] (3)制備預(yù)防和/或治療造血損傷的藥物；
[0033] (4)制備防護電離輻射的藥物。
[0034] 在另一優(yōu)選例中，所述造血損傷由化療藥物引起或由放療射線引起，所述藥物組 合物或藥盒在放療或化療之前、和/或之中、和/或之后使用。
[0035] rhBMP-2具有促進造血干細胞恢復(fù)的作用，與CSF聯(lián)用后，其促進造血干細胞再生 的作用更為顯著。rhBMP-2與G-CSF聯(lián)合使用能有效促進化療藥物或輻照放射所導(dǎo)致的造 血功能低下的恢復(fù)。
[0036] 應(yīng)理解，在本發(fā)明范圍內(nèi)中，本發(fā)明的上述各技術(shù)特征和在下文（如實施例）中具 體描述的各技術(shù)特征之間都可以互相組合，從而構(gòu)成新的或優(yōu)選的技術(shù)方案。限于篇幅，在 此不再一一累述。
【附圖說明】
[0037] 圖1顯示了化療實驗各組小鼠不同時間白細胞數(shù)（WBC)數(shù)的變化。
[0038] 圖2顯示了化療實驗各組小鼠實驗開始后第10天外周血造血干細胞HSCs含量的 比例的變化，從左至右依次為正常組、CTX組、BMP組、G-CSF組以及BMP+G-CSF組。
[0039] 圖3顯示了化療實驗各組小鼠實驗開始后第10天骨髓⑶4+細胞含量比例的變化， 從左至右依次為正常組、CTX組、BMP組、G-CSF組以及BMP+G-CSF組。
[0040] 圖4顯示了化療實驗各組小鼠實驗開始后第10天骨髓⑶Sa+細胞含量比例變化， 從左至右依次為正常組、CTX組、BMP組、G-CSF組以及BMP+G-CSF組。
[0041] 圖5顯示了化療實驗各組小鼠實驗開始后第10天骨髓造血干細胞HSCs含量的比 例的變化，從左至右依次為正常組、CTX組、BMP組、G-CSF組以及BMP+G-CSF組。
[0042] 圖6顯示了化療實驗各組小鼠實驗開始后第10天和第15天脾系數(shù)的變化，從左 至右依次為正常組、CTX組、BMP組、G-CSF組以及BMP+G-CSF組。
[0043] 圖7顯示了化療實驗各組小鼠實驗開始后第10天和第15天胸腺系數(shù)的變化，從 左至右依次為正常組、CTX組、BMP組、G-CSF組以及BMP+G-CSF組。
[0044] 圖8顯示了放療實驗各組小鼠的存活率情況。
[0045] 圖9顯示了放療實驗各組小鼠不同時間紅細胞數(shù)（RBC)數(shù)的變化。
[0046] 圖10顯示了放療實驗各組小鼠不同時間血紅蛋白（HGB)的變化。
[0047] 圖11顯示了放療實驗各組小鼠不同時間白血小板（PLT)數(shù)的變化。
【具體實施方式】
[0048] 本申請的發(fā)明人經(jīng)過廣泛而深入地研宄，首次意外發(fā)現(xiàn)重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白與 粒細胞刺激因子有良好的協(xié)同作用，可以有效地促進造血損傷時造血干細胞以及脾臟和胸 腺功能細胞的恢復(fù)，還可促進造血功能低下時外周血血細胞的恢復(fù)，加速骨髓移植時外周 血白細胞的恢復(fù)，可以用于預(yù)防和/或治療造血損傷的藥物，還可用作外周血干細胞移植 動員劑。在此基礎(chǔ)上，完成了本發(fā)明。
[0049] 粒細胞刺激因子（G-CSF)
[0050] 可用于本發(fā)明的G-CSF可以是任何來源，天然的，重組的G-CSF，其類似物和活性 片段，以及醫(yī)學上可接受的賦形劑和載體以及鹽等。
[0051] 特別優(yōu)選重組人G-CSF，G-CSF的國產(chǎn)商品化產(chǎn)品，包括（但并不限于）：吉粒芬， 賽格力，瑞血新，惠爾血，瑞白，特爾津，潔欣，泉升等或其混合物。
[0052] 粒細胞刺激因子的安全有效量通常為0. 1-1000 μ g/Kg體重，較佳的為 0· 2-250 yg/Kg 體重。
[0053] 骨形態(tài)發(fā)生蛋白
[0054] 本發(fā)明所用的重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2是114個氨基酸的人骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2 天然全長成熟肽，與體內(nèi)的天然BMP-2的序列相同。蛋白單鏈分子量約13-15kD，經(jīng)復(fù)性后 該活性蛋白為二聚體，分子量約為25-30kD。另外，由于本發(fā)明的rhBMP-2具有與天然存在 的人BMP-2相同的結(jié)構(gòu)，從而避免了長期