專利名稱：檢測血清中過敏原特異性抗體的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及診斷技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種檢測血清中過敏原特異性抗體的方法。
背景技術(shù)：
過敏性疾病的發(fā)病在現(xiàn)代社會中呈逐年上升的趨勢，我國大約有5_10%、美國和歐洲等發(fā)達(dá)國家大約有5-25%的人受過敏性疾病的困擾。過敏反應(yīng)又稱變態(tài)反應(yīng)，是人類常見的免疫性疾病。但其會引起一系列的臨床反應(yīng)，涉及到胃腸道、皮膚、呼吸道甚至更危險(xiǎn)的其它反應(yīng)，故應(yīng)該引起足夠的重視。誘發(fā)過敏反應(yīng)的抗原稱為過敏原，引起過敏反應(yīng)的抗原物質(zhì)常見的有2000多種，醫(yī)學(xué)文獻(xiàn)記載接近2萬種。過敏原可根據(jù)其引起過敏的方式分為3類(1)食物過敏，由食用某些食物引起的，如牛奶、蛋類、魚蝦等；(2)吸入性過敏， 由鼻腔等吸入某些物質(zhì)引起的，如花粉、塵螨等；(3)接觸性過敏，由于身體接觸到某些物質(zhì)引起的，如化妝品、橡膠制品等。免疫介導(dǎo)的過敏反應(yīng)有兩種類型IgE介導(dǎo)的過敏反應(yīng)和非IgE介導(dǎo)的過敏反應(yīng)。IgE介導(dǎo)的過敏反應(yīng)是引起過敏的主要效應(yīng)。目前，IgE介導(dǎo)的過敏反應(yīng)的過敏原的檢測在臨床上已有多種檢測方法?？煞譃轶w內(nèi)檢測方法和體外檢測方法。體內(nèi)檢測包括雙盲對照食物激發(fā)實(shí)驗(yàn)(DBPCFC)和皮膚點(diǎn)刺試驗(yàn)(SPT)。體內(nèi)試驗(yàn)雖然簡單、快速，但對試驗(yàn)者造成創(chuàng)傷和極大痛苦，且受多因素影響。相對于體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，體外實(shí)驗(yàn)更加安全，體外檢測方法主要包括對血清IgE的檢測和組織胺釋放試驗(yàn)等。過敏原與IgE，尤其是特異性IgE(SlgE)的結(jié)合是過敏原致敏的中心環(huán)節(jié)， 因此提高過敏原特異性IgE檢測的準(zhǔn)確性和靈敏度對過敏原的評價和臨床過敏癥的診斷具有重要意義。IgE介導(dǎo)的過敏反應(yīng)的致敏過敏原檢測方法有多種，如放射過敏原吸附試驗(yàn) (RAST)、酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)和免疫印跡等。針對酶免疫分析已經(jīng)有多種檢測產(chǎn)品，如測定帽(CAP)過敏原檢測系統(tǒng)、德國MEDIWISS公司生產(chǎn)的AllergyScreen系統(tǒng)及美國ASI 公司生產(chǎn)的過敏反應(yīng)體外檢測系統(tǒng)等，但這些方法的儀器試劑都很昂貴，不適于普及應(yīng)用。納米超順磁性微球是利用納米技術(shù)制備出來的一種內(nèi)含磁性材料納米粒子的高分子微球。在外部磁場作用下，納米超順磁性能迅速從所在的溶液介質(zhì)中定向移至磁場作用區(qū)，撤去外部磁場，納米超順磁性微球又可重懸浮于溶液介質(zhì)中。同時磁性微球表面通過化學(xué)反應(yīng)形成多種活性功能集團(tuán)，如-OH，-COOH，-CHO，-NH2等，從而可以共價方式結(jié)合具有生物活性的物質(zhì)，如蛋白，核酸等生物載體。再有納米級尺度使微球比表面積激增，微球官能團(tuán)密度及選擇性吸收能力變大，達(dá)到吸附膨脹的時間縮短，粒子的穩(wěn)定性大大提高?；诔槾判晕⑶虻倪@些特點(diǎn)，其逐漸在生物學(xué)、生物技術(shù)和生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用，主要應(yīng)用于分離濃縮等試驗(yàn)。利用磁性微球比表面積大，易分離，表面可功能化等優(yōu)點(diǎn)將其用于免疫測定，由于磁性微球代替了其它固相載體而用于免疫分離，與傳統(tǒng)方法相比，該方法具有特異性好，靈敏度高，準(zhǔn)確性好的特點(diǎn)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了一種檢測血清中螨蟲過敏原特異性抗體的方法，解決了傳統(tǒng)方法靈敏度和準(zhǔn)確性不高的問題。一種檢測血清中螨蟲過敏原特異性抗體的方法，包括將抗人IgE抗體與表面羧基修飾的磁性微球偶聯(lián)，制得免疫磁性微球；將免疫磁性微球與待測血清混合孵育，使免疫磁性微球與待測血清中的IgE結(jié)合；磁分離得到免疫磁性微球-IgE結(jié)合物，將沉淀溶于緩沖液，加入到包被有過敏原的酶標(biāo)板孔內(nèi)，經(jīng)孵育、洗板后采用酶聯(lián)免疫吸附法進(jìn)行檢測。所述磁性微球的制備方法如下將FeCl3. 6H20、檸檬酸和尿素溶于乙二醇中，在180 220°C下加熱4 8小時，分離沉淀，洗滌，即制得磁性微球。所述免疫磁性微球與待測血清的重量體積比為10 μ g 10 μ L lmL。所述的磁性微球與抗人IgE抗體偶聯(lián)前經(jīng)交聯(lián)劑活化，所述活化所用試劑為 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)和N-羥基硫代琥珀酰亞胺(NHS)溶液。優(yōu)選的，每毫克磁性微球偶聯(lián)的抗人IgE抗體的質(zhì)量為10 100 μ g。所述的包被有過敏原的酶標(biāo)板中的過敏原可以是各種能引起人類過敏的蛋白。本發(fā)明方法通過磁性微球偶聯(lián)抗人IgE抗體，制得的免疫磁性微球與待測血清混合孵育，與血清中所有IgE結(jié)合，接著在外界磁場的作用下分離免疫磁性微球-IgE結(jié)合物， 結(jié)合包被有過敏原的酶標(biāo)板，利用酶聯(lián)免疫吸附法進(jìn)行檢測，判定血清當(dāng)中是否含有與相應(yīng)過敏原結(jié)合的特異性IgE。本發(fā)明通過免疫磁性微球?qū)⑺蠭gE從血清中分離出來，去除了雜質(zhì)，提高了酶聯(lián)免疫吸附檢測的靈敏度、特異性和準(zhǔn)確性。


圖1為實(shí)施例1羧基修飾的Fe3O4磁性微球的掃描電鏡圖；圖2為實(shí)施例3本發(fā)明方法與傳統(tǒng)方法檢測螨蟲特異性抗體的結(jié)果示意圖；圖3為實(shí)施例4酶聯(lián)免疫吸附檢測所得OD值隨血清稀釋倍數(shù)變化關(guān)系圖；圖4為實(shí)施例5酶聯(lián)免疫吸附檢測所得OD值與血清中IgE含量關(guān)系圖。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1將5mmol FeCl3. 6H20、3mmol檸檬酸和20mmol尿素溶于20mL乙二醇溶劑中，混合溶液置于30mL水熱釜中，在200°C下加熱6小時，所得黑色沉淀分別用乙醇和去離子水洗滌 3次，溶于去離子水中并加入0.02% (w/v)的疊氮化鈉長期保存，制得如圖1所示粒徑大小約為200nm，表面小分子羧基修飾的親水性單分散Fe3O4磁性微球。實(shí)施例2偶聯(lián)羊抗人IgE抗體，制備免疫磁性微球。(1)使用 25mM MES (pH = 6)為緩沖液，取 9 μ L、15 μ L、30 μ L、90 μ L 磁性微球(濃度為10mg/mL)，清洗兩次，旋轉(zhuǎn)混合IOmin ；(2)使用新鮮配制的EDC和NHS溶液為交聯(lián)劑，EDC和NHS 的濃度為50mg/mL，溶劑為25mM MES (pH = 6)，向清洗后的磁性微球各加入交聯(lián)劑，每mg磁性微球各加入20 μ L交聯(lián)劑，室溫下傾斜旋轉(zhuǎn)孵育30min，活化磁性微球；(3)活化后的磁性微球用MES緩沖液清洗兩次，加入24 μ L羊抗人IgE抗體 (2. 5mg/mL)，繼續(xù)加入6 μ LMES，漩渦混合，室溫下旋轉(zhuǎn)溫育l_2h ；(4)孵育后，磁分離，移除上清于一新管中(留作測偶聯(lián)率)；偶聯(lián)率(％)=(偶聯(lián)前的單抗?jié)舛?偶聯(lián)后的上清濃度)X100/偶聯(lián)前的單抗?jié)舛龋?5)清洗偶聯(lián)抗體后的磁性微球，用0. 05M Tris. HCl (pH = 7. 4)阻斷未反應(yīng)的磁性微球表面的羧基，室溫下旋轉(zhuǎn)溫育15min，PBST緩沖液清洗4次，此緩沖液為含0. 5% (w/ ν) Tween-20 的 PBS (pH =7.4);(6) 10%牛血清白蛋白(BSA)溶液室溫下震蕩封閉24h。按照上述方法，磁性微球偶聯(lián)抗體后上清的抗體含量極低，偶聯(lián)率均接近100% (表1)，說明由水熱法制備的200nm 磁性微球的羧基含量較高；當(dāng)磁性微球用量已經(jīng)很低時，仍可偶聯(lián)較高濃度的抗體。表 1
磁性微球與抗體
的質(zhì)量比例_吸光值A(chǔ)_蛋白質(zhì)濃度_偶聯(lián)率
15:1 0.003 4.72pg/ml 99.80% 5:1 0.005 7.42pg/ml 99.70% 2.5:1 0.007 10.13pg/ml 99.60% _\_5Λ_0.006_8.78pg/ml_99.60%實(shí)施例3用實(shí)施例2制備的200nm免疫磁性微球(15 1)捕獲血清樣品中的特異性IgE 抗體，分析利用免疫磁性微球的方法對螨蟲特異性SlgE的檢測效果。具體操作如下根據(jù)需求量取免疫磁性微球于干凈的離心管中，按照體積比1 10的比例(IOyL 免疫磁性微球加100 μ L活化緩沖液)加入緩沖液，混勻。磁分離，移除緩沖液。如此再次清洗一次，然后加活化緩沖液定容至原需求量。將待測的含有螨蟲特異性IgE (SlgE)的血清樣品，分別稀釋1倍、3倍、5倍、10倍、 100倍、1000倍，備用。在離心管中各加入2μ L活化后的免疫磁性微球(濃度為5mg/mL)， 再加入100 μ L上述待測血清樣品，混勻，于室溫下旋轉(zhuǎn)孵育15-20min。孵育后，磁分離，移除上清；加入PBS緩沖溶液至100 μ L，混勻得免疫磁性微球IgE樣品。然后使用杭州浙大迪訊生物基因工程有限公司的產(chǎn)品(產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn)編號(YZB/國 1736-2009))，參照其過敏原特異性抗體IgE檢測試劑盒說明書進(jìn)行酶聯(lián)免疫法檢測OD值， 具體操作步驟如下(1)在特異性過敏原孔中加入100 μ L上述溫育混勻后的免疫磁性微球IgE樣品， 輕輕混勻，37 °C孵育45min ；(2)洗板倒盡板內(nèi)液體，每孔加入250 μ L稀洗滌液洗滌酶標(biāo)板，然后倒盡液體， 再加入250 μ L稀洗滌液，倒盡液體，如此反復(fù)洗滌5次，最后將酶標(biāo)板翻扣在厚疊吸水紙上拍干；(3)每孔分別加入100 μ L已經(jīng)配制好的HR酶聯(lián)二抗溶液，37°C溫育反應(yīng)45min ；(4)洗板如步驟⑵操作；(5)每孔加入100 μ L TMB底物顯色液，室溫避光靜置反應(yīng)15-20min ；
(6)每孔分別加入100 μ L終止反應(yīng)液；(7)使用標(biāo)準(zhǔn)酶標(biāo)儀在450nm波長下測出每孔的吸光度值(0D值)。按照上述操作方法，每一試驗(yàn)結(jié)果都來自3個重復(fù)的平均值。以酶聯(lián)免疫法直接對血清樣品進(jìn)行檢測的OD值作為對照，用200nm免疫磁性微球檢測了對螨蟲過敏的不同濃度待測血清樣品。結(jié)果表明(圖2)，免疫磁性微球檢測的OD值均高于常規(guī)方法直接檢測的 OD值，其中以稀釋5倍時最高，此時的slgE濃度約為0. 5IU/mL。實(shí)施例4免疫磁性微球捕獲血清樣品中的特異性IgE抗體，將待測血清樣品分別稀釋至原體積的1倍、2倍、3倍、5倍和10倍，通過檢測免疫磁性微球與待測血清樣品混合時，可以有效捕獲的血清樣品中IgE抗體的最大反應(yīng)體積，分析免疫磁性 微球捕獲法的檢測靈敏度。 具體操作如下活化免疫磁性微球根據(jù)需求量，取上述實(shí)施例2制備的200nm免疫磁性微球 (15 1)于干凈的離心管中，按照體積比1 10的比例(10 μ L免疫磁性微球加100 μ L活化緩沖液)加入含0.1% BSA的PBS活化緩沖液，混勻。磁分離，移除緩沖液。如此再次清洗一次，然后加活化緩沖液定容至原需求量。樣品的孵育在離心管中各加入100 μ L含有戶塵螨特異性IgE(SlgE)的待測血清樣品，再分別稀釋至原體積的1倍、2倍、3倍、5倍、10倍。分別取2 μ L上述活化后的免疫磁性微球(濃度為5mg/mL)到離心管中，輕輕混勻，室溫下旋轉(zhuǎn)孵育15-20min ；孵育結(jié)束后，磁分離，移除上清；加入IOOyL PBS緩沖液，混勻。然后用酶聯(lián)免疫法檢測OD值，具體操作步驟同實(shí)施例3。按照上述操作方法，每一試驗(yàn)結(jié)果都來自3個重復(fù)的平均值。結(jié)果表明(圖3)，在 IgE總量一定的情況下，待測樣品的體積擴(kuò)大至常規(guī)檢測方法的3倍時，檢測靈敏度不受影響；隨著體積的進(jìn)一步擴(kuò)大，檢測值有所下降，擴(kuò)大為10倍時，趨近于常規(guī)方法的檢測值。實(shí)施例5(1)免疫磁性微球的清洗活化根據(jù)需求量，取上述實(shí)施例2制備的免疫磁性微球 (15 1)于干凈的離心管中，按照體積比1 10的比例加入含0.1% BSA的PBS活化緩沖液，混勻。磁分離，移除緩沖液。如此再次清洗一次，然后加上述活化緩沖液定容至原需求量。(2)樣品孵育根據(jù)國際分級標(biāo)準(zhǔn)，標(biāo)準(zhǔn)血清樣品稀釋濃度為0. 35IU/mL、0. 7IU/ mL、3. 5IU/mL、17. 5IU/mL、50IU/mL、100IU/mL。分別取2 μ L活化后的免疫磁性微球加到酶標(biāo)板的各孔中，再各加入將上述濃度梯度稀釋10倍的標(biāo)準(zhǔn)血清樣品，終體積為100 μ L，輕輕混勻；室溫下振蕩孵育15-20min。(3)洗板磁分離，移除上清，每孔加入200 μ L PBST緩沖液洗滌酶標(biāo)板，磁分離后，移除上清，如此反復(fù)洗滌3次，最后將洗滌液完全移除干凈。(4)每孔分別加入100 μ L已經(jīng)配制好的HRP酶聯(lián)二抗，吸打或者輕輕搖晃，與免疫磁性微球混勻，37 °C溫育45min。(5)洗板如步驟(2)操作。(6)每孔加入100 μ L TMB底物顯色液，吸打或者輕輕搖晃，與免疫磁性微球混勻， 室溫避光靜置反應(yīng)15-20min。
(7)每孔分別加入100 μ L終止反應(yīng)液。
(8)使用標(biāo)準(zhǔn)酶標(biāo)儀在450nm波長下測出每孔的吸光度值(0D值)。(9)結(jié)果計(jì)算以標(biāo)準(zhǔn)溶液系列的吸光度值(0D值)對相應(yīng)濃度的對數(shù)值進(jìn)行線性回歸，計(jì)算出校準(zhǔn)曲線。如圖4所示，標(biāo)準(zhǔn)曲線在IgE濃度為0. 035IU/mL 10IU/mL之間線性關(guān)系良好， R2 = 0. 9606，相關(guān)系數(shù)較好。
權(quán)利要求
1.一種檢測血清中過敏原特異性抗體的方法，包括將抗人IgE抗體與表面羧基修飾的磁性微球偶聯(lián)，制得免疫磁性微球；將免疫磁性微球與待測血清混合孵育，使免疫磁性微球與待測血清中的IgE結(jié)合；磁分離得到免疫磁性微球-IgE結(jié)合物，并分散于緩沖液中，加入到包被有過敏原的酶標(biāo)板孔內(nèi)，孵育、洗板后采用酶聯(lián)免疫吸附法進(jìn)行檢測。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述表面羧基修飾的磁性微球通過如下方法制備將FeCl3. 6H20、檸檬酸和尿素溶于乙二醇中，在180 220°C下加熱4 8小時，分離沉淀，洗滌，即制得表面羧基修飾的磁性微球。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述免疫磁性微球與待測血清的重量體積比為 10 μ g 10μ L lmL。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的磁性微球與抗人IgE抗體偶聯(lián)前經(jīng)交聯(lián)劑活化。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，所述交聯(lián)劑為1-(3_二甲氨基丙基)-3_乙基碳二亞胺鹽酸鹽和N-羥基硫代琥珀酰亞胺溶液。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，每毫克磁性微球偶聯(lián)的抗人IgE抗體的質(zhì)量為10 100 μ go
全文摘要
本發(fā)明公開了一種檢測血清中過敏原特異性抗體的方法，包括將抗人IgE抗體與表面羧基修飾的磁性微球偶聯(lián)，制得免疫磁性微球；將免疫磁性微球與待測血清混合孵育，使免疫磁性微球與待測血清中的IgE結(jié)合；磁分離得到免疫磁性微球-IgE結(jié)合物，將沉淀溶于緩沖液，加入到包被有過敏原的酶標(biāo)板孔內(nèi)，經(jīng)孵育、洗板后采用酶聯(lián)免疫吸附法進(jìn)行檢測。本發(fā)明方法通過磁性微球偶聯(lián)抗人IgE抗體，制得的免疫磁性微球與待測血清混合孵育，與血清中所有IgE結(jié)合，富集并分離IgE，接著利用酶聯(lián)免疫吸附法進(jìn)行檢測，判定血清當(dāng)中是否含有與過敏原結(jié)合的特異性IgE。本發(fā)明通過免疫磁性微球?qū)⑺蠭gE從血清中分離出來，去除了雜質(zhì)，提高了酶聯(lián)免疫吸附檢測的靈敏度、特異性和準(zhǔn)確性。
文檔編號G01N33/68GK102253199SQ201110158650
公開日2011年11月23日 申請日期2011年6月14日 優(yōu)先權(quán)日2011年6月14日
發(fā)明者吳善東, 樓兵干, 趙鋮鋮, 高其康 申請人:浙江大學(xué)