一種肺癌患者血清特異性代謝產(chǎn)物譜及其建立方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種肺癌患者血清特異性代謝產(chǎn)物譜及其建立方法，具體是基于肺癌患者的血清進(jìn)行液相/氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用代謝組學(xué)分析方法，包括：收集健康正常體檢者和肺癌患者手術(shù)前及術(shù)后7天空腹血標(biāo)本，經(jīng)處理后經(jīng)色譜柱分離，并采用質(zhì)譜檢測(cè)分析后提取并對(duì)齊儀器原始數(shù)據(jù)，采用多變量數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)軟件建立數(shù)學(xué)模型對(duì)上述代謝物譜進(jìn)行分析，比較正常人與肺癌患者代謝物譜的差異，從而確定特異性代謝物譜。本發(fā)明方法可以全面、綜合地體現(xiàn)肺癌患者的代謝產(chǎn)物的變異狀況，可用于肺癌的早期診斷或?yàn)轭A(yù)后提供有利的技術(shù)支持。
【專利說明】一種肺癌患者血清特異性代謝產(chǎn)物譜及其建立方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及癌癥，特別是肺癌。本發(fā)明還涉及代謝組學(xué)，特別是基于液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用和氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用分析技術(shù)的代謝組學(xué)。本發(fā)明為早期診斷肺癌提供了依據(jù)，并提供了肺癌患者術(shù)前及術(shù)后血清中特異性代謝物譜以及相關(guān)特異性生物標(biāo)記物。并且本發(fā)明還提供了建立肺癌患者術(shù)前及術(shù)后血清中特異性代謝物譜以及篩選相關(guān)特異性生物標(biāo)記物的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]肺癌是世界性的惡性腫瘤之一，居目前癌癥死因的首位。近20年來，盡管有關(guān)肺癌的發(fā)生發(fā)展機(jī)理的研究和診療水平有明顯進(jìn)步，但其5年生存率仍只有15%左右。原因是目前肺癌的早期診斷和治療方法遠(yuǎn)不能滿足現(xiàn)實(shí)臨床工作所需，80%肺癌患者在就診時(shí)就處于晚期，已喪失手術(shù)機(jī)會(huì)，僅能行姑息治療，從而導(dǎo)致患者生存時(shí)間的縮短；如果能實(shí)現(xiàn)早期診斷，肺癌患者的5年生存率可達(dá)到85%。傳統(tǒng)的影像學(xué)和痰液脫落細(xì)胞學(xué)仍是目前篩查早期肺癌的主要手段，但存在一定漏診和誤診，病理學(xué)檢查雖然能夠診斷肺癌，但會(huì)對(duì)人體造成很大創(chuàng)傷。因此，早期篩查已成為肺癌防治的關(guān)鍵，探索和建立一種簡(jiǎn)單、快速、敏感性高和特異性強(qiáng)的早期診斷技術(shù)等已是臨床醫(yī)學(xué)上的迫切需要。
[0003]代謝組學(xué)是繼基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)后系統(tǒng)生物學(xué)的另一重要研究內(nèi)容，它是研究生物體系(細(xì)胞，組織或生物體)受外部刺激所產(chǎn)生的所有代謝產(chǎn)物變化的科學(xué)。與轉(zhuǎn)錄組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)比較，代謝組學(xué)專門研究生物體系受外部刺激后所產(chǎn)生的所有代謝產(chǎn)物的變化，能夠更準(zhǔn)確地反映生物體系的狀態(tài)，且位于系統(tǒng)生物學(xué)的最下游，是生物體系整體功能或狀態(tài)最終結(jié)果的表現(xiàn)。代謝組學(xué)在發(fā)現(xiàn)潛在生物標(biāo)志物和改善肺癌早期診斷方面有獨(dú)特的前景，它借助先進(jìn)的分析儀器和統(tǒng)計(jì)工具對(duì)多種疾病進(jìn)行標(biāo)志物檢測(cè)和研究，但用代謝組學(xué)方法研究肺癌的報(bào)道相對(duì)較少。牛艷潔等應(yīng)用GC/MS分析肺癌和其它肺部疾病患者的血清及尿液小分子代謝產(chǎn)物，發(fā)現(xiàn)肺癌患者血清及尿液的代謝模式都出現(xiàn)明顯的分離趨勢(shì)。An等應(yīng)用LC-MS分析肺癌和正常對(duì)照人群尿液的代謝產(chǎn)物，Chen等運(yùn)用IHNMR分析肺癌患者組織中的代謝產(chǎn)物，分別發(fā)現(xiàn)了肺癌患者尿液和組織中的差異代謝產(chǎn)物。在代謝組學(xué)分析的各種技術(shù)手段中，液相色譜-四級(jí)桿-飛行時(shí)間質(zhì)譜(LC-Q-T0F/MS)作為一種先進(jìn)的分離分析技術(shù)，在眾多分析方法中脫穎而出，尤其對(duì)于非靶標(biāo)代謝組學(xué)分析，其強(qiáng)大的定性分析能力使之被公認(rèn)為最好的復(fù)雜樣品分析技術(shù)之一，已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于代謝組學(xué)的研究領(lǐng)域中。
[0004]氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(GC/MS)現(xiàn)已被廣泛的應(yīng)用于復(fù)雜組分的分離和鑒定，其結(jié)合了氣相色譜的高分辨率和質(zhì)譜的高靈敏度，是生物樣品中藥物與代謝物定性定量的有效工具。GC/MS和液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(LC/MS)當(dāng)前也被廣泛的應(yīng)用到代謝組學(xué)的研究中。色譜技術(shù)主要由流動(dòng)相和固定相組成，樣本由流動(dòng)相帶入色譜儀，在氣相色譜技術(shù)中，流動(dòng)相即為氣體。當(dāng)兩相作相對(duì)運(yùn)動(dòng)時(shí)，樣本不斷地在兩相之間進(jìn)行分配，樣本各組分與固定相分子間發(fā)生吸附、溶解、結(jié)合或離子交換，使樣本各組分隨載氣在兩相之間反復(fù)多次分配，由于樣本各組分之間的性質(zhì)不同，流動(dòng)相氣體攜帶的樣本中各種不同組分在色譜過程中的樣本中表現(xiàn)出不同的色譜行為，最終使那些分配系數(shù)只有微小差別的組分發(fā)生很大的分離效果，從而使不同組分得到完全分離。將分離后的各種組分用質(zhì)譜進(jìn)行檢測(cè)。并對(duì)檢測(cè)后得到的代謝產(chǎn)物進(jìn)行對(duì)比分析，最后得到各組間的差異性代謝產(chǎn)物，利用支持向量機(jī)、人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)及主成分分析等生物信息學(xué)的方法選擇部分差異性代謝產(chǎn)物建立判別模型。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]針對(duì)現(xiàn)有肺癌診斷方法的有創(chuàng)傷性、漏診和誤診等缺點(diǎn)，本發(fā)明所要解決的問題是提供一種代謝組學(xué)技術(shù)為肺癌早期診斷提供依據(jù)，該方法具有靈敏度高，特異性好，無創(chuàng)等優(yōu)點(diǎn)。
[0006]本發(fā)明采用液相色譜-四級(jí)桿-飛行時(shí)間質(zhì)譜和氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)的分析方法，具有強(qiáng)大的定性分析能力，對(duì)血清僅需簡(jiǎn)單處理，成本低廉，適合大規(guī)模篩查，并且同樣具有良好的特異性和靈敏度，具有非常好的應(yīng)用前景。
[0007]本發(fā)明為早期診斷肺癌提供了依據(jù)。通過尋找肺癌患者術(shù)前及術(shù)后血清中特異性代謝物譜以及相關(guān)特異性生物標(biāo)記物，建立檢測(cè)該生物標(biāo)記物的方法。
[0008]本發(fā)明運(yùn)用基于液相色譜-四級(jí)桿-飛行時(shí)間質(zhì)譜聯(lián)用分析和氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)對(duì)肺癌患者和健康人血漿中的代謝物質(zhì)進(jìn)行定性定量分析，通過考察肺癌患者和正常人的代謝指紋圖譜變化，將健康人及肺癌患者很好的區(qū)分開，并從中找出潛在的腫瘤標(biāo)志物。同時(shí)檢測(cè)肺癌術(shù)前和肺癌術(shù)后患者的代謝指紋圖譜變化，以期通過考察患者血清中的代謝物變化，總結(jié)肺癌腫瘤復(fù)發(fā)和預(yù)后的相關(guān)代謝標(biāo)志物，為今后肺癌患者的預(yù)后判別提供理論依據(jù)。
[0009]本發(fā)明提供了一種代謝組學(xué)技術(shù)在肺癌疾病中的應(yīng)用，其步驟為:
[0010](I)樣本的收集與處理:收集臨床病人的血清樣本；樣本經(jīng)過甲醇沉淀蛋白。
[0011](2)液相色譜-四級(jí)桿-飛行時(shí)間質(zhì)譜和氣相色譜質(zhì)譜測(cè)定:采用基于液相色譜質(zhì)譜和氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用的方法得到血清中的代謝物譜，代謝物譜經(jīng)過處理得到各個(gè)峰的峰高或者峰面積以及質(zhì)量數(shù)和保留時(shí)間等數(shù)據(jù)。
[0012](3)模式識(shí)別分析血清中代謝物譜:上述數(shù)據(jù)采用多變量數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)軟件Simca-Pll.0，選用主成分分析(PCA)、偏最小二乘方判別分析(PLS-DA)、正交偏最小二乘方分析(OPLS)等方法建立數(shù)學(xué)模型，對(duì)步驟(2)中產(chǎn)生的代謝物譜進(jìn)行分析，比較正常人與肺癌患者手術(shù)前后代謝物譜的差異，從而確定特異性代謝物譜。
[0013](4)生物標(biāo)記物:發(fā)現(xiàn)了一組血清中的生物標(biāo)記物用于肺癌疾病的診斷或者為肺癌早期診斷提供依據(jù)。
[0014]隨著代謝組學(xué)的發(fā)展，越來越多的研究發(fā)現(xiàn)，分子質(zhì)量小于1000的內(nèi)源性小分子代謝物更加具有早期診斷價(jià)值，作為一種新的檢測(cè)工具，代謝組學(xué)方法已成為腫瘤標(biāo)志物檢測(cè)中的研究熱點(diǎn)。研究表明，正常人與肺癌病人的代謝譜存在明顯的差異，代謝組學(xué)技術(shù)有助于肺癌等疾病的診斷。
[0015]1.檢測(cè)血清中的代謝物譜和相關(guān)的生物標(biāo)記物，與目前常用傳統(tǒng)的影像學(xué)、痰液脫落細(xì)胞學(xué)及病理學(xué)檢查等侵入性方法相比，具有無創(chuàng)，方便快捷的特點(diǎn)。[0016]2.準(zhǔn)確反映肺癌患者與正常人的代謝譜差異，特異性高。
[0017]不希望受任何理論的限制，發(fā)明人指出這些生物標(biāo)志物是存在于人體中的內(nèi)源性化合物。通過本發(fā)明所述的方法對(duì)受試者血清的代謝物譜進(jìn)行分析，代謝物譜中的質(zhì)量數(shù)值指示相應(yīng)生物標(biāo)志物的存在及在代謝物譜中的對(duì)應(yīng)位置。同時(shí)，肺癌患者的所述生物標(biāo)志物在其代謝物譜中表現(xiàn)出一定的含量范圍值。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0018]圖1.液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用主成分分析得分圖。菱形代表正常組，正方形代表肺癌術(shù)前組，圓形代表肺癌術(shù)后組。
[0019]圖2.氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用主成分分析得分圖。菱形代表正常組，正方形代表肺癌術(shù)前組，圓形代表肺癌術(shù)后組。
[0020]圖3.液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用PLS-DA模型。菱形代表正常組，正方形代表肺癌術(shù)前組，圓形代表肺癌術(shù)后組。
[0021]圖4.氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用PLS-DA模型。菱形代表正常組，正方形代表肺癌術(shù)前組，圓形代表肺癌術(shù)后組。
[0022]圖5.液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用OPLS得分圖。形代表正常組，正方形代表肺癌術(shù)前組，圓形代表肺癌術(shù)后組。
[0023]圖6.氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用OPLS得分圖。形代表正常組，正方形代表肺癌術(shù)前組，圓形代表肺癌術(shù)后組。
【具體實(shí)施方式】
[0024]下面結(jié)合實(shí)施例進(jìn)一步描述本發(fā)明。
[0025]I樣本收集:收集健康正常體檢者和肺癌患者手術(shù)前及術(shù)后7天空腹血標(biāo)本各5mL于無菌促凝BD真空采血管中，2500rpm，4°C離心5min，取上層血清，保存于_80°C冰箱中待用。正常組共收集30份血清樣本，肺癌術(shù)前及術(shù)后組各收集30份血清樣本。
[0026]2液相色譜質(zhì)譜測(cè)定樣本的處理:將低溫保存的血清樣本置室溫解凍搖勻，取100 μ L的樣本加入300 μ L甲醇，渦漩震蕩30s，4°C靜置20min ;所有樣本進(jìn)行冷凍離心(12000rpm, 4°C，15min)，取200 μ L上清液，轉(zhuǎn)入進(jìn)樣小瓶備用。
[0027]3氣相色譜質(zhì)譜測(cè)定樣本的處理:將低溫保存的血清樣本置室溫解凍搖勻，取100 μ L的樣本加入300 μ L甲醇，渦漩震蕩30s，4°C靜置20min ;所有樣本進(jìn)行冷凍離心(12000rpm, 4°C，15min)，取150 μ L上清液，轉(zhuǎn)入玻璃衍生小瓶，加入IOyL的內(nèi)標(biāo)溶液(二氯苯丙氨酸，濃度為0.02mg/mL)，置溫和氮?dú)庀麓蹈?°C ;向玻璃衍生小瓶中加入30 μ L的20mg/mL甲氧胺鹽酸吡啶溶液，強(qiáng)烈震蕩30s，于37°C肟化反應(yīng)90min ;取出后加入30 μ L的BSTFA (含1%TMCS)的衍生試劑，于70°C反應(yīng)60min。取出樣本，室溫放置30min，轉(zhuǎn)入進(jìn)樣小瓶備用。
[0028]4液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用分析
[0029]儀器設(shè)備:Agilent,1290InfinityLC, 6530UHDandAccurate-MassQ-T0F/MS
[0030]色譜條件:色譜柱:AgilentC18色譜柱(IOOmmX 2.1mm，1.8 μ m)，流速 0.4mL/min，柱溫為40°C，流動(dòng)相A:0.1%甲酸-7jC，B:0.1%甲酸-乙腈，進(jìn)樣量為4 μ L，自動(dòng)進(jìn)樣器溫度 4°C。梯度洗脫程序:0 ?2min，5% B，2 ?17min，5%?95% B, 17 ?19min，95% B。
[0031]質(zhì)譜條件:ESI離子源，采用正離子掃描模式，以氮?dú)庾鳛殪F化、錐孔氣。毛細(xì)管電壓4kV、錐孔電壓35kV、離子源溫度100°C ;脫溶劑氣溫度350°C、反向錐孔氣流50L/h、脫溶劑氣600L/h、萃取錐孔4V。離子掃描時(shí)間0.03s，掃描時(shí)間間隔0.02s，數(shù)據(jù)采集范圍:50_1000m/z。
[0032]5氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用分析
[0033]儀器設(shè)備:Agilent7890A/5975CGC/MS系統(tǒng)
[0034]氣相色譜-質(zhì)譜條件:毛細(xì)管色譜柱為AgilentJ&WScientific公司的HP_5ms(30mX0.25mmX0.25ym)0儀器參數(shù)設(shè)定為:進(jìn)樣口溫度280°C，EI離子源溫度230°C，四極桿溫度150°C，高純氦氣(純度大于99.999%)作為載氣，不分流進(jìn)樣，進(jìn)樣量l.0yL。升溫程序?yàn)?初始溫度80°C，維持2min，10°C /min的速度升至320°C，并維持6min。采用全掃描模式進(jìn)行質(zhì)譜檢測(cè)，質(zhì)譜檢測(cè)范圍為50-550 (m/z)。
[0035]6數(shù)據(jù)處理
[0036]6.1液相色譜質(zhì)譜測(cè)定
[0037]米用AgilentMassHunter 工作站(QualitativeAnalysisVB03.01，Agilent, USA)記錄每個(gè)血清樣本的總離子流色譜圖(TIC)進(jìn)行可視化檢查。在R軟件平臺(tái)下采用自寫的程序代碼提取原始數(shù)據(jù)信號(hào)(峰識(shí)別和積分)，然后進(jìn)行保留時(shí)間校正、峰對(duì)齊和反卷積分析(質(zhì)譜碎片歸屬)，最后在Excel軟件中進(jìn)行后期編輯，將結(jié)果組織為二維數(shù)據(jù)矩陣，包括變量(保留時(shí)間Rt，質(zhì)荷比m/z)、觀察量(樣本)和積分面積。將編輯后的數(shù)據(jù)矩陣導(dǎo)入Simca-Pll.0軟件進(jìn)行主成分分析(PCA)、偏最小二乘方判別分析(PLS-DA)和正交偏最小二乘方分析(0PLS)。按照OPLS的VIP值挖掘差異代謝物質(zhì)，運(yùn)用兩樣本的t檢驗(yàn)分別比較正常對(duì)照組和肺癌組的代謝產(chǎn)物水平。以肺癌組與正常對(duì)照組的均值之比的對(duì)數(shù)值(以2為底)fold(B/A)表示該物質(zhì)在肺癌患者的相對(duì)水平,正號(hào)表示該物質(zhì)在肺癌患者中升高，負(fù)號(hào)表示該物質(zhì)在肺癌患者中降低。差異性代謝物的定性方法為:搜索代謝物二級(jí)質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫(METLIN)，比較質(zhì)譜的質(zhì)荷比m/z或者精確分子質(zhì)量mass。
[0038]6.2氣相色譜質(zhì)譜測(cè)定
[0039]米用AgilentMassHunter 工作站(QualitativeAnalysisVB03.01，Agilent, USA)記錄每個(gè)血清樣本的總離子流色譜圖(TIC)進(jìn)行可視化檢查。在R軟件平臺(tái)下采用自寫的程序代碼提取原始數(shù)據(jù)信號(hào)(峰識(shí)別和積分)，然后進(jìn)行保留時(shí)間校正、峰對(duì)齊和反卷積分析(質(zhì)譜碎片歸屬)，最后在Excel軟件中進(jìn)行后期編輯，將結(jié)果組織為二維數(shù)據(jù)矩陣，包括變量(保留時(shí)間Rt，質(zhì)荷比m/z)、觀察量(樣本)和積分面積。將編輯后的數(shù)據(jù)矩陣導(dǎo)入Simca-Pll.0軟件進(jìn)行主成分分析(PCA)、偏最小二乘方判別分析(PLS-DA)和正交偏最小二乘方分析(0PLS)。按照OPLS的VIP值挖掘差異代謝物質(zhì)，運(yùn)用兩樣本的t檢驗(yàn)分別比較正常對(duì)照組和肺癌組的代謝產(chǎn)物水平。以肺癌組與正常對(duì)照組的均值之比的對(duì)數(shù)值(以2為底)fold(B/A)表示該物質(zhì)在肺癌患者的相對(duì)水平,正號(hào)表示該物質(zhì)在肺癌患者中升高，負(fù)號(hào)表示該物質(zhì)在肺癌患者中降低。差異性代謝物的定性方法為:搜索自建的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)數(shù)據(jù)庫和NIST商業(yè)數(shù)據(jù)庫(比較質(zhì)譜和色譜保留時(shí)間RT)。
[0040]7代謝譜分析和潛在的生物標(biāo)志物
[0041]7.1主成分分析(PCA)[0042]7.1.1液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用測(cè)定
[0043]主成分分析作為無監(jiān)督式學(xué)習(xí)方法，可以真實(shí)反映樣本的聚類情況。對(duì)3組樣本正模式下得到的數(shù)據(jù)進(jìn)行PCA分析，共獲得7個(gè)主成分(PC)，R2X=0.582，Q2=0.425。一般來說R2X值大于0.4就表示該模型可靠，因此本項(xiàng)目建立的模型可以應(yīng)用于可視化觀察3組之間的代謝譜差異。PCA得分圖(Scoresplot)如圖la，模式下PCA得分圖均可以看出大部分樣本都在95%的置信區(qū)間，并且三組樣本之間可以明顯區(qū)分，并且組內(nèi)樣本比較集中，整體模型比較理想。
[0044]對(duì)正常對(duì)照組和肺癌術(shù)前組樣本正模式下得到的數(shù)據(jù)進(jìn)行PCA分析，共獲得4個(gè)主成分(PC)，R2X=0.556，Q2=0.419。一般來說R2X值大于0.4就表示該模型可靠，因此本項(xiàng)目建立的模型可以應(yīng)用于可視化觀察2組之間的代謝譜差異。PCA得分圖(Scoresplot)如圖lb。
[0045]對(duì)正常對(duì)照組和肺癌術(shù)后組組樣本正模式下得到的數(shù)據(jù)進(jìn)行PCA分析，共獲得7個(gè)主成分(PC)，R2X=0.552，Q2=0.319。一般來說R2X值大于0.4就表示該模型可靠，因此本項(xiàng)目建立的模型可以應(yīng)用于可視化觀察3組之間的代謝譜差異。PCA得分圖(Scoresplot)如圖lc。
[0046]對(duì)肺癌術(shù)前組和肺癌術(shù)后組樣本正模式下得到的數(shù)據(jù)進(jìn)行PCA分析，共獲得7個(gè)主成分(PC)，R2X=0.62，Q2=0.4。一般來說R2X值大于0.4就表示該模型可靠，因此本項(xiàng)目建立的模型可以應(yīng)用于可視化觀察2組之間的代謝譜差異。PCA得分圖(Scoresplot)如圖1d0
[0047]7.1.2氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用測(cè)定
[0048]首先對(duì)整體數(shù)據(jù)進(jìn)行評(píng)價(jià)，檢查是否達(dá)到代謝組學(xué)分析的標(biāo)準(zhǔn)。Simca-P軟件中，數(shù)據(jù)均采用默認(rèn)的UV格式化和平均中心化處理，以獲得更加可靠且更加直觀的結(jié)果。軟件對(duì)整體數(shù)據(jù)進(jìn)行模型擬合分析，血清共獲得10個(gè)主成分，R2X=0.801，Q2=0.652。PCA得分圖(Scoresplot)如圖2a所示；樣本大部分處于95%置信區(qū)間內(nèi)，因此當(dāng)前PCA模型能可靠地用于解釋樣本之間的代謝差異。從圖1a中可以看出，正常對(duì)照組與肺癌術(shù)前組明顯通過第2主成分劃分為上下兩部分，而肺癌術(shù)后組大部分處于上方，即其分析結(jié)果更接近正常對(duì)照組。通過非監(jiān)督式的統(tǒng)計(jì)分析，初步可以判斷其術(shù)后的代謝狀態(tài)更趨于正常。
[0049]對(duì)正常對(duì)照組和肺癌術(shù)前組樣本正模式下得到的數(shù)據(jù)進(jìn)行PCA分析，共獲得8個(gè)主成分，R2X=0.787，Q2=0.64。PCA得分圖(Scoresplot)如圖2b所示，樣本基本處于95%置信區(qū)間內(nèi)。一般來說R2X值大于0.4就表示該模型可靠，因此當(dāng)前PCA模型能可靠地用于解釋兩組樣本之間的代謝差異。
[0050]對(duì)正常對(duì)照組和肺癌術(shù)后組組樣本正模式下得到的數(shù)據(jù)進(jìn)行PCA分析，共獲得9個(gè)主成分，R2X=0.805，Q2=0.627。PCA得分圖(Scoresplot)如圖2c所示，樣本基本處于95%置信區(qū)間內(nèi)。一般來說R2X值大于0.4就表示該模型可靠，因此當(dāng)前PCA模型能可靠地用于解釋兩組樣本之間的代謝差異。
[0051]對(duì)肺癌術(shù)前組和肺癌術(shù)后組樣本正模式下得到的數(shù)據(jù)進(jìn)行PCA分析，共獲得12個(gè)主成分，R2X=0.843，Q2=0.626。PCA得分圖如圖2d所示，樣本基本處于95%置信區(qū)間內(nèi)。一般來說R2X值大于0.4就表示該模型可靠，因此當(dāng)前PCA模型能可靠地用于解釋兩組樣本之間的代謝差異。[0052]7.2偏最小二乘方判別分析(PLS-DA)
[0053]7.2.1液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用測(cè)定
[0054]進(jìn)一步采用有監(jiān)督式方法PLS-DA進(jìn)行建模分析，模型的參數(shù)R2Y表示模型的解釋率，Q2表示模型的預(yù)測(cè)率，一般來說此參數(shù)大于0.4即表明此模型可靠。結(jié)果正常對(duì)照組和肺癌術(shù)前組正模式下得到4個(gè)主成分，R2X=0.527，R2Y=0.991，Q2=0.938，PLS-DA得分圖如圖3a所示。
[0055]正常對(duì)照組和肺癌術(shù)后組正模式下得到4個(gè)主成分，R2X=0.412，R2Y=0.992，Q2=0.935，PLS-DA得分圖如圖3b所示。
[0056]肺癌術(shù)前組和肺癌術(shù)后組正模式下得到2個(gè)主成分，R2X=0.432，R2Y=0.906，Q2=0.875，PLS-DA得分圖如圖3c所示。
[0057]7.2.2氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用測(cè)定
[0058]進(jìn)一步采用有監(jiān)督式方法PLS-DA進(jìn)行建模分析，正常對(duì)照組和肺癌術(shù)前組共獲得3個(gè)主成分，R2X=0.533，R2Y=0.854，Q2=0.747，R2Y及Q2值大于0.4就表示該模型可靠，得分圖如圖4a所示。
[0059]正常對(duì)照組和肺癌術(shù)后組正模式下共獲得3個(gè)主成分，R2X=0.518，R2Y=0.883，Q2=0.758，R2Y及Q2值大于0.4就表示該模型可靠，得分圖如圖4b所示。
[0060]肺癌術(shù)前組和肺癌術(shù)后組正模式下獲得5個(gè)主成分，R2X=0.605, R2Y=0.956，Q2=0.707，R2Y及Q2值大于0.4就表示該模型可靠，得分圖如圖4c所示。
[0061]7.3正交偏最小二乘法判別分析(OPLS-DA)
[0062]7.3.1液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用測(cè)定
[0063]采用OPLS-DA方法來區(qū)分正常對(duì)照組、肺癌術(shù)前組和肺癌術(shù)后組，進(jìn)一步通過VIP值和t檢驗(yàn)篩選潛在標(biāo)志物。正常對(duì)照組和肺癌術(shù)前組正模式下得到I個(gè)主成分和I個(gè)正交成分，R2X=0.468，R2Y=0.936，Q2=0.898，其得分圖如圖5a所示，通過OPLS分析，得分圖的效果上看，兩組樣本在正離子模式下能夠很好的分離，并且分正常對(duì)照組的樣本處在主成分I (PCl)的左側(cè)，而肺癌術(shù)前組樣本處在主成分I (PCl)的右側(cè)。
[0064]正常對(duì)照組和肺癌術(shù)后組正模式下得到I個(gè)主成分和I個(gè)正交成分，R2X=0.326，R2Y=0.937，Q2=0.899，其得分圖如圖5b所示:通過OPLS分析，得分圖的效果上看，兩組樣本在正離子模式下能夠很好的分離，并且正常對(duì)照組組的樣本處在主成分I(PCl)的左側(cè)，而肺癌術(shù)后組樣本處在主成分I (PCl)的右側(cè)。
[0065]肺癌術(shù)前組和肺癌術(shù)后組正模式下得到I個(gè)主成分和I個(gè)正交成分，R2X=0.432，R2Y=0.906，Q2=0.865，其得分圖如圖5c所示:通過OPLS分析，得分圖的效果上看，兩組樣本在正離子模式下能夠很好的分離，并且肺癌術(shù)前組的樣本處在主成分I (PCl)的左側(cè)，而肺癌術(shù)后組樣本處在主成分I (PCl)的右側(cè)。
[0066]7.3.2氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用測(cè)定
[0067]采用OPLS-DA方法來區(qū)分正常對(duì)照組、肺癌術(shù)前組和肺癌術(shù)后組，進(jìn)一步通過VIP值和t檢驗(yàn)篩選潛在標(biāo)志物。正常對(duì)照組和肺癌術(shù)前組正模式下共獲得I個(gè)主成分和I個(gè)正交成分，R2X=0.46，R2Y=0.797，Q2=0.745，R2Y及Q2值大于0.4就表示該模型可靠，得分圖如圖6a所示。
[0068]正常對(duì)照組和肺癌術(shù)后組正模式下共獲得I個(gè)主成分和2個(gè)正交成分，R2X=0.518，R2Y=0.883，Q2=0.767，R2Y及Q2值大于0.4就表示該模型可靠，得分圖如圖6b所
/Jn ο
[0069]肺癌術(shù)前組和肺癌術(shù)后組正模式下共獲得I個(gè)主成分和I個(gè)正交成分，R2X=0.457，R2Y=0.68，Q2=0.57，R2Y及Q2值大于0.4就表示該模型可靠，得分圖如圖6c所示。
[0070]7.4潛在生物標(biāo)記物
[0071]7.4.1液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用測(cè)定
[0072]根據(jù)模式識(shí)別模型OPLS-DA的VIP值篩選潛在標(biāo)志物，在OPLS-DA模型中提取VIP值大于I的變量，以及結(jié)合P值小于0.05的變量。以肺癌術(shù)前/術(shù)后組與正常對(duì)照組的均值之比的對(duì)數(shù)值(以2為底)fold表示該物質(zhì)在肺癌患者的相對(duì)水平，正號(hào)表示該物質(zhì)在肺癌患者中升高，負(fù)號(hào)表示該物質(zhì)在肺癌患者中降低。差異性代謝物的定性方法為:搜索在線數(shù)據(jù)庫METLIN (比較質(zhì)譜的質(zhì)荷比m/z或者精確分子質(zhì)量mass)。正常對(duì)照組和肺癌術(shù)前組之間的差異代謝物如表1所示，肺癌術(shù)前組和肺癌術(shù)后組之間的差異代謝物如表2所示，正常對(duì)照組和肺癌術(shù)后組之間的差異代謝物如表3所示。對(duì)兩兩比較的差異代謝物進(jìn)行綜合分析，發(fā)現(xiàn)肺癌術(shù)前組、術(shù)后組與正常對(duì)照組相比，有多種代謝物的水平表現(xiàn)明顯異常，包括:鞘氨醇，氯磷膽堿，花生四烯乙醇胺，Y -亞油酸，十二烯二酸，阿魏酸，硫酸普拉睪酮，半乳糖醇磷酸，泛醌10和膽紅素。
[0073]表1正常對(duì)照組和肺癌術(shù)前組之間的差異代謝物
[0074]
【權(quán)利要求】
1.一種基于肺癌患者血清的液相/氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用代謝組學(xué)分析方法，包括: (1)樣品制備:收集臨床病人與正常人的血清樣本，經(jīng)處理去除蛋白質(zhì)等大分子后準(zhǔn)備進(jìn)行色譜檢測(cè)分析； (2)液相色譜質(zhì)譜和氣相色譜質(zhì)譜分析測(cè)定:采用基于液相色譜質(zhì)譜和氣相色譜質(zhì)譜的方法得到血清中的代謝物譜，并對(duì)代謝譜進(jìn)行分析； (3)模式識(shí)別分析血清中代謝物譜:上述數(shù)據(jù)采用多變量數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)軟件建立數(shù)學(xué)模型，對(duì)步驟(2)中產(chǎn)生的代謝物譜進(jìn)行分析，比較正常人與肺癌患者代謝物譜的差異，從而確定特異性代謝物譜。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的代謝組學(xué)分析方法，其特征在于，所述步驟(1)中的處理包括樣本經(jīng)過甲醇蛋白沉淀。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的代謝組學(xué)分析方法，其特征在于，所述步驟(2)中代謝物譜經(jīng)過處理得到原始數(shù)據(jù)， 所述原始數(shù)據(jù)優(yōu)選地是各個(gè)峰的峰高或者峰面積以及質(zhì)量數(shù)和保留時(shí)間等數(shù)據(jù)。
4.根據(jù)權(quán)利要求4所述的代謝組學(xué)分析方法，其特征在于，所述步驟(2)中，對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行峰檢測(cè)和峰匹配，優(yōu)選地采用R軟件平臺(tái)下采用自寫的程序代碼進(jìn)行所述峰檢測(cè)和峰匹配。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的代謝組學(xué)分析方法，其特征在于，所述步驟(3)中的多變量數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)軟件Simca-Pll.0，選用主成分分析(PCA)、偏最小二乘方判別分析(PLS-DA)、正交偏最小二乘方分析(OPLS)等方法建立數(shù)學(xué)模型，比較正常人與肺癌患者手術(shù)前后代謝物譜的差異，從而確定特異性代謝物譜。
6.根據(jù)權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)所述的代謝組學(xué)分析方法，其特征在于，所述步驟(1)中的樣本收集具體為:收集健康正常體檢者和肺癌患者手術(shù)前及術(shù)后7天空腹血標(biāo)本各5 mL于無菌促凝BD真空采血管中，2500 rpm，4°C離心5 min，取上層血清，保存于-80 °C冰箱中待用。
7.根據(jù)權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)所述的代謝組學(xué)分析方法，其特征在于，所述步驟(1)中進(jìn)行液相色譜質(zhì)譜測(cè)定樣本的處理為:將低溫保存的血清樣本置室溫解凍搖勻，取100 UL的樣本加入300 UL甲醇，渦漩震蕩30 s,4 °C靜置20 min ;所有樣本進(jìn)行冷凍離心(12000rpm,4 °C, 15 min)，取200 μ L上清液，轉(zhuǎn)入進(jìn)樣小瓶備用。
8.根據(jù)權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)所述的代謝組學(xué)分析方法，其特征在于，所述步驟(1)中進(jìn)行氣相色譜質(zhì)譜測(cè)定樣本的處理為:將低溫保存的血清樣本置室溫解凍搖勻，取100 UL的樣本加入300 μ L甲醇，渦漩震蕩30 s,4 °C靜置20 min ;所有樣本進(jìn)行冷凍離心(12000rpm,4 °C, 15 min)，取150 μ L上清液，轉(zhuǎn)入玻璃衍生小瓶，加入10 yL的內(nèi)標(biāo)溶液(二氯苯丙氨酸，濃度為0.02 mg/mL)，置溫和氮?dú)庀麓蹈? °C;向玻璃衍生小瓶中加入30 yL的20 mg/mL甲氧胺鹽酸吡啶溶液，強(qiáng)烈震蕩30 S，于37 1:肟化反應(yīng)90 min ;取出后加入30μ L的BSTFA (含1%TMCS)的衍生試劑，于70 °C反應(yīng)60 min，取出樣本，室溫放置30 min,轉(zhuǎn)入進(jìn)樣小瓶備用。
9.根據(jù)權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)所述的代謝組學(xué)分析方法，其特征在于，所述步驟(2)中液相色譜-質(zhì)譜條件為:Agilent C18色譜柱(100 mm X 2.1 mm, 1.8 μπι),流速0.4 mL/min，柱溫為40 °C，流動(dòng)相A:0.1%甲酸-水，B:0.1%甲酸-乙腈，進(jìn)樣量為4 yL，自動(dòng)進(jìn)樣器溫度4 °C ；ESI離子源，采用正離子掃描模式，以氮?dú)庾鳛殪F化、錐孔氣；毛細(xì)管電壓4kV、錐孔電壓35 kV、離子源溫度100 °C;脫溶劑氣溫度350 °C、反向錐孔氣流50 L/h、脫溶劑氣600 L/h、萃取錐孔4 V;離子掃描時(shí)間0.03 S，掃描時(shí)間間隔0.02 S，數(shù)據(jù)采集范圍:50-1000 m/zo
10.根據(jù)權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)所述的代謝組學(xué)分析方法，其特征在于，所述步驟(2)中氣相色譜-質(zhì)譜條件為:毛細(xì)管色譜柱為Agilent J&ff Scientific公司的HP_5ms(30 mX 0.25 mm X 0.25 μ m)，儀器參數(shù)設(shè)定為:進(jìn)樣口溫度280 °C，EI離子源溫度230 °C，四極桿溫度150 °C，高純氦氣(純度大于99.999%)作為載氣，不分流進(jìn)樣，進(jìn)樣量1.0 μ L ;升溫程序?yàn)?初始溫度80 °C，維持2 min, 10 °C/min的速度升至320 °C，并維持6 min ;采用全掃描模式進(jìn)行質(zhì)譜檢測(cè)，質(zhì)譜檢測(cè)范圍為50-550 (m/z)。
11.根據(jù)權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)所述的代謝組學(xué)分析方法，其特征在于，所述步驟(2)中米用 Agilent MassHunter 工作站(Qualitative Analysis VB 03.01, Agilent, USA)記錄每個(gè)血清樣本的總離子流色譜圖(TIC)進(jìn)行可視化檢查，在R軟件平臺(tái)下采用自寫的程序代碼提取原始數(shù)據(jù)信號(hào)(峰識(shí)別和積分)，然后進(jìn)行保留時(shí)間校正、峰對(duì)齊和反卷積分析(質(zhì)譜碎片歸屬)，最后在Excel軟件中進(jìn)行后期編輯，將結(jié)果組織為二維數(shù)據(jù)矩陣，包括變量(保留時(shí)間Rt，質(zhì)荷比m/z )、觀察量(樣本)和積分面積。
12.根據(jù)權(quán)利要求1-11中任一項(xiàng)所述的代謝組學(xué)分析方法建立的肺癌患者血清特異性代謝產(chǎn)物譜。
13.根據(jù)權(quán)利要求12中任一項(xiàng)所述的代謝組學(xué)分析方法建立的肺癌患者血清特異性代謝產(chǎn)物譜的用途。`
【文檔編號(hào)】G01N30/06GK103616450SQ201310629077
【公開日】2014年3月5日 申請(qǐng)日期:2013年11月29日 優(yōu)先權(quán)日:2013年11月29日
【發(fā)明者】鐘婧, 鄭淑鶯, 戴利成 申請(qǐng)人:湖州市中心醫(yī)院