專利名稱：一種檢測(cè)尿液中心臟型脂肪酸結(jié)合蛋白診斷試紙的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于免疫化學(xué)檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種借助膠體金標(biāo)記顯色的免疫層析反應(yīng)，用來快速檢測(cè)尿液中心臟型脂肪酸結(jié)合蛋白的診斷試紙的制備方法。
背景技術(shù)：
急性心肌梗死(acute myocardial infarction, AMI)是常見的心血管疾病，有較高的發(fā)病率及病死率。最新的AMI診斷建議是以心肌壞死標(biāo)志物為基礎(chǔ)指標(biāo)，結(jié)合病史、心電圖、影像學(xué)改變、PCI、冠脈造影、心肌生化標(biāo)志物的新診斷標(biāo)準(zhǔn)。心臟型脂肪酸結(jié)合蛋白(heart-typefatty acid binding protein, H-FABP)作為心肌損傷標(biāo)志物，具有較高的敏感性和特異性，正在逐漸得到臨床醫(yī)生的認(rèn)可，成為AMI 早期診斷的有效指標(biāo)。H-FABP是一種可溶性細(xì)胞質(zhì)蛋白，特異地存在于心肌組織中，分子量?jī)H為14 15KD，正常人的血漿和尿中幾乎不含有H-FABP。當(dāng)心肌缺血或受損后，H-FABP被迅速釋放入血，并原樣從腎臟清除、尿液中排出；H-FABP在血中1.4士0.證達(dá)峰值，在尿中3士0. 6h 達(dá)峰值，可見尿液H FABP與血漿H FABP對(duì)早期急性心肌梗塞(AMI)具有同等的診斷價(jià)值。目前臨床檢測(cè)H-FABP的手段，均以血清或血漿為檢測(cè)樣本，采用雙抗體夾心 ELISA試劑盒等檢測(cè)方法，檢測(cè)時(shí)間長，采集血樣需進(jìn)行分離處理，易發(fā)生溶血現(xiàn)象，不能滿足為確定或排除心?？焖偬峁┙Y(jié)果的要求。

發(fā)明內(nèi)容
鑒于現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的目的在于通過對(duì)心臟型脂肪酸結(jié)合蛋白的檢測(cè)技術(shù)研究，提供了一種檢測(cè)尿液中心臟型脂肪酸結(jié)合蛋白的診斷試紙及其制備方法。該診斷試紙不僅特異性強(qiáng)，靈敏度高，不需要任何的輔助儀器，而且所需檢測(cè)樣品為尿液，方便患者自行取樣，具有無創(chuàng)性的優(yōu)點(diǎn)；同時(shí)，檢測(cè)時(shí)間僅需5分鐘，為確定或排除心肌梗死提供了方便快捷的方法，為早期治療爭(zhēng)取了寶貴的時(shí)間。本發(fā)明的目的是這樣實(shí)現(xiàn)的一種檢測(cè)尿液中心臟型脂肪酸結(jié)合蛋白診斷試紙， 其特征在于樣品墊、硝酸纖維素膜、吸收墊依次粘附在底板上，金標(biāo)結(jié)合墊放在樣品墊上， 在上層覆蓋PE標(biāo)簽保護(hù)膜組裝而成；其中金標(biāo)結(jié)合墊上包被有膠體金標(biāo)記的H-FABP小鼠單抗；硝酸纖維素膜上分別包被有H-FABP小鼠單抗構(gòu)成的檢測(cè)線T線和包被有H-FABP 二抗構(gòu)成的質(zhì)控線C線。本發(fā)明的目的還可以這樣實(shí)現(xiàn)所述的金標(biāo)結(jié)合墊上包被有膠體金標(biāo)記的 H-FABP小鼠單抗的制備方法如下所述的金標(biāo)結(jié)合墊上包被膠體金標(biāo)記的H-FABP小鼠單抗的制備方法如下(1)取膠體金溶液，用0. IM碳酸鉀溶液調(diào)整PH為8. 0-9. 0，攪拌5min ；逐滴加入 H-FABP小鼠單抗，繼續(xù)攪拌30min，加入5 %的牛血清白蛋白使其終濃度為1 %，攪拌15min， 靜止Ih后，4°C保存?zhèn)溆茫?br> (2)將上述(1)步驟制備的金標(biāo)H-FABP抗體結(jié)合物在12000rpm、4°C條件下，離心 30min，棄上清液，沉淀物用含BSA、0. 02% NaN3的PB液，將沉淀重懸為原體積的1/10， 4°C保存，將金標(biāo)H-FABP抗體結(jié)合物噴涂于玻璃纖維膜上，室溫干燥。(3)將上述⑵步驟制備的金標(biāo)H-FABP抗體結(jié)合物噴涂于玻璃纖維膜上，室溫干燥后，將膜用0. 05mol/L PH8. 0-9. 0的TBS浸洗3次，每次3min，用去離子水沖洗一次，浸入 0. 05mol/L PH3. 0-5. 0的檸檬酸緩沖液平衡5min，浸入37°C銀染液中20-30min，將膜取出， 用去離子水沖洗，放入定影液lmin，去離子水沖洗，空氣干燥。所述的硝酸纖維素膜上包被有H-FABP小鼠單抗構(gòu)成的檢測(cè)線T線是將H-FABP小鼠單抗噴涂于硝酸纖維素膜上，室溫干燥后作為檢測(cè)線T線。所述的硝酸纖維素膜上包被有H-FABP 二抗構(gòu)成的質(zhì)控線C線是將H-FABP 二抗噴涂于硝酸纖維素膜上，室溫干燥后作為質(zhì)控線C線。所述的底板是PVC板。本發(fā)明一種檢測(cè)尿液中心臟型脂肪酸結(jié)合蛋白診斷試紙的制備方法，其特征在于(一)金標(biāo)結(jié)合墊的制備1)膠體金顆粒的制備取0. 01% HAuCl4水溶液100ml，加入1 %枸櫞酸三鈉水溶液anl，加熱煮沸15min-30min，直至顏色變紅；室溫冷卻后加入0. IMol/L K2CO3O. 5ml，混勻即得直徑約15nm的膠體金顆粒，4°C保存；2)膠體金與H-FABP小鼠單抗用量比例的確定a、取IOml膠體金溶液，用0. IM碳酸鉀溶液調(diào)整PH為8. 0-9. 0，攪拌5min，分裝10 管，每管Iml ；b、將H-FABP小鼠單抗以0. 005Mol/L pH9. 0硼酸鹽緩沖液做系列稀釋為5 μ g/ ml-50y g/ml，分別取1ml，加入上述膠體金溶液中，混勻；對(duì)照管只加Iml稀釋液；c、5min后，在上述各管中加入0. Iml 10% NaCl溶液，混勻后靜置濁，觀察結(jié)果；d、結(jié)果觀察，對(duì)照管和加入H-FABP小鼠單抗的量不足以穩(wěn)定膠體金的各管，均呈現(xiàn)出由紅變藍(lán)的聚沉現(xiàn)象；而加入H-FABP小鼠單抗量達(dá)到或超過最低穩(wěn)定量的各管仍保持紅色不變；以穩(wěn)定Iml膠體金溶液紅色不變的最低H-FABP小鼠單抗用量，即為H-FABP小鼠單抗的最低用量；3)膠體金標(biāo)記H-FABP抗體的制備、純化a、取IOml膠體金溶液，用0. IM碳酸鉀溶液調(diào)整PH為8. 0-9. 0，攪拌5min ；逐滴加入H-FABP小鼠單抗繼續(xù)攪拌30min，加入5%的牛血清白蛋白(BSA)使其終濃度為1%，攪拌15min，靜止Ih后，4°C保存?zhèn)溆茫籦、純化將上述膠體金H-FABP抗體結(jié)合物在12000rpm、4°C條件下，離心30min。 棄上清液，沉淀物用含BSA、0. 02% NaN3的PB液，將沉淀重懸為原體積的1/10，4°C保存 4)銀染色的處理將純化后的金標(biāo)H-FABP小鼠抗體結(jié)合物噴涂于玻璃纖維膜上， 室溫干燥后將膜用0. 05mol/L PH7. 0-9. OTBS浸洗3次，每次;3min，用去離子水沖洗一次，浸入0. 05mol/L PH3. 0-5. 0檸檬酸緩沖液平衡5min，浸入37°C的銀染液中20-30min，將膜取出，用去離子水沖洗，放入定影液lmin，去離子水沖洗，空氣干燥，4°C保存?zhèn)溆茫患吹媒饦?biāo)結(jié)合墊⑵；( 二)包被檢測(cè)線T線和質(zhì)控線C線的硝酸纖維素膜的制備將H-FABP小鼠單抗和H-FABP 二抗分別噴涂于硝酸纖維素膜上，室溫干燥，作為檢測(cè)線T線和質(zhì)控線C線，密封，4°C保存?zhèn)溆茫?三)試紙的組裝底板從一端依次粘貼樣品墊、硝酸纖維素膜，吸收墊，金標(biāo)結(jié)合墊放在樣品墊上，然后在上層覆蓋PE標(biāo)簽保護(hù)膜組裝而成。與H-FABP的現(xiàn)有檢測(cè)方法相比，本發(fā)明涉及的檢測(cè)尿液中心臟型脂肪酸結(jié)合蛋白的診斷試紙條具有如下優(yōu)點(diǎn)和顯著的進(jìn)步(1)檢測(cè)樣品無需處理以尿液為檢測(cè)樣品，尿液H-FABP含量與血漿H-FABP含量對(duì)早期急性心梗(AMI)具有同等的診斷價(jià)值，病人可自行采集尿液，且樣品可直接進(jìn)行檢測(cè)，無需前期處理，省略了以血清或血漿為樣本需要對(duì)采集血樣進(jìn)行處理的過程，避免了樣品處理過程中可能出現(xiàn)的溶血現(xiàn)象導(dǎo)致樣品不能使用的問題，具有方便和無創(chuàng)性的優(yōu)點(diǎn)；(2)檢測(cè)速度快檢測(cè)時(shí)間只需5分鐘，能夠快速為診斷提供判斷依據(jù)；(3)檢測(cè)準(zhǔn)確率高、特異性強(qiáng)采用本發(fā)明方法所制H-FABP試紙與H-FABP ELISA 試劑盒分別對(duì)113例臨床尿樣的進(jìn)行平行檢測(cè)，對(duì)比檢測(cè)結(jié)果表明，試紙檢測(cè)結(jié)果的符合率為97. 35%，特異性為96. 3%。檢測(cè)結(jié)果見表1檢測(cè)結(jié)果表1
_金標(biāo)免疫層析試紙-
ELISA 法陽性_26_2_
陰性18

圖1 心臟型脂肪酸結(jié)合蛋白(H-FABP)檢測(cè)試紙條的結(jié)構(gòu)示意圖1-樣品墊2-金標(biāo)結(jié)合墊3-硝酸纖維素膜4-吸收墊5-底板6-檢測(cè)線T 線7-質(zhì)控線C線圖2 心臟型脂肪酸結(jié)合蛋白(H-FABP)檢測(cè)試紙條結(jié)果判定示意圖A陰性B陽性C無效
具體實(shí)施例方式本發(fā)明所依據(jù)的原理是人尿液擴(kuò)散通過附著紅色金顆粒包被的抗體的濾膜，與濾膜中的包被抗體結(jié)合，在檢測(cè)線T線區(qū)域內(nèi)，H-FABP抗原-抗體復(fù)合物開始與包被在檢測(cè)線T線區(qū)內(nèi)的抗體接觸，如果尿液中H-FABP濃度大于lOng/ml，在檢測(cè)線T線區(qū)內(nèi)抗原-抗體復(fù)合物被H-FABP單抗捕獲，并出現(xiàn)一條可見的紅色條帶。H-FABP濃度越高，檢測(cè)線T線區(qū)出現(xiàn)色帶的速度越快，色帶越深。紅色金顆粒包被的抗體擴(kuò)散到質(zhì)控線C線區(qū)域被H-FABP 第二抗體捕獲形成質(zhì)控區(qū)紅色帶。本發(fā)明涉及的一種檢測(cè)尿液中心臟型脂肪酸結(jié)合蛋白的診斷試紙條，由樣品墊1、
6金標(biāo)結(jié)合墊2、硝酸纖維素膜3、吸收墊4、底板5、檢測(cè)線T線6和質(zhì)控線C線7組成(參見圖1)。本發(fā)明涉及的一種檢測(cè)尿液中心臟型脂肪酸結(jié)合蛋白的診斷試紙條的制備方法， 包括以下步驟1、膠體金溶液及金標(biāo)抗體的制備采用檸檬酸三鈉還原法制備膠體金溶液，確定膠體金與H-FABP抗體用量的比例，制備金標(biāo)H-FABP抗體標(biāo)記物，采用低溫超速離心法純化金標(biāo)抗體；2、銀染色的處理將金標(biāo)H-FABP抗體噴涂于玻璃纖維膜上，然后用銀染液進(jìn)行染色，定影、干燥；將免疫金用銀染色加強(qiáng)后可以使顯色信號(hào)進(jìn)一步放大，其靈敏度可與酶聯(lián)免疫技術(shù)相當(dāng)，從而提高肉眼判斷結(jié)果的靈敏度和準(zhǔn)確性。3、檢測(cè)線T線和質(zhì)控線C線的制備H_FABP小鼠單抗和H-FABP 二抗分別噴涂于硝酸纖維素膜上，干燥，作為檢測(cè)線T線和質(zhì)控線C線；所述的二抗是指能和抗體結(jié)合的抗體，即抗體的抗體，其主要作用是檢測(cè)抗體的存在?！癏-FABP 二抗”可以是兔抗鼠H-FABP單抗，也可以是羊抗鼠H-FABP單抗，本發(fā)明采用兔抗鼠H-FABP單抗。4、試紙條的組裝將處理好的硝酸纖維素膜、玻璃纖維膜、樣品墊、吸收墊等材料按順序進(jìn)行粘貼、組裝、切條、密封，4°C保存。本發(fā)明涉及的一種檢測(cè)尿液中心臟型脂肪酸結(jié)合蛋白的診斷試紙的使用方法如下1、將試紙條垂直插入尿液樣品杯中，注意不要超過樣品墊，至少3秒鐘后取出平放于干凈的非吸附材料的平面，5分鐘觀察結(jié)果。2、結(jié)果判斷(參見圖2)1)陰性在質(zhì)控線C線出現(xiàn)一條紅色條帶，檢測(cè)線T線未出現(xiàn)紅色條帶，說明檢測(cè)樣品中無H-FABP存在；2)陽性在檢測(cè)線T線和質(zhì)控線C線處，各出現(xiàn)一條紅色條帶，判定為陽性；3)無效僅在檢測(cè)線T線顯色或在檢測(cè)線T線和質(zhì)控線C線均無明顯條帶出現(xiàn)， 視為試紙條檢測(cè)無效。質(zhì)控線C線與檢測(cè)線T線的色帶可因尿中H-FABP含量多少而顯現(xiàn)出顏色深淺，當(dāng) H-FABP濃度很高時(shí)檢測(cè)線T線很明顯，質(zhì)控線C線可能變得很弱，為正常結(jié)果。本發(fā)明試紙條特異性試驗(yàn)用本發(fā)明試紙條對(duì)肌鈣蛋白、C反應(yīng)蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液(濃度均為20ng/ml)、孕婦尿液和H-FABP標(biāo)準(zhǔn)溶液(20ng/ml)進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果僅H-FABP標(biāo)準(zhǔn)溶液出現(xiàn)明顯的檢測(cè)線和質(zhì)控線，其余樣品檢測(cè)均為陰性。說明該試紙條具有很好的特異性。本發(fā)明試紙條敏感性試驗(yàn)將H-FABP抗原進(jìn)行1 100倍稀釋后，按10倍遞減稀釋，然后用本發(fā)明試紙條對(duì)各稀釋液分別進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示，最低檢出量為1 1000，即lOng/ml。實(shí)施例1、膠體金顆粒的制備取0. 01% HAuCl4水溶液100ml，加入1 %枸櫞酸三鈉水溶液 anl，加熱煮沸15min 30min，直至顏色變紅。室溫冷卻后加入0. IMol/L K2CO3O. 5ml，混勻即得直徑約15nm的膠體金顆粒，4°C保存。
2、膠體金與H-FABP小鼠單抗用量比例的確定(1)取IOml膠體金溶液，用0. IM碳酸鉀溶液調(diào)整PH為8. 0-9. 0，攪拌5min，分裝 10管，每管1ml。(2)將H-FABP小鼠單抗以0. 005Mol/L pH9. 0硼酸鹽緩沖液做系列稀釋為5 μ g/ ml 50μ g/ml，分別取1ml，加入上述膠體金溶液中，混勻。對(duì)照管只加Iml稀釋液。(3)5min后，在上述各管中加入0. Iml 10% NaCl溶液，混勻后靜置2h，觀察結(jié)果。(4)結(jié)果觀察，對(duì)照管和加入H-FABP抗體的量不足以穩(wěn)定膠體金的各管，均呈現(xiàn)出由紅變藍(lán)的聚沉現(xiàn)象；而加入H-FABP抗體量達(dá)到或超過最低穩(wěn)定量的各管仍保持紅色不變。以穩(wěn)定Iml膠體金溶液紅色不變的最低H-FABP抗體用量，即為H-FABP抗體的最低用量，在實(shí)際工作中，可適當(dāng)增加10% 20%。3、膠體金標(biāo)記H-FABP抗體的制各、純化①取IOml膠體金溶液，用0. IM碳酸鉀溶液調(diào)整PH為8. 0-9. 0，攪拌5min ；逐滴加入H-FABP小鼠單抗繼續(xù)攪拌30min，加入5%的牛血清白蛋白(BSA)使其終濃度為1%，攪拌15min，靜止Ih后，放入4°C冰箱保存?zhèn)溆?。②純化將上述膠體金H-FABP抗體結(jié)合物在12000rpm、4°C條件下，離心30min。 棄上清液，沉淀物用含1 % BSA的PB液(含0. 02% NaN3)，PB液即phosphate buffer (磷酸緩沖溶液)，將沉淀重懸為原體積的1/10，4°C保存?zhèn)溆谩?、銀染色的處理將金標(biāo)H-FABP抗體噴涂于玻璃纖維膜上，室溫干燥后將膜用 0. O5mol/1PH7. 0-9. Otbs 浸洗 3 次(TBS 是指 Tris 緩沖生理鹽水(TrisBuffered，Saline, TBS) Tris是三羥甲基氨基甲烷的英文名)，每次3min，用去離子水沖洗一次，浸入0. 05mol/ 1 PH3. 0-5. 0檸檬酸緩沖液平衡5min，浸入37°C的銀染液中20-30min。將膜取出，用去離子水沖洗，放入定影液lmin，去離子水沖洗，空氣干燥。將免疫金用銀染色加強(qiáng)后可以使顯色信號(hào)進(jìn)一步放大，其靈敏度可與酶聯(lián)免疫技術(shù)相當(dāng)，從而提高肉眼判斷結(jié)果的靈敏度和準(zhǔn)確性。5、檢測(cè)線T線和質(zhì)控線C線的制備將H-FABP小鼠單抗和H-FABP 二抗分別噴涂于硝酸纖維素膜上，室溫干燥，作為檢測(cè)線τ線和質(zhì)控線C線，密封，4°C保存?zhèn)溆谩?、試紙條的組裝將處理好的硝酸纖維素膜、玻璃纖維膜、樣品墊、吸收墊等材料按順序進(jìn)行粘貼、組裝、切條、密封，4°C保存。參見附圖1。樣品墊1 置于試紙條的前端，用于進(jìn)樣，控制測(cè)試液的流速，以保證測(cè)試液以均勻的速度流入金標(biāo)結(jié)合墊，使金標(biāo)抗體與測(cè)試液中的H-FABP特異性地結(jié)合。所用材質(zhì)為玻
璃纖維膜。金標(biāo)結(jié)合墊2 是膠體金標(biāo)記物的承載體，測(cè)試液經(jīng)樣品墊流經(jīng)金標(biāo)結(jié)合墊時(shí)，膠體金結(jié)合物從金標(biāo)結(jié)合墊上釋放下來并與測(cè)試液中的H-FABP特異性地結(jié)合形成免疫復(fù)合物，然后隨測(cè)試液一起流向硝酸纖維素膜。選用材質(zhì)為玻璃纖維膜。硝酸纖維素膜3 (NC膜)是最終結(jié)果的顯示區(qū)域，一般有兩條線，檢測(cè)線T線和質(zhì)控線C線。吸收墊4 置于試紙條的末端，用于控制測(cè)試液的吸收量，增大流入試紙條的測(cè)試液的量，以沖洗掉NC膜上游離的膠體金結(jié)合物，從而減小背景干擾已提高靈敏度。所用材質(zhì)為植物纖維紙。
底板5 具有承載樣品墊，金標(biāo)結(jié)合墊，NC膜和吸收墊的作用，以形成真正的條狀， 便于測(cè)試操作。選用材質(zhì)為PVC板，涂布對(duì)生物活性分子具有惰性的壓敏膠。檢測(cè)線T線6 將H-FABP小鼠單抗噴涂在硝酸纖維素膜上做為檢測(cè)線，用于檢測(cè)測(cè)試液中的H-FABP抗原。質(zhì)控線C線7 將H-FABP 二抗噴涂在硝酸纖維素膜上做為質(zhì)控線，用于檢測(cè)膠體金結(jié)合物。底板5上依次粘貼樣品墊1、金標(biāo)結(jié)合墊2，硝酸纖維素膜3，吸收墊4，金標(biāo)結(jié)合墊 2上包被了 H-FABP抗體一膠體金標(biāo)記物，硝酸纖維素膜上噴涂H-FABP小鼠單抗做為檢測(cè)線T線和H-FABP 二抗做為質(zhì)控線C線。具體制作方法將金標(biāo)結(jié)合墊放在樣品墊上面，樣品墊粘在底板上、硝酸纖維素膜3 (NC膜)粘貼在底板5上，吸收墊4也貼在底板5上。從左至右依次相互交錯(cuò)2mm粘貼在底板5上、然后在上層覆蓋PE標(biāo)簽保護(hù)膜組裝而成的。切成2-4mm寬的試條，在4°C保存。
權(quán)利要求
1.一種檢測(cè)尿液中心臟型脂肪酸結(jié)合蛋白診斷試紙，其特征在于樣品墊(1)、硝酸纖維素膜(3)、吸收墊(4)依次粘附在底板( 上，金標(biāo)結(jié)合墊( 放在樣品墊(1)上，在上層覆蓋PE標(biāo)簽保護(hù)膜組裝而成；其中金標(biāo)結(jié)合墊( 上包被有膠體金標(biāo)記的H-FABP小鼠單抗；硝酸纖維素膜⑶上分別包被有H-FABP小鼠單抗構(gòu)成的檢測(cè)線T線(6)和包被有 H-FABP 二抗構(gòu)成的質(zhì)控線C線(7)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種檢測(cè)尿液中心臟型脂肪酸結(jié)合蛋白診斷試紙，其特征在于所述的金標(biāo)結(jié)合墊(2)上包被膠體金標(biāo)記的H-FABP小鼠單抗的制備方法如下(1)取膠體金溶液，用0.IM碳酸鉀溶液調(diào)整PH為8. 0-9. 0，攪拌5min ；逐滴加入H-FABP 小鼠單抗，繼續(xù)攪拌30min，加入5 %的牛血清白蛋白使其終濃度為1 %，攪拌15min，靜止Ih 后，4°C保存?zhèn)溆茫?2)將上述(1)步驟制備的金標(biāo)H-FABP抗體結(jié)合物在12000rpm、4°C條件下，離心 30min,棄上清液，沉淀物用含1 % BSA、0. 02% NaN3的PB液，將沉淀重懸為原體積的1/10， 4°C保存，將金標(biāo)H-FABP抗體結(jié)合物噴涂于玻璃纖維膜上，室溫干燥。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種檢測(cè)尿液中心臟型脂肪酸結(jié)合蛋白診斷試紙，其特征在于所述的金標(biāo)結(jié)合墊( 上包被膠體金標(biāo)記的H-FABP小鼠單抗的制備方法還包括以下步驟(3)將上述( 步驟制備的金標(biāo)H-FABP抗體結(jié)合物噴涂于玻璃纖維膜上，室溫干燥后，將膜用0. 05mol/L PH8. 0-9. 0的TBS浸洗3次，每次3min，用去離子水沖洗一次，浸入 0. 05mol/L PH3. 0-5. 0的檸檬酸緩沖液平衡5min，浸入37°C銀染液中20-30min，將膜取出， 用去離子水沖洗，放入定影液lmin，去離子水沖洗，空氣干燥。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種檢測(cè)尿液中心臟型脂肪酸結(jié)合蛋白診斷試紙，其特征在于所述的硝酸纖維素膜(3)上包被有H-FABP小鼠單抗構(gòu)成的檢測(cè)線T線(6)是將H-FABP 小鼠單抗噴涂于硝酸纖維素膜上，室溫干燥后作為檢測(cè)線T線(6)。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種檢測(cè)尿液中心臟型脂肪酸結(jié)合蛋白診斷試紙，其特征在于所述的硝酸纖維素膜(3)上包被有H-FABP 二抗構(gòu)成的質(zhì)控線C線(7)是將H-FABP 二抗噴涂于硝酸纖維素膜上，室溫干燥后作為質(zhì)控線C線(7)。
6.根據(jù)權(quán)利要求1-5任一所述的一種檢測(cè)尿液中心臟型脂肪酸結(jié)合蛋白診斷試紙，其特征在于所述的底板(5)是PVC板。
7.—種檢測(cè)尿液中心臟型脂肪酸結(jié)合蛋白診斷試紙的制備方法，其特征在于(一)金標(biāo)結(jié)合墊O)的制備1)膠體金顆粒的制備取0.01%HAuCl4水溶液100ml，加入枸櫞酸三鈉水溶液 anl，加熱煮沸15min-30min，直至顏色變紅；室溫冷卻后加入0. IMol/L K2CO3O. 5ml，混勻即得直徑約15nm的膠體金顆粒，4°C保存；2)膠體金與H-FABP小鼠單抗用量比例的確定a、取IOml膠體金溶液，用0.IM碳酸鉀溶液調(diào)整PH為8. 0-9. 0，攪拌5min，分裝10管， 每管Iml ；b、將H-FABP小鼠單抗以0.005Mol/L pH9. 0硼酸鹽緩沖液做系列稀釋為5 μ g/ ml-50y g/ml，分別取1ml，加入上述膠體金溶液中，混勻；對(duì)照管只加Iml稀釋液；c、5min后，在上述各管中加入0.Iml 10% NaCl溶液，混勻后靜置池，觀察結(jié)果；d、結(jié)果觀察，對(duì)照管和加入H-FABP小鼠單抗的量不足以穩(wěn)定膠體金的各管，均呈現(xiàn)出由紅變藍(lán)的聚沉現(xiàn)象；而加入H-FABP小鼠單抗量達(dá)到或超過最低穩(wěn)定量的各管仍保持紅色不變；以穩(wěn)定Iml膠體金溶液紅色不變的最低H-FABP小鼠單抗用量，即為H-FABP小鼠單抗的最低用量；3)膠體金標(biāo)記H-FABP抗體的制備、純化a、取IOml膠體金溶液，用0.IM碳酸鉀溶液調(diào)整PH為8. 0-9. 0，攪拌5min ；逐滴加入 H-FABP小鼠單抗繼續(xù)攪拌30min，加入5%的牛血清白蛋白(BSA)使其終濃度為1%，攪拌 15min，靜止Ih后，4°C保存?zhèn)溆茫籦、純化將上述膠體金H-FABP抗體結(jié)合物在12000rpm、4°C條件下，離心30min。棄上清液，沉淀物用含BSA、0. 02% NaN3的PB液，將沉淀重懸為原體積的1/10，4°C保存?zhèn)溆茫?)銀染色的處理將純化后的金標(biāo)H-FABP抗體結(jié)合物噴涂于玻璃纖維膜上，室溫干燥后將膜用0. 05mol/L PH7. 0-9. OTBS浸洗3次，每次3min，用去離子水沖洗一次，浸入 0. 05mol/L PH3. 0-5. 0檸檬酸緩沖液平衡5min，浸入37°C的銀染液中20-30min，將膜取出， 用去離子水沖洗，放入定影液lmin，去離子水沖洗，空氣干燥，4°C保存?zhèn)溆茫患吹媒饦?biāo)結(jié)合墊⑵；(二)包被檢測(cè)線T線(6)和質(zhì)控線C線(7)的硝酸纖維素膜(3)的制備將H-FABP小鼠單抗和H-FABP 二抗分別噴涂于硝酸纖維素膜(3)上，室溫干燥，作為檢測(cè)線T線(6)和質(zhì)控線C線(7)，密封，4C保存?zhèn)溆茫?三)試紙的組裝底板( 從一端依次粘貼樣品墊(1)、硝酸纖維素膜(3)，吸收墊 G)，金標(biāo)結(jié)合墊(2)放在樣品墊(1)上，然后在上層覆蓋PE標(biāo)簽保護(hù)膜組裝而成。
全文摘要
一種檢測(cè)尿液中心臟型脂肪酸結(jié)合蛋白診斷試紙，其特征在于樣品墊、硝酸纖維素膜、吸收墊依次粘附在底板上，金標(biāo)結(jié)合墊放在樣品墊上，在上層覆蓋PE標(biāo)簽保護(hù)膜組裝而成；其中金標(biāo)結(jié)合墊上包被有膠體金標(biāo)記的H-FABP小鼠單抗；硝酸纖維素膜上分別包被有H-FABP小鼠單抗構(gòu)成的檢測(cè)線T線和包被有H-FABP二抗構(gòu)成的質(zhì)控線C線。本發(fā)明的診斷試紙不僅特異性強(qiáng)，靈敏度高，不需要任何的輔助儀器，而且所需檢測(cè)樣品為尿液，方便患者自行取樣，具有無創(chuàng)性的優(yōu)點(diǎn)；同時(shí)，檢測(cè)時(shí)間僅需5分鐘，為確定或排除心肌梗死提供了方便快捷的方法，為早期治療爭(zhēng)取了寶貴的時(shí)間。
文檔編號(hào)G01N33/544GK102226811SQ20111008309
公開日2011年10月26日 申請(qǐng)日期2011年4月2日 優(yōu)先權(quán)日2011年4月2日
發(fā)明者王麗麗, 郭超 申請(qǐng)人:吉林雅強(qiáng)醫(yī)療器械有限公司