表達(dá)鼠疫耶爾森氏菌F1-V融合蛋白的傷寒沙門氏菌Ty21a及其用途
【專利摘要】本文描述了用于表達(dá)鼠疫耶爾森氏菌F1-V融合蛋白的質(zhì)粒構(gòu)建體的產(chǎn)生。在所公開的質(zhì)粒中，所述F1-V融合蛋白編碼序列與大腸桿菌htrA啟動子可操作地連接，并且與大腸桿菌HlyA分泌信號序列框內(nèi)融合。還描述了包含所述F1-V融合蛋白表達(dá)質(zhì)粒的腸道沙門氏菌血清變型傷寒沙門氏菌菌株Ty21a，例如用作抗鼠疫的口服疫苗。
【專利說明】表達(dá)鼠疫耶爾森氏菌F1-V融合蛋白的傷寒沙門氏菌Ty21 a 及其用途
[0001] 相關(guān)申請的交叉引用
[0002] 本申請要求于2012年5月23日提交的美國臨時(shí)申請61/650, 676的優(yōu)先權(quán)，所述 臨時(shí)申請以引用的形式全文納入本文。

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0003] 本公開內(nèi)容涉及開發(fā)用于產(chǎn)生針對鼠疫耶爾森氏菌（Yersinia pestis)--鼠疫 的致病菌一一的保護(hù)作用的免疫原性組合物。本公開內(nèi)容還涉及包含F(xiàn)l-V融合蛋白表達(dá) 構(gòu)建體的傷寒沙門氏菌（Salmonella Typhi)菌株Ty21a，及其使用方法。

【背景技術(shù)】
[0004] 鼠疫耶爾森氏菌是鼠疫的致病菌。歷史上已記錄了鼠疫的至少3次大流行，其 殺死了近2億人。鼠疫是人畜共患病（zoonotic disease)，通常通過被感染的跳蚤的 叮咬傳播。鼠疫耶爾森氏菌的天然貯存宿主包括嚙齒目動物、松鼠和草原犬鼠 （prairie dog)。目前，鼠疫耶爾森氏菌的大的貯存宿主存在于除了澳大利亞之外的所有主要人類 棲息地（Sun et al.，J Infect Dev Ctries 5(9):614-627, 2011)。鼠疫在世界上許多 地方流行，包括非洲、中國、印度、南美部分地區(qū)和美國西南部（Yang et al.，J Immunol 178:1059-1067, 2007 ;Leary et al·，Microb Pathog23:167-179, 1997)。最近的流行病學(xué) 研宄表明，全世界每年有大約4000個(gè)人類鼠疫病例（Sun et al.，J Infect Dev Ctries 5(9) :614-627, 2011)。因此，鼠疫仍然是嚴(yán)重的公共健康問題。
[0005] 鼠疫最常表現(xiàn)為腺鼠疫，其特征在于突然發(fā)熱以及靠近跳蚤叮咬處的淋巴結(jié) 腫痛（"炎性淋巴腺腫"）。用抗生素迅速治療通常是有效的（Morton et al.，Vaccine 22:2524-2532, 2004)。但是，細(xì)菌能夠從跳蚤叮咬處廣泛傳播，并且在某些情況下，會感染 肺部。如果肺部被感染，鼠疫可在由咳嗽或噴嚏所產(chǎn)生的氣溶膠中傳播，導(dǎo)致原發(fā)性肺鼠疫 的爆發(fā)（Leary et al·，Microb Pathog 23:167-179,1997)。肺鼠疫是高度傳染性的，并且 通常是致命的（Morton et al.，Vaccine22:2524-2532, 2004)。因?yàn)槭笠呤歉叨葌魅拘缘模?并且能通過氣霧化傳播，鼠疫耶爾森氏菌被認(rèn)為是潛在的生物武器（Sun et al.，J Infect Dev Ctries 5(9):614-627, 2011 ;Yang et al.，J Immunol 178:1059-1067, 2007)〇


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本文公開了用于表達(dá)鼠疫耶爾森氏菌Fl-V融合蛋白的質(zhì)粒構(gòu)建體的產(chǎn)生。還公 開了包含所述公開的質(zhì)粒構(gòu)建體的腸道沙門氏菌血清變型傷寒沙門氏菌菌株Ty21a(稱為 "傷寒沙門氏菌Ty2la"或"Ty2la"），例如用作抗鼠疫的疫苗。
[0007] 本文提供了重組核酸分子，包含可操作地連接到誘導(dǎo)型啟動子的鼠疫耶爾森氏 菌Fl-V融合蛋白編碼序列，所述誘導(dǎo)型啟動子在真核宿主細(xì)胞中具有活性，如大腸桿菌 (Escherichia coli)htrA啟動子。在某些實(shí)施方案中，所述核酸分子包含與SEQ ID N0:1 的核苷酸1-1558至少85 %相同的序列。在一些實(shí)施方案中，所述核酸分子還包含分泌信 號肽編碼序列（如大腸桿菌HlyA分泌信號序列），其與Fl-V融合蛋白編碼序列框內(nèi)融合。 在具體的非限制性實(shí)施例中，所述核酸分子包含SEQ ID NO: 1的序列。
[0008] 還提供了包含所公開的核酸分子的質(zhì)粒，以及包含所公開的核酸分子或質(zhì)粒的傷 寒沙門氏菌Ty2Ia細(xì)菌。
[0009] 在一個(gè)非限制性實(shí)施方案中，提供了重組核酸分子，其包含與大腸桿菌htrA啟動 子序列可操作地連接的鼠疫耶爾森氏菌Fl-V融合蛋白編碼序列，以及與所述Fl-V融合蛋 白編碼序列框內(nèi)融合的大腸桿菌HlyA分泌信號肽編碼序列，其中所述核酸分子的序列包 含SEQ ID N0:1。還提供了包含所述核酸分子、復(fù)制起點(diǎn)、選擇性標(biāo)記以及大腸桿菌HlyB和 HlyD蛋白編碼序列的質(zhì)粒。還提供了包含所述質(zhì)粒的傷寒沙門氏菌Ty21a。
[0010] 還提供了免疫原性組合物，其包括包含F(xiàn)l-V表達(dá)質(zhì)粒的傷寒沙門氏菌Ty2Ia和可 藥用載體。
[0011] 本公開內(nèi)容還提供了在受試者中引起針對鼠疫耶爾森氏菌的免疫應(yīng)答的方法，所 述方法是通過給予所述受試者包含F(xiàn)l-V表達(dá)載體的傷寒沙門氏菌Ty21a或是通過給予本 文所公開的免疫原性組合物進(jìn)行。還提供了在受試者中預(yù)防鼠疫、降低發(fā)生鼠疫的風(fēng)險(xiǎn)或 治療鼠疫的方法，所述方法是通過給予所述受試者包含本文所公開的質(zhì)?；蛑亟M核酸分子 的傷寒沙門氏菌Ty21a或是通過給予如本文所公開的免疫原性組合物進(jìn)行。
[0012] 根據(jù)以下參考附圖進(jìn)行的詳細(xì)描述，本發(fā)明的前述和其他目的、特征和優(yōu)點(diǎn)將會 變得更加顯而易見。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0013] 圖1是克隆到質(zhì)粒pHtrFl-V-Hly中的所述合成Fl-V融合DNA插入片段的示意圖。
[0014] 圖2是質(zhì)粒pHtrFl-V-Hly(9407bp)的示意圖，其由克隆到低拷貝質(zhì)粒pGB-2中的 鼠疫Fl-V基因融合構(gòu)建件組成。所述pGB-2復(fù)制起點(diǎn)（ORI)的位置與可選擇的大觀霉素 抗性基因（spcR)相鄰。所述合成的基因融合插入片段是由與Fl-V基因連接的（其通過修 飾的接頭（linker)序列相互融合）并且與HlyA細(xì)胞外分泌信號（HlyAs)連接的htrA啟 動子組成。所述質(zhì)粒還包括分泌機(jī)器蛋白HlyB和HlyD的編碼序列。
[0015] 圖3示出了通過SDS-PAGE對蛋白質(zhì)提取物進(jìn)行的分析。使用pHtrFl-V-hly (包含 鼠疫耶爾森氏菌Fl-V融合蛋白）或pHtrPAcm-hly(包含炭疽芽孢桿菌保護(hù)性抗原（PA);如 記載于 Osorio et al.，Infect Tmmun 77 (4) : 1475-1482, 2009)轉(zhuǎn)化傷寒沙門氏菌 Ty21a。 使培養(yǎng)物過夜培養(yǎng)，并收集培養(yǎng)物上清液（S)和細(xì)胞沉淀（P)。通過SDS-PAGE分析蛋白質(zhì) 提取物，并用市售的抗Fl單克隆抗體或抗V單克隆抗體探測。用pHtrFl-V-hly轉(zhuǎn)化的傷 寒沙門氏菌Ty21a產(chǎn)生并分泌所述Fl-V融合蛋白（58kDa)。
[0016] 圖4的兩個(gè)圖示出了針對Fl-V和PA抗原的總的血清IgG效價(jià)。通過腹膜內(nèi)途 徑，使用3個(gè)每兩周一次的劑量（含有產(chǎn)生Fl-V或之前構(gòu)建的炭疽桿菌PA的傷寒沙門氏 菌Ty2la)免疫10只6-8周齡小鼠的組。第三組小鼠接受了產(chǎn)生Fl-V的Ty2Ia和產(chǎn)生PA 的Ty21a的1:1的混合物。對照組小鼠接受了 3個(gè)劑量的用空pGB-2載體轉(zhuǎn)化的Ty21a。 經(jīng)免疫的小鼠接受了 2-5X IO7菌落形成單位形成單位（CFU)/劑量。在第三次和最后一次 免疫后一周收集血清。通過ELISA分析總的循環(huán)Fl-V特異性和PA特異性的IgG效價(jià)。
[0017] 圖5的圖表示出了針對Fl-V抗原的總的血清IgG效價(jià)。每兩周使用以Fl-V質(zhì)粒 或空pGB-2載體轉(zhuǎn)化的傷寒沙門氏菌Ty21a，通過腹膜內(nèi)途徑，免疫8周齡小鼠（每個(gè)時(shí)間 點(diǎn)每一組η = 5)3次。在0周、2周和4周時(shí)，小鼠接受了 2-5X IO7菌落形成單位（CFU)/ 劑量。在〇、1、3和5周時(shí)，收集來自每次處理的5只小鼠的血清。通過ELISA分析總的循 環(huán)Fl-V特異性的IgG效價(jià)。
[0018] 圖6A-6D的圖表示出了對rFl-V的脾細(xì)胞體外回憶應(yīng)答。未對10只6-8周齡小鼠 的組進(jìn)行免疫，或者通過腹膜內(nèi)途徑使用3個(gè)每兩周一次的劑量（含有產(chǎn)生Fl-V或空pGB2 載體的Ty21a)對其進(jìn)行免疫。經(jīng)免疫的小鼠接受2-5X IO7CFU/劑量。在第三次和最后一 次免疫后一周收集脾細(xì)胞，并在體外用rFl-V刺激72小時(shí)。收集培養(yǎng)物上清液并針對細(xì)胞 因子進(jìn)行分析。
[0019] 序列表
[0020] 列于所附序列表中的核酸和氨基酸序列是使用如37C. F. R. 1. 822所定義的核苷 酸堿基的標(biāo)準(zhǔn)字母縮寫和氨基酸的三字母編碼顯示。只顯示每條核酸序列的一條鏈，但是 應(yīng)理解任何提及所示鏈時(shí)均包括其互補(bǔ)鏈。所述序列表以創(chuàng)建于2013年5月9日的13. 8KB 的ASCII文本文件提交，以引用的方式納入本文。在所附序列表中：
[0021] SEQ ID NO: 1是克隆到質(zhì)粒pHtrFl-V-Hly中的所述Fl-V融合DNA插入片段的核 苷酸序列。SEQ ID NO: 1包含以下元件：
[0022] 核苷酸1-112 = htrA啟動子序列
[0023] 核苷酸113-562 = Fl抗原編碼序列
[0024] 核苷酸563-580 =接頭序列
[0025] 核苷酸581-1558 = V抗原編碼序列
[0026] 核苷酸1559-1747 = HlyA分泌信號序列
[0027] SEQ ID NO: 2是所述Fl抗原的氨基酸序列。
[0028] SEQ ID NO:3是所述接頭肽的氨基酸序列。
[0029] SEQ ID NO:4是所述V抗原的氨基酸序列。
[0030] SEQ ID NO: 5是所述HlyA分泌信號肽的氨基酸序列。

【具體實(shí)施方式】
[0031] I.縮寫
[0032] CFU 菌落形成單位
[0033] ELISA 酶聯(lián)免疫吸附測定
[0034] Fl 級分1抗原
[0035] IFN 干擾素
[0036] IL 白細(xì)胞介素
[0037] i.p. 腹膜內(nèi)
[0038] ORI 復(fù)制起點(diǎn)
[0039] PA 保護(hù)性抗原
[0040] SDS-PAGE十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳
[0041] TNF 腫瘤壞死因子
[0042] V 毒力抗原
[0043] II.術(shù)語和方法
[0044] 除非另有說明，技術(shù)術(shù)語以常規(guī)用法使用。分子生物學(xué)中的常用術(shù)語 的定義可見于由 Benjamin Lewin, Genes V，published by Oxford University Press, 1994 (ISBN 0-19-854287-9) ；Kendrew et al. (eds. ),The Encyclopedia of Molecular Biology, Blackwell Science Ltd. ,1994(ISBN 0-632-02182-9);和 Robert A. Meyers (ed. ), Molecular Biology and Biotechnology: a Comprehensive Desk Reference, published by VCH Publishers, Inc. ,1995(ISBN 1-56081-569-8)。
[0045] 為了便于閱讀本公開內(nèi)容的各個(gè)實(shí)施方案，提供了以下對具體術(shù)語的解釋：
[0046] 佐劑：非特異性增強(qiáng)對抗原的免疫應(yīng)答的物質(zhì)或載體。佐劑可包括其上吸附有抗 原的礦物質(zhì)（明礬、氫氧化鋁或磷酸鹽）的懸液；或其中抗原溶液被乳化在礦物油中的油 包水乳劑（例如，弗氏不完全佐劑），有時(shí)包含滅活的分枝桿菌（mycobacteria)(弗氏完全 佐劑）以進(jìn)一步增強(qiáng)抗原性。免疫刺激性寡核苷酸（例如包含CpG基序的那些）也可用 作佐劑（例如，參見美國專利 6, 194, 388、6, 207, 646、6, 214, 806、6, 218, 371、6, 239, 116、 6, 339, 068、6, 406, 705和6, 429, 199)。佐劑還包括生物分子，例如共刺激分子。示例性生物 佐劑包括 IL-2、RANTES、GM-CSF、TNF- a、IFN- γ、G-CSF、LFA-3、CD72、B7-1、B7-2、0X-40L 和 4IBBL。
[0047] 給藥：給予、施用組合物或使其與受試者接觸。給藥可通過許多途徑中的任一種來 完成，例如，局部、口服、皮下、肌內(nèi)、腹膜內(nèi)、靜脈內(nèi)、鞘內(nèi)和肌肉內(nèi)給藥。在本文所述的一些 實(shí)施方案中，通過口服途徑將免疫原性組合物給予受試者。
[0048] 編碼序列：編碼蛋白或肽（即包含開放閱讀框）的核酸序列。
[0049] Fl抗原：鼠疫耶爾森氏菌毒性蛋白。Fl抗原是由鼠疫耶爾森氏菌特有的IOOkb的 質(zhì)粒編碼，并且是包含鼠疫耶爾森氏菌的莢膜的主要蛋白組分。所述Fl抗原被認(rèn)為能阻止 宿主細(xì)胞的吞噬作用。所述Fl抗原還被稱為"F1莢膜抗原"。Fl序列是已知的且可公開 獲得（例如在GenBank數(shù)據(jù)庫中）。示例性的Fl抗原核苷酸序列在本文被列出為SEQ ID NO: 1的核苷酸113-562 ;示例性的Fl氨基酸序列被提供為SEQ ID NO:2。
[0050] 框內(nèi)融合：是指這樣的兩條核酸序列，即它們被連接起來以使得它們在同一閱讀 框內(nèi)。
[0051] 融合蛋白：通過表達(dá)由編碼兩種不同蛋白質(zhì)中的至少一部分的核酸序列改造而來 的核酸序列而產(chǎn)生的蛋白質(zhì)。為了產(chǎn)生融合蛋白，所述核酸序列必須在相同閱讀框內(nèi)（"框 內(nèi)"），并且不含內(nèi)部終止密碼子。
[0052] HlyB和HlyD :原核溶血素分泌蛋白。在本文的一些實(shí)施方案中，所公開的質(zhì)粒編 碼大腸桿菌HlyB和HlyD蛋白。編碼大腸桿菌HlyB和HlyD的低拷貝質(zhì)粒（pGB-2)之前已 記載于美國專利7, 758, 855中，其以引用的方式納入本文。
[0053] 免疫應(yīng)答：免疫系統(tǒng)的細(xì)胞（如B細(xì)胞、T細(xì)胞、巨噬細(xì)胞或多形核細(xì)胞）對刺激 物（如抗原）的應(yīng)答。免疫應(yīng)答包括參與宿主防御反應(yīng)的任何機(jī)體的細(xì)胞，包括例如，分泌 干擾素或細(xì)胞因子的上皮細(xì)胞。免疫應(yīng)答包括但不限于先天免疫應(yīng)答或炎癥。如本文所使 用的，保護(hù)性免疫應(yīng)答是指保護(hù)受試者免遭感染（預(yù)防感染或預(yù)防與感染有關(guān)的疾病的發(fā) 生）的免疫應(yīng)答。
[0054] 免疫：使受試者受到保護(hù)免患疾?。ɡ?，傳染?。?，例如通過疫苗接種。
[0055] 免疫原性組合物：本文使用的術(shù)語意指可用于在受試者中刺激或引發(fā)特定的免疫 應(yīng)答（或免疫原性應(yīng)答）的組合物。在本文的一些實(shí)施方案中，所述免疫原性組合物包括 包含F(xiàn)l-V表達(dá)質(zhì)粒的傷寒沙門氏菌Ty21a。在一些實(shí)施方案中，所述免疫原性應(yīng)答是保護(hù) 性的或提供保護(hù)性免疫，因?yàn)槠涫沟盟鍪茉囌吣芨玫氐钟笠咭疇柹暇腥净蛴墒?疫耶爾森氏菌所致的疾病進(jìn)展（例如，腺鼠疫或肺鼠疫）。一種類型的免疫原性組合物的具 體實(shí)例是疫苗。
[0056] 在一些實(shí)施方案中，免疫原性組合物的"有效量"或"免疫刺激量"是在給藥受試者 時(shí)足以產(chǎn)生可檢測的免疫應(yīng)答的量。這樣的應(yīng)答可包括，例如，產(chǎn)生特異性針對所述免疫原 性組合物中提供的一種或多種表位的抗體?；蛘?，所述應(yīng)答可包含針對所述免疫原性組合 物中提供的一種或多種表位的基于T輔助細(xì)胞或CTL的應(yīng)答。所有這三種應(yīng)答可源自初始 細(xì)胞（nai_ve cell)或記憶細(xì)胞。在其他實(shí)施方案中，免疫原性組合物的"保護(hù)性有效量" 是在給藥動物時(shí)足以賦予所述動物保護(hù)性免疫力（如抵御鼠疫的保護(hù)作用）的量。
[0057] 分離的："分離的"或"純化的"生物組分（例如核酸、肽或蛋白質(zhì)）已經(jīng)基本上從 所述組分天然存在于其中的生物體的細(xì)胞中其他生物組分中（即，其他的染色體和染色體 夕卜DNA和RNA，以及蛋白質(zhì)）分離、分開產(chǎn)生或純化出來。已經(jīng)被"分離"或"純化"的核酸、 肽或蛋白質(zhì)因此包括通過標(biāo)準(zhǔn)純化方法純化的核酸和蛋白質(zhì)。所述術(shù)語還包括通過在宿主 細(xì)胞中重組表達(dá)而制備的核酸、肽和蛋白質(zhì)，以及化學(xué)合成的核酸或蛋白質(zhì)。所述術(shù)語"分 離的"或"純化的"不要求絕對的純度；而是旨在作為一個(gè)相對術(shù)語。因此，例如，分離的生 物組分是這樣的組分，即其中所述生物組分比其細(xì)胞內(nèi)天然環(huán)境或其他生產(chǎn)容器中的所述 生物組分更富集。優(yōu)選地，將制品純化以使得所述生物組分占所述制品的總生物組分含量 的至少50%，如至少70%、至少90%、至少95 %或更高。
[0058] 核酸分子：多聚形式的核酸，其可包括RNA、cDNA、基因組DNA以及上述的合成形式 和混合聚合物的正義鏈和反義鏈。核苷酸是指核糖核苷酸、脫氧核苷酸或任一類型核苷酸 的修飾形式。本文使用的術(shù)語"核酸分子"是"核酸"和"多核苷酸"的同義詞。除非另有說 明，核酸分子的長度通常為至少10個(gè)堿基。所述術(shù)語包括單鏈和雙鏈形式的DNA。多核苷 酸可包括通過天然存在的和/或非天然存在的核苷酸連接鍵（linkage)而連接在一起的天 然存在的和經(jīng)修飾的核苷酸的任一種或兩種。
[0059] 開放閱讀框（ORF):編碼沒有任何內(nèi)部終止密碼子的氨基酸的一系列核苷酸三聯(lián) 體（密碼子）。這些序列通?？杀环g成肽/多肽/蛋白質(zhì)/多聚蛋白。
[0060] 可操作地連接：當(dāng)?shù)谝缓怂嵝蛄信c第二核酸序列的位置處于有功能的關(guān)系時(shí)，所 述第一核酸序列與第二核酸序列可操作連接。例如，如果啟動子影響編碼序列的轉(zhuǎn)錄或表 達(dá)，則所述啟動子可操作地連接于所述編碼序列。通常，可操作地連接的DNA序列是連續(xù) 的，并且當(dāng)需要連接兩個(gè)蛋白編碼區(qū)域時(shí)則位于相同的閱讀框中。如果存在內(nèi)含子，則可操 作地連接的DNA序列可以是不連續(xù)的。
[0061] 復(fù)制起點(diǎn)（ORI):在基因組或質(zhì)粒中（DNA復(fù)制在其中起始）的特定核酸序列。ORI 的具體結(jié)構(gòu)因物種而異，但是通常所有的都具有高AT含量的特征。
[0062] 可藥用載體：可用于本公開內(nèi)容的可藥用載體是常規(guī)的。Remington' s Pharmaceutical Sciences, by E. ff. Martin, Mack Publishing Co. , Easton, PA,第 15 版 (1975)描述了適于一種或多種治療化合物或分子以及其他藥物制劑的藥物遞送的組合物 和制劑。
[0063] 通常，所述載體的性質(zhì)會取決于采用的具體給藥模式。例如，腸胃外制劑通常包括 可注射液體作為載體，所述可注射液體包括可藥用和生理上可接受的液體如水、生理鹽水、 平衡鹽溶液、葡萄糖水溶液、甘油等。對于固體組合物（例如，粉劑、丸劑、片劑或膠囊劑形 式），常規(guī)的無毒固體載體可包括，例如藥品級甘露醇、乳糖、淀粉或硬脂酸鎂。除了生物學(xué) 中性的載體之外，待給藥的藥物組合物可包含少量的無毒輔助物質(zhì)，例如潤濕劑或乳化劑、 防腐劑和PH緩沖劑等，例如乙酸鈉或脫水山梨糖醇單月桂酸酯。
[0064] 鼠疫：由腸桿菌科家族中的非運(yùn)動性、生長緩慢的兼性細(xì)菌--鼠疫耶爾森氏菌 導(dǎo)致的傳染病。鼠疫耶爾森氏菌是通過嚙齒類動物（特別是大鼠）攜帶，并且在以其為食 的跳蚤中。其他動物和人類通常直接因嚙齒類動物或跳蚤叮咬而感染所述細(xì)菌。感染鼠疫 耶爾森氏菌可導(dǎo)致腺鼠疫、敗血性鼠疫或肺鼠疫。
[0065] 在鼠疫耶爾森氏菌誘導(dǎo)的致病的最常見形式一一腺鼠疫中，細(xì)菌感染淋巴系統(tǒng)， 使其發(fā)炎。腺鼠疫通常通過感染的跳蚤或嚙齒動物的叮咬而感染。在少數(shù)情況下，來自患鼠 疫的人使用的一塊污染的衣服或其他材料的鼠疫耶爾森氏菌通過皮膚上的開口進(jìn)入。腺鼠 疫侵襲淋巴結(jié)，并且在暴露于所述細(xì)菌的3-7天內(nèi)，出現(xiàn)類似于流感的癥狀，如發(fā)熱、頭痛、 寒戰(zhàn)、虛弱和腫脹、觸痛的淋巴腺（炎性淋巴腺腫）。腺鼠疫很少在人和人之間傳播。
[0066] 敗血性鼠疫以與腺鼠疫相同的方式感染，通常通過跳蚤或嚙齒動物叮咬感染，并 且細(xì)菌在血液中增殖。但是，敗血性鼠疫的特征在于細(xì)菌增殖發(fā)生在血流中而不僅僅是在 淋巴系統(tǒng)中。敗血性鼠疫通常作為未治療的腺鼠疫或肺鼠疫的并發(fā)癥出現(xiàn)，其癥狀包括發(fā) 熱、寒戰(zhàn)、虛弱、腹痛、休克，以及皮下或其他器官出血。但是，在敗血性鼠疫中不會產(chǎn)生炎性 淋巴腺腫，并且敗血性鼠疫很少在人和人之間傳播。
[0067] 肺鼠疫是鼠疫的最嚴(yán)重形式，并且在鼠疫耶爾森氏菌感染肺部并引起肺炎時(shí) 發(fā)生。當(dāng)鼠疫耶爾森氏菌被吸入時(shí)，可感染肺鼠疫。在暴露于肺鼠疫的空氣播散飛沫 (airborne droplet) 1-3天內(nèi)，就會產(chǎn)生發(fā)熱，頭痛，虛弱，帶有氣短、胸痛、咳嗽以及有時(shí)血 痰或水樣痰的肺炎的快速發(fā)生。當(dāng)腺鼠疫和敗血性鼠疫在所述疾病擴(kuò)散到肺部后未得到治 療時(shí)，此類鼠疫可在人和人之間傳播。在這點(diǎn)上，通過所感染的個(gè)體咳嗽或噴嚏時(shí)釋放到空 氣中的攜帶鼠疫耶爾森氏菌的飛沫（respiratory droplet)，所述疾病可被傳播給其他人。
[0068] 質(zhì)粒：能夠在宿主細(xì)胞中自主復(fù)制的環(huán)形核酸分子。在本公開內(nèi)容的一些實(shí)施 方案中，所述質(zhì)粒是低拷貝數(shù)質(zhì)粒。例如，所述低拷貝數(shù)質(zhì)粒可以是在宿主細(xì)胞中產(chǎn)生約 1-10(例如3-9或5-7)個(gè)拷貝的所述質(zhì)粒的質(zhì)粒。在具體實(shí)施例中，所述低拷貝數(shù)質(zhì)粒在 宿主細(xì)胞中產(chǎn)生約5-7個(gè)拷貝。在具體實(shí)施例中，所述低拷貝數(shù)質(zhì)粒是基于記載于以引用 的方式納入本文的美國專利7, 758, 855中的pGB-2質(zhì)粒。
[0069] 預(yù)防、治療或減輕疾?。?預(yù)防"疾病是指抑制疾病的全面發(fā)生。"治療"是指當(dāng)疾 病或病理病癥開始發(fā)生后減輕疾病或病理病癥的征象（signs)或癥狀的治療性干預(yù)。"減 輕"是指減少疾病征象或癥狀的數(shù)量或嚴(yán)重程度。
[0070] 啟動子：一系列指導(dǎo)核酸轉(zhuǎn)錄的核酸控制序列。啟動子包括在轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)附 近的必需核酸序列。啟動子還任選地包括可定位于距轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)起多達(dá)幾千個(gè)堿基對 的遠(yuǎn)端增強(qiáng)子或抑制子元件。包括組成型啟動子和誘導(dǎo)型啟動子（參見，例如Bitter et al.，Methods in Enzymology 153:516-544, 1987)。在本文的一些實(shí)施方案中，所述啟動子 是大腸桿菌的htrA(高溫需求A)基因的啟動子。所述htrA啟動子是在原核細(xì)胞的沙門氏 菌感染過程中具有活性的誘導(dǎo)型啟動子。在具體的非限制性實(shí)施例中，所述htrA啟動子序 列包含SEQ ID NO: 1的核苷酸1-112。
[0071] 重組體：重組體核酸或蛋白質(zhì)是具有非天然存在的序列或具有通過人工組合兩個(gè) 原本獨(dú)立的序列片段而產(chǎn)生的序列的重組體核酸或蛋白質(zhì)。所述人工組合常常是通過化學(xué) 合成或通過人工操縱的分離核酸片段（例如通過遺傳工程技術(shù)）完成。
[0072] 腸道沙門氏菌（Salmonella enterica):-種革蘭氏陰性的、桿狀、有鞭毛的細(xì)菌。 所述腸道沙門氏菌種包括超過2500種不同的血清變型（serovar)，其中之一是傷寒沙門氏 菌血清變型。
[0073] 傷寒沙門氏菌Ty21a :Ty21a是腸道沙門氏菌血清變型傷寒沙門氏菌的菌株。 Ty21a是減毒的活細(xì)菌菌株，其被用作抗傷寒的口服疫苗（Osorio et al.，Infect Immun 77(4):1475-1482, 2009 ；Germanier and Furer1J Infect Dis 131:553-558, 1975 ；ffahdan et al. , Bull WH058:469-474, 1980 ；U. S. Patent No. 3, 856, 935) 〇
[0074] 選擇性標(biāo)記：編碼蛋白質(zhì)的核苷酸序列，所述蛋白質(zhì)賦予表達(dá)所述標(biāo)記的生物體 (如細(xì)菌）陽性或陰性選擇優(yōu)勢。選擇性標(biāo)記包括，例如，抗生素抗性基因，如壯觀霉素。
[0075] 序列同一性：氨基酸或核酸序列之間的相似性被表示為所述序列之間的相似性， 又稱為序列同一性。序列同一性常以同一性（或相似性或同源性）百分?jǐn)?shù)來度量；所述百 分?jǐn)?shù)越高，兩個(gè)序列越相似。當(dāng)使用常規(guī)方法進(jìn)行比對時(shí)，給定基因或蛋白的同系物或變體 具有相對高的序列同一性程度。
[0076] 比對用于比較的序列的方法在本領(lǐng)域中是公知的。多種程序和比對算法記載 于：Smith and Waterman, Adv. AppI. Math. 2:482, 1981 ；Needleman and ffunsch, J. Mol. Biol. 48:443, 1970 ；Pearson and Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 85:2444, 1988 ； Higgins and Sharp,Gene 73:237-244, 1988 ;Higgins and Sharp,CABIOS 5:151-153, 1989 ；Corpet et al.,Nucleic Acids Research 16:10881-10890,1988； Pearson and Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S. A. 85:2444, 1988;和 Altschul et al. , Nature Genet. 6:119-129, 1994。
[0077] NCBI 基礎(chǔ)局部比對搜索工具（BLAST?) (Altschul et al. , J. Mol. Biol. 215:403-410, 1990)可以從若干來源獲得，包括美國國立生物技術(shù)信息中心（NCBI， Bethesda，MD)和互聯(lián)網(wǎng)，用于與序列分析程序 blastp、blastn、blastx、tblastn 和 tblastx 聯(lián)合使用。
[0078] 在本文的一些實(shí)施方案中，提供了與SEQ ID NO: 1-5中有任一個(gè)至少80%、至少 85 %、至少90 %、至少95 %、至少96 %、至少97 %、至少98 %或至少99 %相同的核苷酸或氨 基酸序列。
[0079] 血清變型（Serovar):物種或亞種的細(xì)分，通過一組特征性抗原來區(qū)分。血清變型 (Serovar)還被稱為"血清型（serotype)
[0080] 信號肽：指導(dǎo)蛋白質(zhì)翻譯后轉(zhuǎn)運(yùn)的短肽鏈（長度一般為3-60個(gè)氨基酸）。分泌信 號肽是指導(dǎo)蛋白質(zhì)從產(chǎn)生其的細(xì)胞中分泌的信號肽。在本文的一些實(shí)施方案中，所述分泌 信號肽是來自大腸桿菌溶血素蛋白HlyA的信號肽。在具體的非限制性實(shí)施例中，所述HlyA 分泌信號肽具有SEQ ID N0:5的氨基酸序列，并且由SEQ ID NO: 1的核苷酸1559-1747編 碼。
[0081] 受試者：活的多細(xì)胞脊椎生物一一包括人和非人哺乳動物的種類。
[0082] 治療有效量：足以在用該試劑治療的受試者中達(dá)到所需效果的具體試劑的量。例 如，這可以是用于在受試者中引起免疫應(yīng)答和/或用于預(yù)防鼠疫耶爾森氏菌感染的含F(xiàn)l-V 表達(dá)質(zhì)粒的傷寒沙門氏菌Ty21a的量。理想地，在本公開內(nèi)容的上下文中，含F(xiàn)l-V表達(dá)質(zhì) 粒的傷寒沙門氏菌Ty21a的治療有效量是足以在受試者中增加對由鼠疫耶爾森氏菌引起 的感染的抵抗力，預(yù)防、減輕和/或治療所述感染，而不會在所述受試者中導(dǎo)致明顯的細(xì)胞 毒性作用的量。用于在受試者中增加對感染的抵抗力，預(yù)防、減輕和/或治療感染的含F(xiàn)l-V 表達(dá)質(zhì)粒的傷寒沙門氏菌Ty21a的治療有效量會取決于，例如，被治療的受試者、治療組合 物的給藥方式和其他因素。
[0083] 單位劑量：包含經(jīng)計(jì)算以單獨(dú)或共同產(chǎn)生所需作用（如免疫原性作用）的預(yù)定量 的活性物質(zhì)的物理獨(dú)立單位?？墒褂脝蝹€(gè)單位劑量或多個(gè)單位劑量以提供所需作用，例如 免疫原性作用。在一個(gè)實(shí)施例中，單位劑量包括所需量的如本文所公開的表達(dá)Fl-V融合蛋 白的傷寒沙門氏菌。
[0084] V抗原：由IcrV基因編碼的鼠疫耶爾森氏菌毒性蛋白。V抗原是在鼠疫耶爾森氏 菌毒力中發(fā)揮多功能作用的分泌蛋白。例如，V抗原是低鈣應(yīng)答毒性基因表達(dá)的正調(diào)控因 子，并參與效應(yīng)蛋白通過II型分泌系統(tǒng)向真核細(xì)胞的易位。V抗原還被認(rèn)為通過抑制細(xì)胞 因子如IFN-γ和TNF-α的產(chǎn)生而發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)劑的作用。V抗原序列是已知的并可公開 獲得。本文提供的示例性V抗原核苷酸序列為SEQ ID NO: 1的核苷酸581-1558,并且本文 列出的示例性V抗原氨基酸序列為SEQ ID NO: 4。
[0085] 疫苗：可被給予受試者（如獸醫(yī)或人類受試者）而賦予對疾病或其他病理病癥 (如鼠疫）的免疫力（如主動免疫）的免疫原性組合物。疫苗可用于治療或用于預(yù)防。因 此，疫苗可用于降低感染的可能性或降低疾病或病癥的癥狀的嚴(yán)重程度或限制所述疾病或 病癥的進(jìn)展。在本文的實(shí)施例中，所述疫苗包含如本文所公開的表達(dá)Fl-V融合蛋白的傷寒 沙門氏菌。
[0086] 鼠疫耶爾森氏菌：革蘭氏陰性的、桿狀細(xì)菌。鼠疫耶爾森氏菌是能夠感染人類和其 他動物的兼性厭氧菌。鼠疫耶爾森氏菌的感染能導(dǎo)致腺鼠疫、敗血性鼠疫或肺鼠疫。
[0087] 除非另有說明，本文使用的所有技術(shù)術(shù)語和科學(xué)術(shù)語的含義與本公開內(nèi)容所屬領(lǐng) 域的普通技術(shù)人員通常所理解的含義相同。除非上下文中另有明確說明，單數(shù)術(shù)語"一"、 "一個(gè)"和"所述"包括復(fù)數(shù)指代對象。類似地，除非上下文中另有明確說明，詞語"或"意欲 包括"和"。因此，"包含A或B"意指包括A、或B、或A和B。還應(yīng)理解，對于核酸或多肽給 出的所有堿基大小或氨基酸大小，以及所有分子量和分子質(zhì)量值都是近似值，并且用于描 述目的。盡管與本文描述的方法和材料相似或等價(jià)的方法和材料可用于本公開內(nèi)容的實(shí)施 或測試，但適合的方法和材料如下所述。本文提到的所有出版物、專利申請、專利和其他參 考文獻(xiàn)以引用的方式全文納入本文。如果出現(xiàn)沖突，以本說明書（包括對術(shù)語的解釋）為 準(zhǔn)。此外，所述材料、方法和實(shí)施例僅是說明性的，不意欲進(jìn)行限制。
[0088] III.若干實(shí)施方案概述
[0089] 本文公開了用于表達(dá)鼠疫耶爾森氏菌Fl-V融合蛋白的質(zhì)粒構(gòu)建體的開發(fā)。還公 開了包含F(xiàn)l-V融合蛋白表達(dá)質(zhì)粒的腸道沙門氏菌血清型傷寒沙門氏菌菌株Ty21a (在本文 稱為"傷寒沙門氏菌Ty21a"或"Ty21a"），其例如用作抗鼠疫的口服疫苗。
[0090] 本文提供了一種重組核酸分子，其包含與大腸桿菌htrA啟動子序列可操作地連 接的鼠疫耶爾森氏菌Fl-V融合蛋白編碼序列。所述htrA啟動子是在真核宿主細(xì)胞中具有 活性的誘導(dǎo)型啟動子。在某些情況下，所述Fl和V蛋白的編碼區(qū)被核酸接頭（如包含SEQ ID NO: 1的核苷酸563-580的接頭）分隔開。
[0091] 在一些實(shí)施方案中，所述Fl-V融合蛋白編碼序列與SEQ ID NO: 1的核苷酸 113-1558有至少85 %、至少90 %、至少95 %、至少96 %、至少97 %、至少98 %或至少99 %相 同。在具體的實(shí)施例中，所述Fl-V融合蛋白編碼序列包含SEQ ID NO: 1的核苷酸113-1558 或由其組成。
[0092] 在一些實(shí)施方案中，所述htrA啟動子序列與SEQ ID NO: 1的核苷酸1-112有至少 85 %、至少90 %、至少95 %、至少96 %、至少97 %、至少98 %或至少99 %相同。在具體的實(shí) 施例中，所述htrA啟動子序列包含SEQ ID NO: 1的核苷酸1-112或由其組成。
[0093] 在一些實(shí)施方案中，所述包含與大腸桿菌htrA啟動子序列可操作地連接的鼠疫 耶爾森氏菌Fl-V融合蛋白編碼序列的核酸分子包含與SEQ ID NO: 1的核苷酸1-1558有至 少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%相同的序列。在 具體的實(shí)施例中，所述核酸分子包含SEQ ID NO: 1的核苷酸1-1558或由其組成。
[0094] 在一些實(shí)施方案中，所述重組核酸分子還包含與Fl-V融合蛋白編碼序列框內(nèi)融 合的分泌信號肽編碼序列。在一些實(shí)施例中，所述分泌信號肽是大腸桿菌HlyA分泌信號 肽。在具體的非限制性實(shí)施例中，所述大腸桿菌HlyA分泌信號肽編碼序列與SEQ ID NO: 1 的核苷酸1559-1747有至少85 %、至少90 %、至少95 %、至少96 %、至少97 %、至少98 %或 至少99%相同，或者包含SEQ ID NO: 1的核苷酸1559-1747或由其組成。
[0095] 在具體的實(shí)施方案中，所述重組核酸分子的序列與SEQ ID NO: 1有至少85%、至 少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%相同。在具體的非限制性 實(shí)施例中，所述核酸分子包含SEQ ID NO: 1或由其組成。
[0096] 還提供了包含本文所公開的重組核酸分子的質(zhì)粒。因此，在一些實(shí)施方案中，所 述質(zhì)粒包含與SEQ ID NO: 1有至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少 98%或至少99%相同的核酸序列，或包含SEQ ID NO: 1。
[0097] 在一些實(shí)施方案中，所述質(zhì)粒是低拷貝數(shù)質(zhì)粒。例如，所述低拷貝數(shù)質(zhì)?？梢允窃?宿主細(xì)胞中產(chǎn)生約1-10或3-9或5-7個(gè)拷貝的質(zhì)粒。在具體的實(shí)施例中，所述低拷貝數(shù)質(zhì) 粒在宿主細(xì)胞中產(chǎn)生約5-7個(gè)拷貝。在具體的實(shí)施例中，所述低拷貝數(shù)質(zhì)粒是基于美國專 利7, 758, 855中所述的pGB-2質(zhì)粒，所述美國專利以引用的方式納入本文。
[0098] 在一些實(shí)施方案中，所述質(zhì)粒還包含選擇性標(biāo)記。選擇性標(biāo)記為本領(lǐng)域中所公知 的，適合的選擇性標(biāo)記可由本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)所述質(zhì)粒的所需選擇標(biāo)準(zhǔn)和特定用途來進(jìn) 行選擇。在一些實(shí)施例中，選擇性標(biāo)記是抗生素抗性基因。在一個(gè)非限制性實(shí)施例中，所述 選擇性標(biāo)記是壯觀霉素抗性基因。
[0099] 在一些實(shí)施方案中，所述質(zhì)粒還包含大腸桿菌HlyB和HlyB蛋白編碼序列。所述 HlyB和HlyD蛋白是溶血素分泌蛋白，其使得由該質(zhì)粒編碼的Fl-V融合蛋白能夠進(jìn)行細(xì)胞 外分泌。
[0100] 還提供了包含本文所公開的重組核酸分子或質(zhì)粒的傷寒沙門氏菌Ty21a細(xì)菌。傷 寒沙門氏菌Ty21a是減毒的活細(xì)菌菌株，該菌株被批準(zhǔn)作為用于傷寒的口服疫苗。已證明 傷寒沙門氏菌Ty21a的給藥是安全的，并且此菌株之前已被有效地用于表達(dá)炭疽芽孢桿菌 保護(hù)性抗原（PA)(參見，例如，Osorio et al·，Infect Immun 77 (4) :1475-1482, 2009;和美 國專利7, 758, 855,其以引用的方式納入本文）。本文公開了傷寒沙門氏菌Ty21a細(xì)菌作為 載體來遞送鼠疫耶爾森氏菌的經(jīng)克隆的Fl和V抗原（作為融合蛋白）的用途。
[0101] 還提供了包含含有本文公開的質(zhì)粒或重組核酸分子的傷寒沙門氏菌Ty21a，以及 可藥用載體的免疫原性組合物。在一些實(shí)施方案中，所述免疫原性組合物被配制為用于口 服給藥。在一些實(shí)施方案中，以單位劑量形式配制所述免疫原性組合物。
[0102] 還提供了在受試者中引起針對鼠疫耶爾森氏菌的免疫應(yīng)答的方法，所述方法是通 過給予所述受試者包含本文公開的質(zhì)?；蛑亟M核酸分子的傷寒沙門氏菌Ty21a細(xì)菌，或通 過給予如本文所公開的免疫原性組合物進(jìn)行。在一些實(shí)施方案中，所述免疫應(yīng)答是保護(hù)性 免疫應(yīng)答。在一些實(shí)施方案中，治療性地給予所述傷寒沙門氏菌Ty2Ia或所述免疫原性組 合物，例如在鼠疫耶爾森氏菌感染之后。在其他實(shí)施方案中，預(yù)防性地給予所述傷寒沙門氏 菌Ty21a或所述免疫原性組合物，例如為預(yù)防鼠疫耶爾森氏菌感染或降低鼠疫耶爾森氏菌 感染的風(fēng)險(xiǎn)。
[0103] 還提供了在受試者中預(yù)防鼠疫、降低發(fā)生鼠疫的風(fēng)險(xiǎn)或治療鼠疫的方法，所述方 法是通過給予所述受試者包含本文公開的質(zhì)?；蛑亟M核酸分子的傷寒沙門氏菌Ty21a，或 通過給予如本文所公開的免疫原性組合物進(jìn)行。所述鼠疫可以是腺鼠疫、敗血性鼠疫或肺 鼠疫。在一些實(shí)施方案中，治療性地給予所述傷寒沙門氏菌Ty21a或所述免疫原性組合物， 例如在所述受試者中已經(jīng)產(chǎn)生鼠疫的臨床征象之后。在其他實(shí)施方案中，預(yù)防性地給予所 述傷寒沙門氏菌Ty21a或所述免疫原性組合物，例如為預(yù)防鼠疫或降低鼠疫風(fēng)險(xiǎn)。
[0104] 在一個(gè)非限制性實(shí)施例中，本文提供了包含與大腸桿菌htrA啟動子序列可操作 地連接的鼠疫耶爾森氏菌Fl-V融合蛋白編碼序列以及與Fl-V融合蛋白編碼序列框內(nèi)融合 的大腸桿菌HlyA分泌信號肽編碼序列的重組核酸分子，其中所述核酸分子的序列包含SEQ ID NO:1〇
[0105] 在另一個(gè)非限制性實(shí)施例中，提供了一種質(zhì)粒，其包含（i)包含與大腸桿菌htrA 啟動子序列可操作地連接的鼠疫耶爾森氏菌Fl-V融合蛋白編碼序列以及與Fl-V融合蛋白 編碼序列框內(nèi)融合的大腸桿菌HlyA分泌信號肽編碼序列的重組核酸分子，其中所述核酸 分子的序列包含SEQ ID NO: I ; (ii)復(fù)制起點(diǎn)；（iii)選擇性標(biāo)記；以及（iv)大腸桿菌HlyB 和HlyD蛋白編碼序列。
[0106] 在另一個(gè)非限制性實(shí)施例中，提供了包含重組核酸分子或質(zhì)粒的傷寒沙門氏菌 Ty21a，其中所述重組核酸分子或質(zhì)粒包含與大腸桿菌htrA啟動子序列可操作地連接的鼠 疫耶爾森氏菌Fl-V融合蛋白編碼序列以及與Fl-V融合蛋白編碼序列框內(nèi)融合的大腸桿菌 HlyA分泌信號肽編碼序列，其中所述核酸分子或質(zhì)粒的序列包含SEQ ID N0:1。還提供了 包括傷寒沙門氏菌Ty21a和可藥用載體的免疫原性組合物。在一些情況下，所述免疫原性 組合物被配制為用于口服給藥。還提供了在受試者中引起針對鼠疫耶爾森氏菌的免疫應(yīng)答 的方法，所述方法是通過給予所述受試者所述傷寒沙門氏菌Ty21a或所述免疫原性組合物 進(jìn)行。
[0107] 在另一個(gè)非限制性實(shí)施例中，提供了用于產(chǎn)生抵御鼠疫的保護(hù)作用的口服疫苗， 其中所述疫苗包含重組核酸分子或質(zhì)粒，其中所述重組核酸分子或質(zhì)粒包含與大腸桿菌 htrA啟動子序列可操作地連接的鼠疫耶爾森氏菌Fl-V融合蛋白編碼序列以及與Fl-V融合 蛋白編碼序列框內(nèi)融合的大腸桿菌HlyA分泌信號肽編碼序列，其中所述核酸分子或質(zhì)粒 的序列包含SEQ ID NO: 1。
[0108] 本文公開的重組核酸分子和質(zhì)粒，以及本文公開的包含所述重組核酸分子或質(zhì)粒 的傷寒沙門氏菌Ty21a，相對于在先記載的鼠疫疫苗具有若干優(yōu)勢。例如，所述大腸桿菌 htrA啟動子主要在體內(nèi)具有活性，從而使得所述Fl-V融合蛋白能夠在哺乳動物宿主細(xì)胞 中有效表達(dá)，而限制在肉湯培養(yǎng)物中的表達(dá)，這促進(jìn)了用于疫苗生產(chǎn)的表達(dá)構(gòu)建體的穩(wěn)定 性。宿主細(xì)胞中Fl-V的有效表達(dá)，增強(qiáng)了在所述宿主中引起的免疫應(yīng)答，提高了疫苗的效 力。另外，使用低拷貝質(zhì)粒（如PGB-2質(zhì)粒），還增強(qiáng)了所述Fl-V表達(dá)構(gòu)建體的穩(wěn)定性。另 夕卜，使用大腸桿菌HlyA分泌信號以及大腸桿菌HlyB和HlyD蛋白編碼序列增強(qiáng)了所述Fl-V 融合蛋白在宿主中的細(xì)胞外分泌，進(jìn)一步提高了由所述疫苗引起的免疫應(yīng)答。最后，使用傷 寒沙門氏菌Ty21a使得獲得了用于口服給藥鼠疫疫苗的安全且有效的方式。
[0109] IV.免疫原性組合物的配制和給藥
[0110] 本文公開的重組核酸分子、質(zhì)粒和免疫原性組合物可方便地以單位劑型呈現(xiàn)，并 通過傳統(tǒng)制藥技術(shù)制備。此類技術(shù)包括使活性成分和藥物載體或賦形劑結(jié)合的步驟。一般 而言，通過使活性成分與液體載體均一且緊密地結(jié)合來制備所述制劑。所述制劑可以單位 劑量或多劑量容器（如密封的安瓿瓶和小瓶）呈現(xiàn)，并且可貯存在冷凍干燥（凍干）條件 下，僅需要在臨使用前加入無菌液體載體（例如，注射用水）。臨時(shí)注射溶液和懸液可由本 領(lǐng)域普通技術(shù)人員所通常使用的無菌粉末、顆粒和片劑制備。
[0111] 在某些實(shí)施方案中，單位劑型是包含所給予的組分的一個(gè)劑量或一個(gè)單位或者其 適當(dāng)級分的那些。應(yīng)理解，除了以上特別提到的所述組分，本文涵蓋的制劑可包括本領(lǐng)域普 通技術(shù)人員通常使用的其他試劑。
[0112] 本文提供的組合物（包括用作免疫原性組合物的那些），可通過不同途徑（如口 月艮（包括口腔和舌下）、直腸、腸胃外、噴霧（aerosol)、鼻內(nèi)、肌內(nèi)、皮下、皮內(nèi)和局部）給 藥。它們可以不同形式給藥，包括但不限于溶液、乳液和懸液、微球、顆粒、微粒、納米顆粒和 脂質(zhì)體。在具體的實(shí)施方案中，所述免疫原性組合物通過口服給藥。
[0113] 給藥量將根據(jù)給藥途徑而變化。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員會了解不同給藥途徑的合適 給藥量。
[0114] 給藥可通過單劑量或多劑量完成。在本公開內(nèi)容的上下文中，給予受試者的劑量 應(yīng)足以隨時(shí)間引起有益的治療反應(yīng)，例如預(yù)防鼠疫耶爾森氏菌感染或鼠疫的發(fā)生。所需劑 量可根據(jù)，例如所述受試者的年齡、體重和總體健康狀況而改變。
[0115] 選擇每一劑量中的免疫原性組合物的量作為引起免疫刺激應(yīng)答而沒有明顯有害 副作用的量。這種量將根據(jù)所使用的具體組合物及其如何給藥而變化。初始劑量的范圍可 為約1 μ g到約lmg，一些實(shí)施方案具有約10 μ g到約800 μ g的范圍，并且其他實(shí)施方案的 范圍是約25 μ g到約500 μ g。在初次給予所述免疫原性組合物之后，受試者可以接受一次 或多次充分間隔的加強(qiáng)給藥。加強(qiáng)給藥的范圍可為約Iyg到約lmg，其他實(shí)施方案的范圍 為約IOyg到約750 μ g，還有其他的實(shí)施方案的范圍為約50 μ g到約500 μ g?？赡苄枰?1-5年（例如3年）的間隔進(jìn)行定期加強(qiáng)以維持保護(hù)性免疫的所需水平。
[0116] 當(dāng)將細(xì)菌作為所述免疫原性組合物的組分進(jìn)行給藥時(shí)，可通過制劑中的菌落形成 單位（CFU)的數(shù)量來測定劑量。因此，在一些實(shí)施例中，含有Fl-V表達(dá)構(gòu)建體的傷寒沙門 氏菌Ty21a治療有效劑量為傷寒沙門氏菌Ty21a的至少100CFU、至少10 3CFU、至少104CFU、 至少 105CFU、至少 106CFU、至少 107CFU、至少 IO8CFU 或至少 IO9CFU,例如 100CFU-109CFU 或 IO3CFU-IO8CFu 或 IO4CFU-IO7CFu 或 Io5CFU-IO6CFUo
[0117] 本文提供了藥物組合物（也稱為免疫原性組合物或免疫刺激組合物），所述藥物 組合物包括單獨(dú)的或結(jié)合可藥用載體的治療有效劑量的重組核酸分子、質(zhì)?；虬現(xiàn)l-V 表達(dá)構(gòu)建體的傷寒沙門氏菌Ty21a。
[0118] 可藥用載體包括，但不限于，鹽水、緩沖鹽水、右旋糖（dextrose)、水、甘油、乙醇、 及其組合。所述載體和組合物可以是無菌的，并且所述制劑適合所述給藥方式。所述組合 物還可包含少量潤濕劑或乳化劑或pH緩沖劑。所述組合物可以是液體溶液、懸液、乳液、片 劑、丸劑、膠囊、緩釋制劑或粉末?？墒褂脗鹘y(tǒng)的粘合劑和載體如甘油三酯將所述組合物配 制成栓劑。口服制劑可包括標(biāo)準(zhǔn)載體如藥物級的甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸鎂、糖精鈉、纖 維素和碳酸鎂?？墒褂萌魏纬Ｒ姷乃幬镙d體，如無菌鹽水或芝麻油。所述介質(zhì)（medium)還 可包含傳統(tǒng)的醫(yī)藥輔助材料，例如，調(diào)整滲透壓的可藥用鹽、緩沖液、防腐劑等。其他可與本 文提供的組合物和方法一起使用的介質(zhì)是生理鹽水和芝麻油。
[0119] 所公開的免疫原性組合物可包括其他生物學(xué)惰性劑或生物學(xué)活性劑（或二者）。 例如，所公開的免疫原性組合物可包括佐劑、載體、賦形劑和抗微生物試劑（如抗生素）。
[0120] 任選地，可將一種或多種細(xì)胞因子，如IL-2、IL-6、IL-12、RANTES、GM-CSF、 TNF-α或IFN-γ ;-種或多種生長因子，如GM-CSF或G-CSF ; -種或多種分子，如0X-40L 或41BBL;或這些物質(zhì)的組合用作生物佐劑（參見，例如，Salgaller et al.，1998，J. Surg. Oncol. 68 (2) : 122-38 ；Lotze et al. , 2000, Cancer J. Sci. Am. 6 (Suppl l):S61-6； Cao et al. , 1998, Stem Cells 16(Suppl I) : 251-60 ；Kuiper et al. , 2000, Adv. Exp. Med. Biol. 465:381-90)?？蓪⑦@些分子通過全身（或局部）給予所述宿主。
[0121] 提供了以下實(shí)施例以舉例說明某些具體特征和/或?qū)嵤┓桨?。這些實(shí)施例不應(yīng)被 解釋為將本公開內(nèi)容限制于所描述的具體特征或?qū)嵤┓桨钢小?br> [0122] 實(shí)施例
[0123] 實(shí)施例1 :質(zhì)粒構(gòu)建以及Fl-V表達(dá)和分泌的分析
[0124] 本實(shí)施例描述了用于在傷寒沙門氏菌疫苗菌株Ty21a中表達(dá)鼠疫耶爾森氏菌莢 膜蛋白級分I(Fl)/毒力抗原融合蛋白前體（LcrV)融合蛋白（稱為Fl-V融合蛋白）的遺 傳穩(wěn)定質(zhì)粒系統(tǒng)的產(chǎn)生。
[0125] 之前已經(jīng)開發(fā)了用于優(yōu)化的炭疽芽孢桿菌保護(hù)性抗原（PA)表達(dá)的遺傳穩(wěn) 定的質(zhì)粒表達(dá)系統(tǒng)（參見 Osorio et al. , Infect Immun77 (4) : 1475-1482, 2009 ;美 國專利7, 758, 855,其以引用的方式納入本文）。為了產(chǎn)生用于表達(dá)鼠疫耶爾森氏菌 Fl-V融合蛋白的質(zhì)粒系統(tǒng)，對之前公開的鼠疫耶爾森氏菌Fl-V融合基因的合成構(gòu)建體 (GenBank登錄號AY924380. 1)進(jìn)行了修飾。將已在Ty21a中成功使用的低拷貝數(shù)質(zhì)粒 pGB-2 (Osorio et al. , Infect Tmmun77(4):1475-1482, 2009 ；Xu et al. , Infect Tmmun 70(8):4414-4423,2002)用作質(zhì)粒構(gòu)建的骨架。將合成的Fl-V融合基因克隆至質(zhì)粒pGB-2 中htrA啟動子的下游（圖2)。
[0126] 為了誘導(dǎo)細(xì)胞外表達(dá)，使用大腸桿菌α-溶血素蛋白HlyA的分泌信號肽（最后66 個(gè)氨基酸）制備了合成的Fl-V融合基因（缺少終止子）的框內(nèi)基因融合（圖1和圖2)。 所述質(zhì)粒載體中還包括編碼HlyA轉(zhuǎn)運(yùn)裝置的必要組分一一HlyB和HlyD的基因（圖2)。
[0127] 克隆到質(zhì)粒pHtrFl-V-Hly中的所述Fl-V融合DNA插入片段的DNA序列：
[0128] tggacttttgtaaagatggacaataaatttttactttttccagaaactttattccggaacttcgcgtta taaaatgaatctgacgtacacagcaattttaaggagaggacatatggcagatttaactgcaagcaccactgcaacgg caactcttgttgaaccagcccgcatcactcttacatataaggaaggcgctccaattacaattatggacaatggaaac atcgatacagaattacttgttggtacgcttactcttggcggctataaaacaggaaccactagcacatctgttaactt tacagatgccgcgggtgatcccatgtacttaacatttacttctcaggatggaaataaccaccaattcactacaaaag tgattggcaaggattctagagattttgatatctctcctaaggtaaacggtgagaaccttgtgggggatgacgtcgtc ttggctacgggcagccaggatttctttgttcgctcaattggttccaaaggcggtaaacttgcagcaggtaaatacac tgatgctgtaaccgtaaccgtatctaaccaaggatccatcgaaggtcgtatgattagagcctacgaacaaaacccac aacattttattgaggatctagaaaaagttagggtggaacaacttactggtcatggttcttcagttttagaagaattg gttcagttagtcaaagataaaaatatagatatttccattaaatatgatcccagaaaagattcggaggtttttgccaa tagagtaattactgatgatatcgaattgctcaagaaaatcctagcttattttctacccgaggatgccattcttaaag gcggtcattatgacaaccaactgcaaaatggcatcaagcgagtaaaagagttccttgaatcatcgccgaatacacaa tgggaattgcgggcgttcatggcagtaatgcacttctctttaaccgccgatcgtatcgatgatgatattttgaaagt gattgttgattcaatgaatcatcatggtgatgcccgtagcaagttgcgtgaagaattagctgagettaccgccgaat taaagatttattcagttattcaagccgaaattaataagcatctgtctagtagtggcaccataaatatccatgataaa tccattaatctcatggataaaaatttatatggttatacagatgaagagatttttaaagccagcgcagagtacaaaat tctcgagaaaatgcctcaaaccaccattcaggtggatgggagcgagaaaaaaatagtctcgataaaggactttcttg gaagtgagaataaaagaaccggggcgttgggtaatctgaaaaactcatactcttataataaagataataatgaatta tctcactttgccaccacctgctcggataagtccaggccgctcaacgacttggttagccaaaaaacaactcagctgtc tgatattacatcacgttttaattcagetattgaagcactgaaccgtttcattcagaaatatgattcagtgatgcaac gtctgctagatgacacgtctggtaaatatgcatcaacttatgcagacctggataatctgaatccattaattaatgaa atcagcaaaattatttcagctgcaggtaacttcgatgttaaggaggaaagatctgccgcttctttattgcagttgtc cggtaatgccagtgatttttcatatggacggaactcaataactttgaccgcatcagcataa(SEQ ID NO :1)
[0129] 為了評估Fl-V在傷寒沙門氏菌Ty21a中的表達(dá)和分泌，將用pHtrFl-V-hly或之 前構(gòu)建的編碼炭疽芽孢桿菌PA的質(zhì)粒（Osorio et al·，Infect Immun 77(4) : 1475-1482， 2009)轉(zhuǎn)化的Ty21a在具有壯觀霉素選擇的培養(yǎng)基中過夜生長，隨后通過離心收集。將所得 上清級分濃縮至約為原來的1/10。同時(shí)將所得沉淀級分裂解在與所濃縮的上清液體積相等 的體積中。使用市售的針對Fl或LcrV的單克隆抗體，通過蛋白質(zhì)印跡法分析等體積的所 述上清部分和沉淀級分。
[0130] 如圖3所示，所得結(jié)果清楚地證明pHtrFl-V轉(zhuǎn)化的Ty21a產(chǎn)生并分泌Fl-V融合蛋 白。實(shí)際上，在沉淀級分中檢測不到F1-V。根據(jù)所翻譯的DNA序列，所述Fl-V融合蛋白的 預(yù)測分子量約為58kDa。所觀察到的Ty21a分泌的Fl-V的稍高分子量，可能反映了添加了 66個(gè)氨基酸的分泌信號肽HlyA。使用抗LcrV的抗體對Fl-V的檢測檢測到約為55-58kDa 的第二產(chǎn)物。這條帶可能代表已經(jīng)切除HlyA的F1-V。
[0131] 實(shí)施例2 :疫苗構(gòu)建體在小鼠中的免疫原性
[0132] 本實(shí)施例描述了包含F(xiàn)l-V融合表達(dá)構(gòu)建體的傷寒沙門氏菌Ty21a的免疫原性，這 是通過血清IgG效價(jià)和經(jīng)刺激的脾細(xì)胞的細(xì)胞因子表達(dá)所測定。
[0133] 通過免疫A/J小鼠檢測了表達(dá)Fl-V的Ty21a誘導(dǎo)保護(hù)性免疫應(yīng)答的能力。通過 腹膜內(nèi)（i.P.)途徑，使用三個(gè)每兩周一次的劑量（包含產(chǎn)生Fl-V或之前構(gòu)建的炭疽PA的 Ty21a)對10只6-8周齡的小鼠的組進(jìn)行免疫。第三組小鼠接受了產(chǎn)生Fl-V的Ty21a和 產(chǎn)生PA的Ty21a的1:1的混合物。對照組小鼠接受了 3個(gè)劑量的用空pGB-2載體轉(zhuǎn)化的 Ty21a。免疫的小鼠接受2-5X IO7CFU/劑量。在第三次和最后一次免疫后一周，收集血清 和脾細(xì)胞。通過ELISA分析總的循環(huán)Fl-V和PA特異性的IgG效價(jià)。
[0134] Fl-V融合蛋白在Ty21a中的表達(dá)導(dǎo)致在小鼠中產(chǎn)生高的抗Fl-V血清IgG效價(jià)，其 平均的幾何平均效價(jià)約為500, 000 (圖4)。使用表達(dá)Fl-V的Ty21a和表達(dá)PA的Ty21a進(jìn) 行的伴隨免疫導(dǎo)致在小鼠中產(chǎn)生高的抗Fl-V和抗PA IgG效價(jià)。表達(dá)空載體pGB2的Ty21a 對照菌株未導(dǎo)致循環(huán)的抗Fl-V IgG或抗PA IgG。
[0135] 在隨后的實(shí)驗(yàn)中，在以使用Fl-V質(zhì)粒或空pGB-2質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的Ty21a每兩周進(jìn)行3 次免疫（i. P.)的8周齡小鼠中確定了總的血清IgG效價(jià)。經(jīng)免疫的小鼠在0周、2周和4 周時(shí)接受了 2-5X IO7CFU/劑，并在0周、1周、3周和5周時(shí)收集血清。通過ELISA分析總 的循環(huán)Fl-V特異性的IgG效價(jià)。所得結(jié)果表明，3次免疫在小鼠中產(chǎn)生了高的抗Fl-V IgG 效價(jià)（圖5)。
[0136] 幾項(xiàng)現(xiàn)有研宄已經(jīng)表明，下一代鼠疫疫苗應(yīng)旨在同時(shí)誘導(dǎo)鼠疫耶爾森氏菌特異性 的Ig和細(xì)胞介導(dǎo)的免疫（CMI)應(yīng)答?；诖?，對在體外用rFl-V刺激72小時(shí)的所收集的 脾細(xì)胞的細(xì)胞因子應(yīng)答進(jìn)行了測量。
[0137] 未對10只6-8周齡小鼠的組進(jìn)行免疫（對照組），或者通過腹膜內(nèi)途徑使用3個(gè) 每兩周一次的劑量（包含產(chǎn)生Fl-V的Ty21a或空載體pGB2的Ty21a)對它們進(jìn)行免疫。經(jīng) 免疫的小鼠接受2-5 X IO7CFU/劑量。在第三次和最后一次免疫后一周，收集脾細(xì)胞，并在 體外用rFl-V刺激72小時(shí)。收集培養(yǎng)物上清液并針對細(xì)胞因子產(chǎn)生進(jìn)行分析。
[0138] 如圖6A-6D所示，對rFl-V的細(xì)胞因子（IL-2、IFN-y、TNF-a和IL-17)回憶應(yīng)答 是可變的。來自未經(jīng)免疫的小鼠的脾細(xì)胞在用rFl-V刺激時(shí)不分泌IL-2、IFN-γ、TNF-a 或IL-17。但是，來自一些以經(jīng)pHtrFl-V-hly轉(zhuǎn)化的Ty21a免疫的小鼠的脾細(xì)胞表達(dá)大量 的IL-2、IFN-y、TNF-a和IL-17。一只以經(jīng)單獨(dú)的pGB2轉(zhuǎn)化的Ty21a免疫的小鼠對rFl-V 具有明顯的IFN- γ和TNF- α回憶應(yīng)答。
[0139] 實(shí)施例3 :預(yù)防或抑制鼠疫耶爾森氏菌感染的方法
[0140] 本實(shí)施例描述了可被用于預(yù)防或抑制鼠疫耶爾森氏菌感染，從而在處于患病風(fēng)險(xiǎn) 中的受試者中預(yù)防或抑制發(fā)生鼠疫的示例性方法。
[0141] 選擇處于鼠疫耶爾森氏菌感染的風(fēng)險(xiǎn)中的受試者用于進(jìn)行治療。例如，所述受試 者可以是生活在鼠疫是地方流行病的地區(qū)的個(gè)體，或者是已經(jīng)與其他鼠疫受害者接觸過的 受試者。給予所述受試者包含含有Fl-V融合蛋白表達(dá)構(gòu)建體的傷寒沙門氏菌Ty21a細(xì)菌 的免疫原性組合物。所述Fl-V表達(dá)質(zhì)粒包含與大腸桿菌htrA啟動子序列可操作地連接的 鼠疫耶爾森氏菌Fl-V融合蛋白編碼序列以及與Fl-V融合蛋白編碼序列框內(nèi)融合的大腸桿 菌HlyA分泌信號肽編碼序列（SEQ ID NO: 1)。所述免疫原性組合物的合適的治療有效劑量 可由有經(jīng)驗(yàn)的開業(yè)醫(yī)生選擇。在一些實(shí)施例中，所述劑量為約IO6-約108CFU。為了引起足 夠的針對鼠疫耶爾森氏菌的免疫應(yīng)答，可根據(jù)需要給予所述受試者單劑量或多劑量。
[0142] 考慮到所公開的本發(fā)明的原理所適用的許多可能的實(shí)施方案，應(yīng)認(rèn)識到，所示出 的實(shí)施方案只是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)例，而不應(yīng)被認(rèn)為是對本發(fā)明范圍的限制。相反，本發(fā)明的 范圍是由以下的權(quán)利要求書所限定。因此，本發(fā)明人要求保護(hù)所有落入這些權(quán)利要求的范 圍和主旨的發(fā)明作為本發(fā)明人的發(fā)明。
【權(quán)利要求】
1. 一種重組核酸分子，包含與大腸桿菌htrA啟動子序列可操作地連接的鼠疫耶爾森 氏菌（Yersinia pestis)Fl-V融合蛋白編碼序列，其中所述核酸分子包含與SEQ ID N0:1 的核巧酸1-1558至少95 %相同的序列。
2. 權(quán)利要求1的重組核酸分子，其中所述核酸分子包含SEQ ID NO: 1的核巧酸1-1558 的序列。
3. 權(quán)利要求1或2的重組核酸分子，還包含與F1-V融合蛋白編碼序列框內(nèi)融合的分泌 信號膚編碼序列。
4. 權(quán)利要求3的重組核酸分子，其中所述分泌信號膚是大腸桿菌HlyA分泌信號膚。
5. 權(quán)利要求3或4的重組核酸分子，其中所述核酸分子的序列與SEQ ID NO: 1至少 95%相同。
6. 權(quán)利要求5的重組核酸分子，其中所述核酸分子的序列包含SEQ ID NO: 1。
7. -種重組核酸分子，包含與大腸桿菌htrA啟動子序列可操作地連接的鼠疫耶爾森 氏菌F1-V融合蛋白編碼序列，并且還包含與F1-V融合蛋白編碼序列框內(nèi)融合的大腸桿菌 HlyA分泌信號膚編碼序列，其中所述核酸分子的序列包含SEQ ID NO: 1。
8. -種包含權(quán)利要求1-7中任一項(xiàng)的重組核酸分子的質(zhì)粒。
9. 權(quán)利要求8的質(zhì)粒，其中所述質(zhì)粒是低拷貝數(shù)質(zhì)粒。
10. 權(quán)利要求8或權(quán)利要求9的質(zhì)粒，其還包含選擇性標(biāo)記。
11. 權(quán)利要求10的質(zhì)粒，其中所述選擇性標(biāo)記是抗生素抗性基因。
12. 權(quán)利要求8-11中任一項(xiàng)的質(zhì)粒，還包含大腸桿菌HlyB和HlyD蛋白編碼序列。
13. -種質(zhì)粒，包含權(quán)利要求7的重組核酸分子、復(fù)制起點(diǎn)、選擇性標(biāo)記W及大腸桿菌 HlyB和HlyD蛋白編碼序列。
14. 一種傷寒沙口氏菌（Salmonella Typhi)Ty21a細(xì)菌，包含權(quán)利要求1-7中任一項(xiàng)的 重組核酸分子或權(quán)利要求8-13中任一項(xiàng)的質(zhì)粒。
15. -種免疫原性組合物，包括權(quán)利要求14的傷寒沙口氏菌Ty21a細(xì)菌和可藥用載體。
16. 權(quán)利要求15的免疫原性組合物，其中所述組合物被配制為用于口服給藥。
17. -種在受試者中引起針對抗鼠疫耶爾森氏菌的免疫應(yīng)答的方法，包括給予所述受 試者權(quán)利要求14的傷寒沙口氏菌Ty21a細(xì)菌，或給予權(quán)利要求15或權(quán)利要求16的免疫原 性組合物。
18. 權(quán)利要求17的方法，其中所述免疫應(yīng)答是保護(hù)性免疫應(yīng)答。
19. 一種在受試者中預(yù)防鼠疫、降低發(fā)生鼠疫的風(fēng)險(xiǎn)或治療鼠疫的方法，包括給予所述 受試者權(quán)利要求14的傷寒沙口氏菌Ty21a細(xì)菌，或給予權(quán)利要求15或權(quán)利要求16的免疫 原性組合物。
【文檔編號】A61K39/02GK104470537SQ201380038155
【公開日】2015年3月25日 申請日期:2013年5月22日 優(yōu)先權(quán)日:2012年5月23日
【發(fā)明者】D·J·?？? M·奧索里奧, M·R·富特 申請人:美國政府(由衛(wèi)生和人類服務(wù)部的部長所代表)