專利名稱：玉米赤霉醇elisa檢測(cè)試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本實(shí)用新型涉及檢測(cè)玉米赤霉醇?xì)埩袅康脑噭┖?，特別是 檢測(cè)飼料、牛奶、尿液中玉米赤霉醇?xì)埩袅康拿嘎?lián)免疫試劑盒，ELISA (EnzymeLinked ImmunosorbnentAssay)是酶聯(lián)免疫吸附劑測(cè)定的簡(jiǎn)稱，它是繼免疫熒光和放射免疫技術(shù)之 后發(fā)展起來(lái)的一種酶免技術(shù)。背景技術(shù)：
玉米赤霉醇(Zeranol)是自然環(huán)境中的鐮刀菌產(chǎn)生的玉米赤霉 烯酮的還原產(chǎn)物，屬于雌性激素，具有維持副性征和代蛋白同化效應(yīng)，除一般治療用途外， 還被廣泛用于促進(jìn)生長(zhǎng)。其促生長(zhǎng)效果對(duì)反芻動(dòng)物最為顯著，可增重10% 40%，因此在 養(yǎng)牛業(yè)中被大量應(yīng)用。由于雌激素類物質(zhì)具有明顯的致癌效應(yīng)，已被大部分國(guó)家禁止用于 促生長(zhǎng)目的，不得在食品中檢出。目前，常用于玉米赤霉醇?xì)埩魴z測(cè)的方法主要有儀器分析法。儀器分析法主要有 高效液相色譜分析法(HPLC)、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(LC-MS/MS)，這些方法的前處理過(guò)程繁 瑣、檢測(cè)費(fèi)用較高，不宜用于大量樣本篩查，推廣使用受到限制。(三)實(shí)用新型內(nèi)容本實(shí)用新型所要解決的問題是提供一種小巧輕便的玉米赤 霉醇?xì)埩袅繖z測(cè)試劑盒，其操作簡(jiǎn)便，檢測(cè)快速、準(zhǔn)確、靈敏度高，成本低，穩(wěn)定性好，需要的 技術(shù)含量不高，可進(jìn)行一次連續(xù)多個(gè)樣品中玉米赤霉醇?xì)埩袅康臏y(cè)定，減少了檢測(cè)樣本所 需要的時(shí)間。本實(shí)用新型的技術(shù)方案是一種玉米赤霉醇ELISA檢測(cè)試劑盒，包括盒體和盒內(nèi) 的一塊96孔的酶標(biāo)板、一張蓋板膜、14瓶試劑和放試劑的下凹瓶位、一個(gè)自封袋、一份說(shuō)明 書和一份質(zhì)檢報(bào)告，其特征在于酶標(biāo)板采用96孔試劑板作為固相載體，在試劑盒微孔條 上預(yù)包被玉米赤霉醇偶聯(lián)抗原制成的檢測(cè)板，14瓶試劑分別為7瓶標(biāo)準(zhǔn)品溶液、酶標(biāo)二抗、 抗體工作液、顯色液A液、顯色液B液、終止液、濃縮洗滌液、濃縮復(fù)溶液，下凹瓶位共15個(gè)。酶標(biāo)板由外框支撐架及放置其上的可拆的12條酶標(biāo)反應(yīng)微孔條組成，每個(gè)可拆 裝酶標(biāo)反應(yīng)微孔條有8個(gè)反應(yīng)孔，放入真空鋁箔袋中，盒體為硬紙盒，下凹瓶位由塑料泡 沫制成，以塑料硬膜為蓋板膜，蓋板膜的大小與酶標(biāo)板橫切面的大小一致，將14瓶試劑用 不同大小、不同顏色的塑料瓶和玻璃瓶盛裝并固定在下凹瓶位中與酶標(biāo)板、蓋板膜、自封 袋、說(shuō)明書、質(zhì)控報(bào)告一同封裝在硬紙盒內(nèi)，以便于攜帶和運(yùn)輸。14瓶試劑分別為7瓶Iml 標(biāo)準(zhǔn)品溶液、12ml酶標(biāo)二抗、7ml玉米赤霉醇抗體工作液、7ml顯色液A液、7ml顯色液B液、 7ml終止液、40ml濃縮洗滌液、50ml濃縮復(fù)溶液。每一個(gè)試劑盒中的試劑足夠進(jìn)行96次測(cè) 定(包括標(biāo)準(zhǔn)分析孔)，既可進(jìn)行一次連續(xù)多個(gè)樣品的檢測(cè)，也可以將板孔拆開多次檢測(cè)。 將剩下的放回鋁箔袋中用自封袋密封，這樣可以保證試劑盒檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。檢測(cè)時(shí)，樣 本中的玉米赤霉醇將和酶標(biāo)板微孔條上預(yù)包被的玉米赤霉醇偶聯(lián)抗原競(jìng)爭(zhēng)抗玉米赤霉醇 抗體，加入酶標(biāo)二抗后，用TMB底物顯色，樣本吸光度值與樣本中所含玉米赤霉醇的含量成 負(fù)相關(guān)，與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較再乘以其對(duì)應(yīng)的稀釋倍數(shù)，即可得出樣品中玉米赤霉醇?xì)埩袅浚?操作簡(jiǎn)便易行。經(jīng)實(shí)驗(yàn)表明本試劑盒具有很高的靈敏度飼料樣本的最低檢測(cè)限為10 μ g/kg、尿 液樣本的最低檢測(cè)限為0. 5 μ g/kg、牛奶樣本的最低檢測(cè)限為2 μ g/kg、牛肉樣本的最低檢測(cè)限為0.5 μ g/kg;飼料樣本的回收率為80% 士20% ；尿液樣本的回收率為75% 士 15% ； 牛奶樣本的回收率為75% 士 15%;牛肉樣本的回收率為80% 士20%;相對(duì)于其他玉米赤霉 醇檢測(cè)方法，本試劑盒所需儀器較少，所需儀器同類實(shí)驗(yàn)室一般均有配備，所需成本較低。本實(shí)用新型的有益效果是能快速、簡(jiǎn)便、靈敏、準(zhǔn)確地用于玉米赤霉醇?xì)埩袅康?檢測(cè)。


圖1為本實(shí)用新型酶聯(lián)板的側(cè)面縱剖面圖(長(zhǎng)為8. 55cm)；圖2為本實(shí)用新型酶聯(lián)板的側(cè)面橫剖面圖(長(zhǎng)為12. 8cm)；圖3為本實(shí)用新型酶聯(lián)板的俯視圖；圖4為本實(shí)用新型蓋板膜平面圖；圖5為本實(shí)用新型試劑瓶縱剖面平面圖；圖6為本實(shí)用新型固定泡沫模具的俯視圖；圖7為本實(shí)用新型盒體與固定泡沫模具的側(cè)視圖。參見附圖酶標(biāo)反應(yīng)微孔條(2)預(yù)包被玉米赤霉醇偶聯(lián)抗原(3)固定于酶標(biāo)板的 外框支撐架(1)上，酶標(biāo)反應(yīng)微孔條(2)可隨要求拆卸；蓋板膜(4)用于酶標(biāo)板置水浴或恒 溫箱內(nèi)反應(yīng)時(shí)封蓋酶標(biāo)反應(yīng)微孔條O)，蓋板膜大小與酶標(biāo)板橫切面大小一致；透明帽的 半透明PE塑料瓶( 用于封裝40ml濃縮洗滌液；藍(lán)色帽的半透明PE塑料瓶( 用于封裝 50ml濃縮復(fù)溶液；白色帽(6)的白色PE塑料瓶(7)用于封裝7ml顯色液A液，紅色帽(6) 的黑色PE塑料瓶(7)用于封裝7ml顯色液B液，黃色帽(6)的白色PE塑料瓶(7)用于封 裝7ml終止液，紅色帽的白色PE塑料瓶(8)用于封裝12ml酶標(biāo)二抗，綠色帽的白色PE塑料 瓶(8)用于封裝7ml玉米赤霉醇抗體工作液，白色帽的棕色玻璃試劑瓶(9)用于封裝Iml/ 瓶的標(biāo)準(zhǔn)品溶液；泡沫塑料模具(10)有15個(gè)瓶位，放置位置依次為40ml濃縮洗滌液瓶位 (18)，50ml濃縮復(fù)溶液(ll)，7ml顯色液A液瓶位(14)，7ml顯色液B液瓶位(i;3)，7ml終止 液瓶位(1 ，7ml玉米赤霉醇抗體工作液瓶位(16)，12ml酶標(biāo)二抗瓶位(1 ，7個(gè)Iml/瓶 各種濃度的標(biāo)準(zhǔn)品溶液瓶位(17)，盒體為(19)是硬紙盒。
具體實(shí)施方式
一、樣本的前處理1.配液:配液1 :0. OlM氫氧化鈉緩沖液稱取0. 4g氫氧化鈉，加去離子水溶解定容至IOOml配液2 IM氫氧化鈉緩沖液稱取4. Og氫氧化鈉，加去離子水溶解定容至IOOml配液3 乙腈-0. IM氫氧化鈉緩沖液量取90ml乙腈和IOml 0. IM氫氧化鈉緩沖液混合均勻配液4 :6M磷酸緩沖液量取IOOml 85%濃磷酸加入到150ml的去離子水中混合均勻配液5:復(fù)溶工作液[0028]用去離子水將2X濃縮復(fù)溶液按1 1體積比進(jìn)行稀釋(1份2X濃縮復(fù)溶液+1 份去離子水)用于提取樣本的復(fù)溶，復(fù)溶工作液在4°C環(huán)境可保存一個(gè)月。配液6 洗滌工作液用去離子水將20X濃縮洗滌液按1 19體積比進(jìn)行稀釋(1份20X濃縮洗滌液 +19份去離子水)用于酶標(biāo)板的洗滌，洗滌工作液在4°C環(huán)境可保存一個(gè)月。2. (a)飼料樣本處理步驟取適量樣本用勻漿機(jī)4000r/min以上勻漿Imin ；稱取2. 0士0. 05g均質(zhì)物，加入 IOml乙腈-0. IM氫氧化鈉溶液，振蕩lOmin，室溫3000g以上，離心IOmin ；取Iml上清液 在50°C氮?dú)饬飨峦耆稍?；?. 5ml三氯甲烷充分溶解，加入aiil IM氫氧化鈉溶液，振蕩 5min室溫3000g以上，離心IOmin ；取出Iml上清液，加入100 μ 16M磷酸(調(diào)pH = 6. 5)，再 加入5ml三氯甲烷，振蕩lOmin，室溫3000g以上，離心lOmin，取2. 5ml下層有機(jī)相在50°C 氮?dú)饬飨峦耆稍?；用Iml稀釋后的復(fù)溶液溶解干燥的殘留物；再取出溶解后的樣本提取 液與稀釋后的復(fù)溶液按1 9體積比進(jìn)行稀釋1稀釋后的復(fù)溶液+50 μ 1樣本提取 液)；取50 μ 1用于分析。(b)尿液樣本處理步驟取2ml尿液到離心管中，室溫3000g以上離心IOmin ；取Iml上清尿液到離心管中， 加入10 μ 1 Glucuronidase/Arylsulfatase (葡萄糖苷酸酶/芳基硫酸酯酶)，在37°C水浴 3h,再加入5ml三氯甲烷，振蕩lOmin，室溫3000g以上，離心lOmin，取2. 5ml下層有機(jī)相在 50°C氮?dú)饬飨峦耆稍?；用Iml稀釋后的復(fù)溶液溶解干燥的殘留物；取出50 μ 1溶解后的 樣本提取液與稀釋后的復(fù)溶液按1 4體積比進(jìn)行稀釋(50 μ 1樣本提取液+200 μ 1稀釋 后的復(fù)溶液充分混合)；取50 μ 1用于分析。(c)牛奶取新鮮牛奶1ml，加入8μ 1葡萄糖苷酸酶/芳基硫酸酯酶，37 °C酶解池；取出 25 μ 1，加入975 μ 1復(fù)溶液進(jìn)行稀釋；取50 μ 1用于分析。(d)牛肉稱取1. O 士0. Ig樣本，加入2ml去離子水，加入8 μ 1葡萄糖苷酸酶/芳基硫酸酯 酶混勻，37°C酶解；取出加入8μ 1乙腈，振蕩10min，3000g以上離心5min ；取上清5ml， 加入2ml三氯甲烷，加入6ml正己烷，渦動(dòng)振蕩lOmin，3000g以上離心5min ；去上層正己 烷，取中間層吹干；加入Iml復(fù)溶液渦動(dòng)溶解，取200 μ 1加入800 μ 1復(fù)溶液混合；取50 μ 1 用于分析。二、使用試劑盒的操作步驟1、將所需試劑從冷藏環(huán)境中取出，置于室溫Q0-25°C )平衡30min以上，注意每種 液體試劑使用前均須搖勻。2、取出需要數(shù)量的微孔板，將不用的微孔板放入自封袋，保存于2_8°C。3、洗滌工作液在使用前也需回溫。4、編號(hào)將樣本和標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)應(yīng)微孔按序編號(hào)，每個(gè)樣本和標(biāo)準(zhǔn)品做2孔平行，并記 錄標(biāo)準(zhǔn)孔和樣本孔所在的位置。5、加標(biāo)準(zhǔn)品工作液/樣本溶液加標(biāo)準(zhǔn)品工作液/樣本溶液50 μ 1到對(duì)應(yīng)的微孔 中，再加入抗體工作液50 μ 1/孔，輕輕振蕩混勻，用蓋板膜蓋板后置于37°C避光環(huán)境中反應(yīng) 30min。 6、洗板小心揭開蓋板膜，將孔內(nèi)液體甩干，用洗滌工作液250 μ 1/孔，充分洗滌 4-5次，每次間隔10s，用吸水紙拍干(拍干后未被清除的氣泡可用未使用過(guò)的槍頭戳破)。7、加酶標(biāo)二抗加入酶標(biāo)二抗100 μ 1/孔，輕輕振蕩混勻，用蓋板膜蓋板后置37°C 避光環(huán)境中反應(yīng)30min，取出重復(fù)洗板步驟6。8、顯色加入底物液A液50μ 1/孔，再加底物液B液50μ 1/孔，輕輕振蕩混勻，用 蓋板膜蓋板后置37°C避光環(huán)境中反應(yīng)15min。9、測(cè)定加入終止液50 μ 1/孔，輕輕振蕩混勻，設(shè)定酶標(biāo)儀于450nm處(建議用雙 波長(zhǎng)450/630nm檢測(cè)，請(qǐng)?jiān)?min內(nèi)讀完數(shù)據(jù))，測(cè)定每孔OD值。三、結(jié)果判定結(jié)果判定有兩種方法，粗略判定可用第1種方法，定量判定用第2種方法。注意樣 本吸光值與玉米赤霉醇?xì)埩袅砍韶?fù)相關(guān)。1、用樣本的平均吸光度值與標(biāo)準(zhǔn)品吸光度值比較即可得出其濃度范圍(yg/L)。 假設(shè)樣本ι的吸光度值為0. 6，樣本2的吸光度值為1. 0，標(biāo)準(zhǔn)液吸光度值分別是0 μ g/L 為 1. 500 ；0. 05 μ g/L 為 1. 380 ；0. 1 μ g/L 為 1. 200 ；0. 2 μ g/L 為 0. 900 ；0. 4 μ g/L 為 0. 700 ； 0. 8 μ g/L為0. 400。則樣本1的濃度范圍是0. 2 μ g/L-0. 4 μ g/L再乘以其對(duì)應(yīng)的稀釋倍數(shù) 即可得出樣本中玉米赤霉醇?xì)埩舻臐舛确秶粯颖?的濃度范圍是0. 1 μ g/L-0. 2 μ g/L再 乘以其對(duì)應(yīng)的稀釋倍數(shù)即可得出樣本中玉米赤霉醇?xì)埩舻臐舛确秶?、定量分析(1)百分吸光率的計(jì)算，標(biāo)準(zhǔn)品或樣本的百分吸光率等于標(biāo)準(zhǔn)品或樣本的百分吸 光度值的平均值(雙孔)除以第一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)(0標(biāo)準(zhǔn))的吸光度值，再乘以100%，即
B
百分吸光度值(％) = - X 100%
B0B-標(biāo)準(zhǔn)溶液或樣本溶液的平均吸光度值B0-O μ g/L標(biāo)準(zhǔn)溶液的平均吸光度值(2)標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制與計(jì)算以標(biāo)準(zhǔn)品百分吸光率為縱坐標(biāo)，以玉米赤霉醇標(biāo)準(zhǔn)品濃度(μ g/L)的半對(duì)數(shù)為橫 坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。將樣本的百分吸光率代入標(biāo)準(zhǔn)曲線中，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出樣本所對(duì) 應(yīng)的濃度，乘以其對(duì)應(yīng)的稀釋倍數(shù)即為樣本中玉米赤霉醇實(shí)際殘留量。四、測(cè)定前的注意事項(xiàng)1、室溫低于20°C或試劑及樣本沒有回到室溫(20_25°C )會(huì)導(dǎo)致所有標(biāo)準(zhǔn)的OD值 偏低。2、在洗板過(guò)程中如果出現(xiàn)板孔干燥的情況，則會(huì)出現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)曲線不成線性，重復(fù)性 不好的現(xiàn)象。所以洗板拍干后應(yīng)立即進(jìn)行下一步操作。3、每加一種試劑前需將其搖勻。4、反應(yīng)終止液為2M硫酸，避免接觸皮膚。5、不要使用過(guò)了有效日期的試劑盒；也不要使用過(guò)了有效期的試劑盒中的任何試 齊U，摻雜使用過(guò)了有效期的試劑盒會(huì)引起靈敏度的降低；不要交換使用不同批號(hào)試劑盒中的試劑。6、儲(chǔ)存條件保存試劑盒于2_8°C，不要冷凍，將不用的酶標(biāo)板微孔板放進(jìn)自封袋重新密封。標(biāo) 準(zhǔn)物質(zhì)和無(wú)色的發(fā)色劑對(duì)光敏感，因此要避免直接暴露在光線下。7、試劑變質(zhì)的跡象發(fā)色試劑有任何顏色表明發(fā)色劑變質(zhì)，應(yīng)當(dāng)棄之。0標(biāo)準(zhǔn)的吸光度G50/630nm)值 小于0. 5 (A450nm < 0. 5)時(shí)，表示試劑可能變質(zhì)。8、在加入底物液A液和底物液B液后，一般顯色10-15min即可。若顏色較淺，可 延長(zhǎng)反應(yīng)時(shí)間到20min(或更長(zhǎng))，但不得超過(guò)30min。反之，則減短反應(yīng)時(shí)間。9、該試劑盒最佳反應(yīng)溫度為37°C，溫度過(guò)高或過(guò)低將導(dǎo)致檢測(cè)吸光度值和靈敏度 發(fā)生變化。
權(quán)利要求1.一種玉米赤霉醇ELISA檢測(cè)試劑盒，包括盒體和盒內(nèi)的一塊96孔的酶標(biāo)板、一張蓋 板膜、14瓶試劑和放試劑的下凹瓶位、一個(gè)自封袋、一份說(shuō)明書和一份質(zhì)檢報(bào)告，其特征在 于酶標(biāo)板是采用96孔試劑板作為固相載體，在試劑盒微孔條上預(yù)包被玉米赤霉醇偶聯(lián)抗 原制成的檢測(cè)板，14瓶試劑分別為7瓶標(biāo)準(zhǔn)品溶液、酶標(biāo)二抗、抗體工作液、顯色液A液、顯 色液B液、終止液、濃縮洗滌液、濃縮復(fù)溶液，下凹瓶位共15個(gè)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于盒體是硬紙盒；96孔的聚苯乙烯酶標(biāo) 板，放于真空鋁箔袋內(nèi)；蓋板膜是塑料硬膜；標(biāo)準(zhǔn)品溶液用白色帽的棕色玻璃瓶，酶標(biāo)二抗 用紅色帽的白色PE塑料瓶，抗體工作液用綠色帽的白色PE塑料瓶，顯色液A液用白色帽的 白色PE塑料瓶，顯色液B液用紅色帽的黑色PE塑料瓶，終止液用黃色帽的白色PE塑料瓶， 濃縮洗滌液用透明帽的半透明PE塑料瓶，濃縮復(fù)溶液用藍(lán)色帽的半透明PE塑料瓶，下凹瓶 位由塑料泡沫制成。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于酶標(biāo)板是由外框支撐架及放置其上的 可拆的12條酶標(biāo)反應(yīng)微孔條組成，每個(gè)可拆裝酶標(biāo)反應(yīng)微孔條有8個(gè)反應(yīng)孔；蓋板膜大小 與酶標(biāo)板橫切面大小一致；標(biāo)準(zhǔn)品溶液7瓶，Iml/瓶；酶標(biāo)二抗1瓶，12ml ；抗體工作液1 瓶，7ml ；顯色液A液1瓶，7ml ；顯色液B液1瓶，7ml ；終止液1瓶，7ml ；濃縮洗滌液1瓶， 40ml ；濃縮復(fù)溶液1瓶，50ml。
專利摘要本實(shí)用新型涉及一種檢測(cè)飼料、牛奶、尿液中玉米赤霉醇?xì)埩袅康拿嘎?lián)免疫試劑盒。該試劑盒組成包括96孔酶標(biāo)板、酶標(biāo)二抗、玉米赤霉醇抗體工作液、玉米赤霉醇7個(gè)濃度的標(biāo)準(zhǔn)品溶液、底物顯色液、終止液、濃縮洗滌液、濃縮復(fù)溶液、蓋板膜、自封袋、說(shuō)明書和質(zhì)檢報(bào)告。采用間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA方法，在酶標(biāo)板微孔條上預(yù)包被偶聯(lián)抗原，樣本中殘留的玉米赤霉醇將和微孔條上預(yù)包被的偶聯(lián)抗原競(jìng)爭(zhēng)抗玉米赤霉醇抗體，加入酶標(biāo)二抗后，用TMB底物顯色，樣本吸光度值與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較再乘以其對(duì)應(yīng)的稀釋倍數(shù)，即可得出樣品中玉米赤霉醇的殘留量。與儀器分析技術(shù)相比具有使用方便、高靈敏度等特點(diǎn)，可在飼料、牛奶、尿液中玉米赤霉醇的殘留量檢測(cè)中發(fā)揮重要作用。
文檔編號(hào)G01N33/545GK201852836SQ20102058660
公開日2011年6月1日 申請(qǐng)日期2010年10月27日 優(yōu)先權(quán)日2010年10月27日
發(fā)明者何方洋, 余厚美, 馮月君, 劉福林, 段盈盈, 王建霞, 蒲小容 申請(qǐng)人:北京勤邦生物技術(shù)有限公司