專利名稱：導電微粒子介導電化學發(fā)光信號的免疫檢測方法
技術領域：
本發(fā)明涉及電化學發(fā)光免疫檢測技術領域，是一種導電微粒子介導電化學發(fā)光信號的免疫檢測方法。
背景技術：
目前在生物化學和生物物質(zhì)中，對于痕量待測物包括環(huán)境污染物、藥物、激素、抗體、核酸等的高靈敏度定量篩選和檢測已經(jīng)成為廣大研究工作者和臨床工作者關注的焦點之一。為了實現(xiàn)痕量待測物的高特異性檢測，各種基于生物特異性反應如抗原-抗體技術、 核酸雜交技術、蛋白-配體技術等不同生物化學方法和體系日益發(fā)展起來，這種體系可以通過在生物分子上標記不同標記物進行定量檢測。例如，最初使用125I作為標記物，通過放射性信號測量進行檢測定量。這些方法精密度高，測定可靠，但由于放射性元素的使用，需要建立特殊的實驗室，否則對人體會造成很大的傷害。另外，125I有一定的半衰期。為了克服這些缺點，后來發(fā)展了使用熒光物質(zhì)如FITC等作為標記物，采用生物熒光的方法進行檢測。但其靈敏度受到了限制。后來在20世紀90年代，Leland等人建立了電化學發(fā)光反應系統(tǒng)之后，以電子得失過程中的電位差做能量激發(fā)源的電化學發(fā)光分析相應建立。電化學發(fā)光(ECL)是指由電化學反應引起的化學發(fā)光過程。在電極上施加一定的電壓或電流時，電極上發(fā)生電化學反應，在電極反應產(chǎn)物之間、或電極反應產(chǎn)物與溶液中某種組分之間發(fā)生化學反應而產(chǎn)生激發(fā)態(tài)，當激發(fā)態(tài)返回到基態(tài)時產(chǎn)生發(fā)光現(xiàn)象。電化學發(fā)光的現(xiàn)象很早就被發(fā)現(xiàn)，運用電化學發(fā)光進行檢測分析的文獻報道直至80年代初才出現(xiàn)，90年代開始用于試劑的臨床檢測中。從整體上講，電化學發(fā)光包括了電化學和化學發(fā)光兩個過程，故是化學發(fā)光的一種發(fā)展，但同時與化學發(fā)光又有一定的區(qū)別和其獨特的優(yōu)勢一般的化學發(fā)光生物分析的標記物是化學發(fā)光反應催化酶(如過氧化物酶、堿性磷酸酶等)或化學發(fā)光分子(如魯米諾、吖啶酯等)，其發(fā)光強度受周圍環(huán)境的影響較大，而且穩(wěn)定性不高，特別是生物酶。另外，在生物特異性檢測時，必須分離游離和結合相，操作步驟較多。而電化學發(fā)光免疫分析一般采用聯(lián)吡啶釕Ru(bpy)32+為標記物，Ru(bpy)32+在三丙胺陽離子自由基(TPA+‘)的催化及三角形脈沖電壓激發(fā)下，只需毫秒內(nèi)就可發(fā)出穩(wěn)定的光。 Ru(bpy)32+在發(fā)光過程中的再循環(huán)利用大大提高了分析的靈敏度；無需將結合相和游離相分開，從而使檢測步驟大大簡化；小分子的金屬配合物作為標記物，穩(wěn)定性高。因此，電化學發(fā)光生物分析有其突出的優(yōu)點標記物穩(wěn)定，靈敏度高，可實現(xiàn)多元檢測，可實現(xiàn)均相免疫分析，可實現(xiàn)全自動化。ECL具有更好的發(fā)展趨勢。目前報道的電化學發(fā)光生物分析方法，主要是將生物分子通過各種不同的技術固定在具有較高電化學發(fā)光活性的金、鉬金等金屬電極或碳、玻碳等非金屬電極表面，然后通過特異性結合反應，實現(xiàn)對待測物的電化學發(fā)光檢測。但是，由于用于電化學發(fā)光檢測的共反應物TPA在上述電極上都能產(chǎn)生少量的發(fā)光，采用這種技術具有無法克服的背景光，因而仍然無法滿足痕量物質(zhì)的檢測要求。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是公開一種導電微粒子介導電化學發(fā)光信號的免疫檢測方法，通過克服現(xiàn)有技術中的背景發(fā)光問題，建立一種可以實現(xiàn)高靈敏度檢測的新型電化學發(fā)光免疫分析方法，該方法背景低、信噪比高，可滿足痕量物質(zhì)的檢測要求。為達到上述目的，本發(fā)明的技術解決方案是—種導電微粒子介導電化學發(fā)光信號的檢測方法，其利用具有生物特異性結合反應性能的導電微粒子介導電化學發(fā)光信號；包括步驟a)以一種具有電化學發(fā)光活性的導電材料制成微粒子，在微粒子表面固定針對待測物的抗體分子；b)在一個非電化學發(fā)光活性的電極上，固定能與a)步中抗體分子形成二元免疫復合物的抗原分子，或固定能與a)步中抗體分子和待測物形成三元夾心免疫復合物的抗體分子；C)加入待測物后，微粒子通過特異性的免疫結合反應，在電極表面形成抗原-抗體免疫復合物；d)在有電化學發(fā)光物質(zhì)和共反應物存在時，向上述電極施加電壓，在微粒子表面產(chǎn)生電化學發(fā)光信號，進而對待測物進行定量測量。所述的電化學發(fā)光信號的檢測方法，其所述微粒子的尺寸是微米級或納米級；微粒子的形狀是圓形、橢圓形或棒狀。所述的電化學發(fā)光信號的檢測方法，其所述具有電化學發(fā)光活性的導電材料，為金、鉬金材料，或碳材料。所述的電化學發(fā)光信號的檢測方法，其所述的待測物是有機化合物、核苷酸、核糖核酸、脫氧核糖核酸、單糖、多糖、氨基酸、多肽、或蛋白質(zhì)。所述的電化學發(fā)光信號的檢測方法，其所述非電化學發(fā)光活性的電極，是氧化銦錫的金屬氧化物電極，或鎳金屬電極。所述的電化學發(fā)光信號的檢測方法，其所述電化學發(fā)光分子通過化學方法固定在導電微粒子的表面。所述的電化學發(fā)光信號的檢測方法，其所述電化學發(fā)光物質(zhì)和共反應物，存在于檢測溶液中。本發(fā)明與現(xiàn)有的其他方法相比具有以下優(yōu)點1)目前流行的電化學發(fā)光免疫方法，均使用具有電化學發(fā)光活性的材料作為電極，如金，玻碳電極等。在此類電極上進行檢測，共反應物TPA的背景發(fā)光較高。本發(fā)明使用了非電化學發(fā)光活性材料如氧化銦錫或鎳作為電極，大大降低了 TPA的背景發(fā)光。由于微粒子使用具有電化學發(fā)光活性的導電材料，特異性免疫反應發(fā)生后電化學發(fā)光信號的檢測不受電極材料的影響。2)在目前流行的電化學發(fā)光免疫檢測方法中，必須事先通過復雜的化學反應將電化學發(fā)光信號分子標記在生物分子上，然后進行免疫反應。本發(fā)明由于使用了非電化學發(fā)光活性材料作為電極，可以將電化學發(fā)光信號分子放在檢測溶液中，而不產(chǎn)生背景發(fā)光。因此，本發(fā)明免去了繁瑣的標記步驟?；迷谀壳傲餍械碾娀瘜W發(fā)光免疫檢測方法中，標記在生物分子上的電化學發(fā)光信號分子的數(shù)目有限，一般在10個以下，因而產(chǎn)生的電化學發(fā)光信號有限。在本發(fā)明中，電化學發(fā)光信號分子可以固定在微粒子表面。由于微粒子的表面積比較大，可以固定大量的信號分子，每個微粒子上固定的信號分子數(shù)目可以高達幾十甚至幾百個。由此提高了檢測信號的強度，進而提高了方法的靈敏度和動態(tài)范圍。


圖1本發(fā)明的導電微粒子介導電化學發(fā)光信號的免疫檢測方法原理圖；圖2本發(fā)明的導電微粒子介導電化學發(fā)光信號的免疫檢測方法流程圖；圖3合成的粒徑為21nm的金納米顆粒的透射電子顯微鏡照片；圖4結合在氧化銦錫ITO電極表面的粒徑為21nm的金納米顆粒的掃描電子顯微鏡照片；圖5不同電極在Ru (bpy) 32+/三丙胺體系中的電化學發(fā)光信號曲線圖，其中，曲線 (a)是結合了納米金的氧化銦錫ITO電極曲線；曲線(b)是沒有結合納米金的氧化銦錫ITO 電極曲線。
具體實施例方式前期科研工作發(fā)現(xiàn)，在氧化銦錫、鎳等工作電極上，共反應物TPA不能發(fā)生電化學氧化反應，因此不產(chǎn)生背景發(fā)光信號，與電化學發(fā)光分子共存時也不產(chǎn)生電化學發(fā)光特異信號?；谏鲜鲈?，本發(fā)明提出了一種利用具有生物親和反應性能的導電微粒子介導電化學發(fā)光的檢測方法。本發(fā)明方法通過特異性的生物親和反應，將具有電化學發(fā)光活性的導電微粒子(金、鉬金、碳等)引入到?jīng)]有電化學發(fā)光活性的電極(氧化銦錫、鎳等)上，使電極得到活化。在加入電化學發(fā)光物質(zhì)和共反應物后，能在微粒子表面產(chǎn)生電化學發(fā)光信號，進而對待測物進行定量測量。當待測物質(zhì)不存在時，特異性生物結合反應不發(fā)生，微粒子不會引入到電極上。由于電極材料沒有電化學發(fā)光活性，即使有電化學發(fā)光分子和共反應物存在，發(fā)光強度也非常低，因此檢測背景非常低。而當待測物質(zhì)存在時，微粒子通過特異性生物結合反應被引入到電極上。雖然電化學發(fā)光分子和共反應物在非電化學發(fā)光活性的電極上不產(chǎn)生電化學發(fā)光信號，但它們在高活性的導電微粒子上產(chǎn)生電化學發(fā)光信號。 簡而言之，由于在非電化學發(fā)光活性的電極表面進行生物親和反應，背景信號得到有效抑制；通過生物特異性反應引入高活性的電化學發(fā)光材料作為電極反應界面，改善了電化學發(fā)光行為特征，提高了分析的靈敏度。與現(xiàn)有的其他電化學發(fā)光分析方法相比，該方法具有背景低、信噪比高等優(yōu)點。目前國內(nèi)外還沒有采用這種方法的科研文獻和專利。圖1為本發(fā)明的導電微粒子介導電化學發(fā)光信號的免疫檢測方法原理圖。以夾心免疫檢測方式為例，其中，1 非電化學發(fā)光活性的電極(如氧化銦錫)；2 能夠特異性結合待測物的抗體；3 待測物；4 固定在微粒子表面、能夠與2和待測物形成三元夾心免疫復合物的抗體；5 有電化學發(fā)光活性的微粒子。本發(fā)明方法在實施過程中使用的試劑包括以下幾種成分固定有抗原或抗體生物分子的微粒子，固定有抗體或抗原生物分子的電極，待測物質(zhì)，以及可以產(chǎn)生電化學發(fā)光信號的信號分子和共反應物。使用的裝置包括恒電位儀和弱光檢測器(光電倍增管PMT或 CCD成像儀等)。待測物質(zhì)、固定有生物分子的微粒子和固定有生物分子的電極在一定條件下孵育一段時間后，可以形成一種特異性的免疫復合物。電極清洗后，加入電化學發(fā)光信號分子和共反應物，通過恒電位儀向電極施加電壓，可在產(chǎn)生電化學發(fā)光信號。根據(jù)電化學發(fā)光信號的強度對待測物質(zhì)進行定量分析。以氧化銦錫ITO電極為非電化學發(fā)光活性電極，金納米顆粒為電化學發(fā)光活性微粒子，親和素(avidin)-抗avidin抗體的特異性免疫結合反應為例，來說明本發(fā)明方法的具體實施流程，參見圖2所示(1)粒徑為21nm的金納米顆粒的合成用于合成納米金的所有玻璃儀器均在王水(HNO3 HCl = 1 3，V/V)中徹底浸泡M小時，然后用超純水清洗，100°C烘干2-3小時備用。簡而言之，IOOmL 0.01%的HClO4 回流加熱至沸騰后，加入的檸檬酸鈉1. 5mL ；繼續(xù)加熱攪拌沸騰15min，冷卻至室溫后加入適量高純水至溶液體積為100mL，4°C保存?zhèn)溆?。圖3為合成的金納米顆粒的透射電子顯微鏡照片，粒徑大約為21nm。(2)納米金修飾ITO電極的電化學發(fā)光響應將裸ITO電極經(jīng)過硅烷化處理，即首先將ITO電極在1 %氨水，80°C回流lh，再用大量的純水清洗(5min，三次)，烘干。再將其浸入2% (V/V)氨基硅烷化試劑(3-氨基丙基-三乙氧基硅烷)的無水甲苯溶液中室溫緩慢振蕩反應一定時間反應完成后取出，清洗除去表面非特異吸附的硅烷試劑。接下來將(1)步中合成的納米金滴涂在電極表面，利用 Au-NH2鍵將納米金固定在ITO電極表面。圖4即為納米金修飾ITO電極的掃描電子顯微鏡圖。將此修飾有納米金的ITO電極在0. IM三丙胺和1 μ M的Ru (bpy) 32+溶液中進行測定，并與未修飾納米金的裸ITO電極進行比較。電化學裝置為CHI 660B電化學分析儀(上海辰華儀器公司)，采用的三電極體系為修飾了納米金的ITO或裸ITO為工作電極，Ag/ AgCl電極為參比電極(3MKC1)，鉬片為輔助電極，工作電極接觸面積為0.25cm2。電化學發(fā)光信號使用光電倍增管(日本濱松，型號H9306-03)轉化為電信號，利用CHI 660B電化學分析儀對產(chǎn)生的電信號進行輔助記錄，以電壓方式輸出，電化學發(fā)光檢測在密閉的暗箱中進行。結果如圖5所示不同電極在Ru (bpy) 32+/三丙胺體系中的電化學發(fā)光信號曲線，曲線(a)是結合了納米金的氧化銦錫ITO電極曲線；曲線(b)是沒有結合納米金的氧化銦錫 ITO電極曲線。測量條件1μΜ Ru(bpy)32+，0. IM三丙胺，150mM磷酸緩沖液，ρΗ 7.4。參比電極Ag/AgCl (3M KCl)，電壓掃速100mV/s.(3)抗avidin抗體在金納米顆粒上的固定用0. lmol/L K2CO3分別將上述合成的金納米顆粒和抗avidin抗體溶液的ρΗ調(diào)至 9. 0，電磁攪拌抗體溶液，加入金納米顆粒溶液，繼續(xù)攪拌lOmin，加入聚乙二醇(分子量 20KD)作為穩(wěn)定劑，以防止抗體與金顆粒聚合發(fā)生沉淀。將此納米金-抗體結合物在4°C重力14000G離心lh，仔細吸去上層清液，將沉淀物用含有0. 聚乙二醇的5mM硼酸鈉溶液 (pH = 8. 8)重新懸浮。重復上述離心、分散步驟以去除溶液中殘留的抗體。(4)免疫反應步驟將氧化銦錫(ITO)電極分別用洗滌劑(15min)，純水(5min,兩次)，丙酮(5min)， 異丙醇(5min)和純水(lOmin，三次)超聲清洗，置于烘箱50°C烘干，切割成2. 5X0. 5cm2的片。吸取10 μ L濃度為0. 25mg/mL的avidin QOmM PB，pH = 7. 4)溶液，將其均勻鋪展到上述ITO電極表面，溶液接觸面積為0. 5X0. 5cm2。反應一小時后，電極用水搖洗5分鐘，氮氣吹干。吸取10 μ L上述制備的納米金-抗體復合物溶液均勻涂敷在固定了 avidin的電極表面，37°C反應2h后，用20mM PBT (0. 05% Tween 20，pH = 7. 4)洗劑三次，氮氣吹干。(5)電化學發(fā)光信號的檢測電化學發(fā)光信號檢測在0. IM三丙胺和ΙμΜ的Ru(bpy)32+溶液中(pH7. 4，150mM磷酸緩沖液)進行。電化學裝置為CHI 660B電化學分析儀(上海辰華儀器公司)，采用的三電極體系為經(jīng)過免疫反應后的氧化銦錫電極(ITO)為工作電極，Ag/AgCl電極為參比電極 (3M KCl)，鉬片為輔助電極，工作電極接觸面積為0.25cm2。電化學發(fā)光信號使用光電倍增管(日本濱松，型號H9306-03)轉化為電信號，利用CHI 660B電化學分析儀對產(chǎn)生的電信號進行輔助記錄，以電壓方式輸出，電化學發(fā)光檢測在密閉的暗箱中進行。本發(fā)明方法通過特異性的生物親和反應，將具有電化學發(fā)光活性的導電微粒子引入到?jīng)]有電化學發(fā)光活性的電極上，使電極得到活化。在加入電化學發(fā)光物質(zhì)和共反應物后，能在微粒子上產(chǎn)生電化學發(fā)光信號，進而對待測物進行定量測量。與現(xiàn)有的其他電化學發(fā)光分析方法相比，該方法具有背景低、信噪比高等優(yōu)點，可以用于環(huán)境化學污染物、藥物、 激素、抗體、蛋白質(zhì)、核酸等各類物質(zhì)的高靈敏檢測。
權利要求
1.一種導電微粒子介導電化學發(fā)光信號的免疫檢測方法，其特征在于利用具有生物特異性結合反應性能的導電微粒子介導電化學發(fā)光信號；包括步驟a)以一種具有電化學發(fā)光活性的導電材料制成微粒子，在微粒子表面固定針對待測物的抗體分子；b)在一個非電化學發(fā)光活性的電極上，固定能與a)步中抗體分子形成二元免疫復合物的抗原分子，或固定能與a)步中抗體分子和待測物形成三元夾心免疫復合物的抗體分子；c)加入待測物后，微粒子通過特異性的抗原-抗體免疫反應，在電極表面形成免疫復合物；d)在有電化學發(fā)光物質(zhì)和共反應物存在時，向上述電極施加電壓，在微粒子表面產(chǎn)生電化學發(fā)光信號，進而對待測物進行定量測量。
2.如權利要求1所述的電化學發(fā)光信號的免疫檢測方法，其特征在于所述微粒子的尺寸是微米級或納米級；微粒子的形狀是圓形、橢圓形或棒狀。
3.如權利要求1所述的電化學發(fā)光信號的免疫檢測方法，其特征在于所述具有電化學發(fā)光活性的導電材料，為金、鉬金材料，或碳材料。
4.如權利要求1所述的電化學發(fā)光信號的免疫檢測方法，其特征在于所述的待測物是有機化合物、核苷酸、核糖核酸、脫氧核糖核酸、單糖、多糖、氨基酸、多肽、或蛋白質(zhì)。
5.如權利要求1所述的電化學發(fā)光信號的免疫檢測方法，其特征在于所述非電化學發(fā)光活性的電極，是氧化銦錫金屬氧化物電極，或鎳金屬電極。
6.如權利要求1所述的電化學發(fā)光信號的免疫檢測方法，其特征在于所述電化學發(fā)光分子通過化學方法固定在導電微粒子的表面。
7.如權利要求1所述的電化學發(fā)光信號的免疫檢測方法，其特征在于所述電化學發(fā)光物質(zhì)和共反應物，存在于檢測溶液中。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種導電微粒子介導電化學發(fā)光信號的免疫檢測方法，包括a)以一種具有電化學發(fā)光活性的導電材料制成微粒子，在微粒子表面固定針對待測物的抗體分子；b)在非電化學發(fā)光活性的電極上固定能與a)步中抗體分子形成二元免疫復合物的抗原分子，或固定能與a)步中抗體分子和待測物形成三元夾心免疫復合物的抗體分子；c)加入待測物后，微粒子通過特異性的抗原-抗體免疫反應，在電極表面形成免疫復合物；d)在有電化學發(fā)光物質(zhì)和共反應物存在時，向電極施加電壓，在微粒子表面產(chǎn)生電化學發(fā)光信號，進而對待測物進行定量測量。本發(fā)明具有背景低、信噪比高等優(yōu)點，可以實現(xiàn)高靈敏度檢測待測物的電化學發(fā)光免疫分析方法。
文檔編號G01N33/53GK102565381SQ20101059147
公開日2012年7月11日 申請日期2010年12月8日 優(yōu)先權日2010年12月8日
發(fā)明者趙利霞, 郭良宏, 黃榮富 申請人:中國科學院生態(tài)環(huán)境研究中心