專利名稱：一種檢測克倫特羅的方法及其專用化學發(fā)光免疫試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種檢測克倫特羅的方法及其專用化學發(fā)光免疫試劑盒。目前動物性食品安全已成為全世界關(guān)注的焦點，其中獸藥殘留問題是影響動物 性食品安全的最主要因素之一，由于動物樣本成分復(fù)雜，待測物濃度較低，而且大多數(shù)取 樣量很少，這就對分析方法的選擇性和靈敏度提出了更高的要求?；瘜W發(fā)光免疫分析 (Chemiluminescence analysis,CL1A)技術(shù)將高靈敏的化學發(fā)光技術(shù)與高特異性的免疫反 應(yīng)結(jié)合起來，具有靈敏度高、特異性強、線性范圍寬、操作簡便、不需要十分昂貴的儀器設(shè)備 等特點。CLIA不需要外來光源，具有比熒光免疫分析更高的信噪比，比常規(guī)的酶聯(lián)免疫吸附 檢測方法的抗背景干擾能力強，其靈敏度比ELISA高1至2個數(shù)量級，檢測范圍可達6個數(shù) 量級，自動化程度高，提高了分析方法的精密度，CLIA已經(jīng)成為一種先進的痕量或超痕量物 質(zhì)的檢測技術(shù)。CLIA在獸醫(yī)學、醫(yī)學、食品分析等方面將會有更廣闊的應(yīng)用前景?？藗愄亓_(Clenbuterol，CLE)是一種β -腎上腺素受體激動劑，具有松弛支氣管 平滑肌的作用，主要用于治療豬、牛等的支氣管哮喘等疾病。當使用量為臨床治療劑量的 5-10倍時，具有促進蛋白質(zhì)合成和脂肪分解的作用，可顯著體高胴體瘦肉率和飼料報酬，且 對豬的飼養(yǎng)效應(yīng)尤為明顯。但是，克倫特羅毒副作用較大，歐盟和中國等國家均禁止其作為 飼料添加劑使用，一些不法分子不顧消費者的健康安全，仍將其利用于畜牧生產(chǎn)中，導(dǎo)致其 在畜禽產(chǎn)品中殘留，危害公眾健康。動物組織中克倫特羅殘留的檢測方法主要采用氣相色 譜法、液相色譜法、氣相色譜_質(zhì)譜法、液相色譜_聯(lián)質(zhì)譜法、酶聯(lián)免疫法等。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個目的是提供一種檢測克倫特羅的專用化學發(fā)光免疫試劑盒。本發(fā)明提供的一種檢測克倫特羅的化學發(fā)光免疫試劑盒，包括克倫特羅特異性抗 體、包被原和標準品溶液；所述包被原為克倫特羅半抗原與載體蛋白的偶聯(lián)物；其結(jié)
權(quán)利要求
一種檢測克倫特羅的化學發(fā)光免疫試劑盒，包括克倫特羅特異性抗體、包被原和標準品溶液；所述包被原為克倫特羅半抗原與載體蛋白的偶聯(lián)物；其結(jié)構(gòu)式如式I所示(式I)。FSA00000216081000011.tif
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的化學發(fā)光免疫試劑盒，其特征在于所述試劑盒還包括發(fā)光 液、濃縮洗滌液、濃縮復(fù)溶液、包被緩沖液、封閉液和酶標抗抗體；所述試劑盒由克倫特羅特異性抗體、包被原、標準品溶液、發(fā)光液、濃縮洗滌液、濃縮復(fù) 溶液、包被緩沖液、封閉液和酶標抗抗體組成。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的化學發(fā)光免疫試劑盒，其特征在于所述克倫特羅特異 性抗體為克倫特羅單克隆抗體或克倫特羅多克隆抗體，所述克倫特羅單克隆抗體是由保藏 號為CGMCC No. 3777的對克倫特羅的單克隆雜交瘤細胞株CLE分泌的抗體。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3中任一所述的化學發(fā)光免疫試劑盒，其特征在于所述標準品溶 液中標準品的濃度為ο μ g/L、0. 1 μ g/L、0. 5 μ g/L、1 μ g/L、10 μ g/L或100 μ g/L，所述標準 品為克倫特羅；所述發(fā)光液由A液和B液組成，發(fā)光液A液為過氧化氫；發(fā)光液B液為魯米諾溶液；所述濃縮洗滌液是將0. 05g疊氮化鈉和IOOmL濃度為0. 02M、pH為7. 4的磷酸鹽緩沖 液混合得到溶液；所述濃縮復(fù)溶液是將0. Ig牛血清白蛋白和IOOmL濃度為0. 05mol/L、pH為7. 4的磷酸 鹽緩沖液混合得到的溶液；所述包被緩沖液是PH值為9. 6的濃度為0. 03mol/L的碳酸鹽緩沖液；所述封閉液是將0. Olg疊氮化鈉、IOg牛血清白蛋白和IOOmL濃度為0. 03mol/L、pH值 為7. 4磷酸鹽溶液混合得到的溶液。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4中任一所述的化學發(fā)光免疫試劑盒，其特征在于所述包被原是按照如下方法制備得到的a、將每5mg克倫特羅半抗原加入2mL0. 5M的 硫酸水溶液中，得到的溶液稱為A液；將每50mg的載體蛋白溶于4mL濃度為100mg/mL的碳 酸鈉水溶液中，得到的溶液稱為B液；將每30mg亞硝酸鈉溶于ImL水得到的溶液稱為C液； 在0°C條件下，將C液加入到A液中得到的混合物稱為D液；b、將D液逐滴加入到B液中，得到D液和B液的混合液；逐滴加入的方式為從開始加入 時計起，6min后開始攪拌混合液，并使混合液的pH保持在9_10之間，滴加完畢后，繼續(xù)攪拌 反應(yīng)4h，將得到的產(chǎn)物透析，得到所述包被原；所述克倫特羅半抗原的結(jié)構(gòu)式如式II所示(式 I)。
6.根據(jù)權(quán)利要求1-5中任一所述的化學發(fā)光免疫試劑盒，其特征在于所述克倫特羅 半抗原為克倫特羅。
7.根據(jù)權(quán)利要求1-6中任一所述的化學發(fā)光免疫試劑盒，其特征在于所述載體蛋白為鼠血清白蛋白、牛血清白蛋白、卵清蛋白或血藍蛋白，優(yōu)選為卵清蛋白；所述酶標抗抗體為辣根過氧化物酶標記的羊抗鼠抗抗體。
8.—種檢測克倫特羅的方法，包括以下步驟1)樣品前處理將每2g動物組織勻漿后，加入IOmL 0. IM高氯酸水溶液，振蕩混合lOmin，以3000g的 速度離心5min，將2mL上清液的pH值調(diào)至11，加入2mL乙酸乙酯與異丙醇混合液混勻， 3000g離心5min，取上層有機相氮氣吹干，加入ImL復(fù)溶液溶解殘留物，獲得待測樣本溶液； 所述乙酸乙酯與異丙醇混合液是由體積比為8 2的乙酸乙酯與異丙醇混合得到的；所述 動物組織為豬肉或豬肝；或取每IOmL豬尿以3000g離心5min ；取上清液，用復(fù)溶液稀釋5倍后獲得待測樣本 溶液；所述復(fù)溶液為將所述濃縮復(fù)溶液用0. 05mol/L、pH值為7. 4的磷酸鹽緩沖液稀釋10倍 得到的；2)利用權(quán)利要求1-7中任一所述的檢測克倫特羅的化學發(fā)光免疫試劑盒檢測步驟1) 中的樣本溶液。
9.由保藏號為CGMCCNo. 3777的對克倫特羅的單克隆雜交瘤細胞株CLE分泌的克倫特 羅單克隆抗體。
10.保藏號為CGMCCNo. 3777的對克倫特羅的單克隆雜交瘤細胞株CLE。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種檢測克倫特羅的方法及其專用化學發(fā)光免疫試劑盒。本發(fā)明所提供的檢測克倫特羅的專用化學發(fā)光免疫試劑盒，包括克倫特羅特異性抗體、包被原和標準品溶液；所述包被原為克倫特羅半抗原與載體蛋白的偶聯(lián)物。本發(fā)明的檢測方法，具有樣品前處理過程簡單、操作簡便、費用低廉、特異性高、靈敏度高、精確度高等特點，能夠現(xiàn)場監(jiān)控且適合大量樣本的篩查。
文檔編號G01N33/577GK101936984SQ20101024418
公開日2011年1月5日 申請日期2010年8月3日 優(yōu)先權(quán)日2010年8月3日
發(fā)明者史為民, 吳聰明, 張素霞, 曹興元, 湯樹生, 沈建忠, 王戰(zhàn)輝, 程林麗 申請人:中國農(nóng)業(yè)大學