專利名稱：一種檢測血清樣本中蜱傳腦炎抗體的蛋白懸浮芯片制備方法和使用方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種檢測血清樣本中蜱傳腦炎抗體的蛋白懸浮芯片制備方法和使用 方法。
背景技術(shù)：
蜱傳腦炎(TBE)，是常見的病毒性中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)疾病，每年有數(shù)百例住院病 例，致病因子是蜱傳腦炎病毒(TBEV)，一種由蜱傳播的黃病毒，臨床上以突發(fā)高熱、腦膜刺 激征、意識障礙和癱瘓等為特征，腦脊液有異常變化，常有后遺癥。免疫學(xué)方法酶聯(lián)免疫實驗(ELISA)中利用抗原與抗體特異性反應(yīng)來檢測抗原或 抗體主要有由雙抗原夾心測抗體、雙抗體夾心測抗原、競爭法、間接法等。間接法測抗體 的原理是特異性抗原結(jié)合到固相載體上，然后和待檢血清中的相應(yīng)抗體結(jié)合形成免疫復(fù)合 物，洗滌后再加酶標(biāo)記二抗與免疫復(fù)合物中的抗體結(jié)合形成酶標(biāo)記二抗_抗體_固相抗原 復(fù)合物，加底物顯色，判斷抗體含量。懸浮芯片(suspension array)也稱液相芯片，是20世紀(jì)70年代美國Luminex公 司研制出的新一代生物芯片技術(shù)，利用帶編碼的微球體作為載體，流式細胞儀作為檢測平 臺，對核酸、蛋白質(zhì)等生物分子進行大規(guī)模測定。目前，該技術(shù)已廣泛應(yīng)用于免疫分析、核酸 研究、酶學(xué)分析、抗體篩選及受體與配體的識別分析等領(lǐng)域。目前發(fā)展的懸浮芯片主要是基于實驗室檢測方法的建立和方法評價及優(yōu)化，以縮 短檢測時間，降低方法的檢測成本。但是懸浮芯片方法是否能夠檢測人血清中的蜱傳腦炎 抗體，其定量檢測能力如何，尚缺乏模型和評價。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種檢測血清樣本中蜱傳腦炎抗體的蛋白懸浮芯片，該芯 片包括編碼微球，例如027號編碼微球，蜱傳腦炎E-D3蛋白、生物素標(biāo)記的二抗，鏈親和 素-藻紅蛋白(SA-PE)、懸浮芯片檢測儀(Bi0-Plex)、檢測物及相關(guān)緩沖溶液。本發(fā)明提供上述檢測血清樣本中蜱傳腦炎抗體的蛋白懸浮芯片的制備方法，具體 為在相關(guān)緩沖溶液中，編碼微球用蜱傳腦炎E-D3蛋白抗原包被、用生物素標(biāo)記的二抗為 羊抗兔IgG或/和Biotin-SPA、用鏈親和素-藻紅蛋白(SA-PE)作為信號檢測物，所述編碼 微球優(yōu)選027號編碼微球。本發(fā)明提供一種采用上述蛋白懸浮芯片檢測血清樣本中蜱傳腦炎抗體的間接免 疫學(xué)檢測方法，該方法采用間接法檢測抗體的免疫學(xué)檢測原理，在檢測過程中所有反應(yīng)可 在96孔濾板上或在微量離心管中進行，其中包括下列步驟(1)將蜱傳腦炎E-D3蛋白抗 原作為捕獲抗原來包被編碼微球；(2)每孔或管中加入含有已包被捕獲抗原，即蜱傳腦炎 E-D3蛋白抗原的編碼微球的工作溶液，用清洗液清洗；(3)加入待測血清樣品，孵育后清 洗；(4)加入用生物素化的二抗，孵育后清洗；(5)加入鏈親和素-藻紅蛋白(SA-PE)，孵育后清洗，(6)加入檢測緩沖液后混勻，(7)用懸浮芯片系統(tǒng)讀取MFI數(shù)值(即平均熒光強度) 并分析數(shù)據(jù)判定檢測結(jié)果陰性或陽性。該方法中，采用生物素標(biāo)記的SPA作為檢測物，并且其與蜱傳腦炎E-D3蛋白組合 組成間接法檢測體系；包被編碼微球的捕獲抗原蜱傳腦炎E-D3蛋白抗原用量為0.01 90 μ g/1. 25 X IO6個編碼微球或0. 02 360ng/2500 5000個微球/測試，標(biāo)記檢測抗 體羊抗兔IgG的生物素為羧基活性的生物素，2mg/mL生物素化的檢測二抗Bioin-SPA以 1 2500稀釋作為檢測物進行檢測。本發(fā)明還提供一種采用上述蛋白懸浮芯片定量檢測血清樣本中蜱傳腦炎抗體的 方法，該方法包括下列步驟(1)加入的陽性檢測樣品或標(biāo)準(zhǔn)品經(jīng)4倍梯度倍比系列稀釋， (2)將系列稀釋樣品在懸浮芯片系統(tǒng)中檢測讀取對應(yīng)熒光值(MFI) ； (3)制作樣品濃度對 應(yīng)MFI值的劑量-反應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)曲線，(4)用分析軟件擬合劑量-反應(yīng)曲線和方程，(5)根據(jù)劑 量_反應(yīng)曲線可判定方法的動態(tài)檢測范圍，未知濃度樣品可根據(jù)劑量_反應(yīng)方程判斷檢測 樣品的濃度。懸浮芯片的基本原理是利用聚苯乙烯(polystyrene)所制作的微球，包覆不同比 例的紅光及紅外光發(fā)色劑，而產(chǎn)生100種不同比例顏色，作為100種獨特的色彩編號，每顆 微球大小約5. 6 μ m，可依不同研究目的如免疫分析、核酸研究、酶分析、受體和配體識別分 析等，并根據(jù)不同研究目的而標(biāo)定特定抗體、核酸探針及各種受體探針。其在以下懸浮芯片 系統(tǒng)中完成檢測，標(biāo)記探針的微球與待測物在96孔板中進行反應(yīng)，反應(yīng)后，利用機器自動 將反應(yīng)液吸起并通過一微細管檢測通道，每次僅允許一個微球通過檢測通道。檢測通道中 設(shè)有兩道激光，一道為紅色，激發(fā)微球基質(zhì)中的顏色，識別微球分類編碼以確定檢測項目； 一道為綠色，激發(fā)報告分子的顏色，記錄信號強弱以檢測待測物的含量。當(dāng)待測樣本與特定 微球的探針吸附在一起時，兩道激光所激發(fā)的光都可被檢測到。而若樣本中不含該標(biāo)的物， 則僅有微球中的激發(fā)光可被檢測到。再通過機器與計算機自動統(tǒng)計分析兩道激光所激發(fā)的 微球種類與數(shù)量，從而判定待測樣本中有幾種測試目標(biāo)物在其中，得知測試樣本中有無待 測病原存在，或同時存在有幾種至數(shù)十種病原。懸浮芯片技術(shù)由于利用微球在溶液中反應(yīng)， 克服了片膜芯片在大分子檢測時受表面張力、空間效應(yīng)等對反應(yīng)動力學(xué)的影響，同時利用 激光檢測技術(shù)，大大提高了樣品檢測的準(zhǔn)確性和重復(fù)性，具有優(yōu)于片膜芯片的操作簡便、重 復(fù)性好等特點。本發(fā)明人經(jīng)過大量試驗和深入的研究，對蜱傳腦炎抗體的蛋白懸浮芯片制備及其 檢測條件作了實質(zhì)性的改進和創(chuàng)新，其具有下列優(yōu)點1、抗原包被量的改進蜱傳腦炎E-D3蛋白抗原的包被量是成功檢測的關(guān)鍵，本發(fā)明對包被微球的抗 原包被量進行實質(zhì)性優(yōu)化使血清樣本的檢測效果非常良好，并且包被懸浮芯片所需的抗 原包被量很低，本發(fā)明的抗原包被量為0. 01 90 μ g/1. 25X IO6個編碼微球即0. 002 360ng/2500 5000個微球/測試，而傳統(tǒng)免疫學(xué)ELISA方法的包被量為1 μ g/測試。2、生物素標(biāo)記的改進通常，標(biāo)記抗體需要使用過量的生物素。理論上講，在檢測過程中，過量的生物素 因未標(biāo)記上抗體而不被微球上結(jié)合捕獲抗體的抗體連接，清洗時被抽濾掉，不會與隨后加 入的SA-PE反應(yīng)，不影響檢測。但在實際檢測過程中，偶爾遇到過檢測信號可能過高的現(xiàn)
4象，出現(xiàn)假陽性，因此建議生物素標(biāo)記抗體后，盡量去除多余的生物素。以標(biāo)記2mg/mL的 IgG (分子量150，000) ImL溶液為例，需加入IOmM生物素溶液約27 μ L。3、方法的特異性本發(fā)明通過選用蜱傳腦炎E-D3蛋白為包被抗原，以兔抗蜱傳腦炎抗體為待測抗 體，以生物素化的羊抗兔為檢測抗體。本研究試驗證明，在存在鼠抗登革熱IgG、兔抗禽流 感H5血清、兔抗土拉FopA多克隆抗體、兔抗登革熱NS3抗體等干擾抗體存在的條件下，本 方法具有良好的特異性。4、樣品的檢測能力本發(fā)明評價了懸浮芯片方法對人血清的檢測能力。通過對人血清的檢測，初步證 實了該方法在檢測人血清中蜱傳腦炎抗體的實用性。


圖1為027號微球包被蜱傳腦炎E-D3蛋白檢測蜱傳腦炎抗體示意圖；圖2為蛋白懸浮芯片方法檢測兔抗蜱傳腦炎抗體劑量_反應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。
具體實施例方式如圖1、圖2所示，本發(fā)明涉及的檢測蜱傳腦炎抗體的蛋白懸浮芯片制備方法、檢 測及定量方法通過下面的具體實施方式
作進一步說明，但本發(fā)明不以任何方式受該實施例 的限定。一、材料1.蛋白懸浮芯片的相關(guān)緩沖液(I)PBS 緩沖液(pH7. 4) =NaCl 137mmol/L ；KCl 2. 7mmol/L ；Na2HPO4IOmmo 1/L ； KH2PO4 2mmol/L0 用 800mL 蒸餾水溶解 8gNaCl，0. 2gKCl, 1. 44g Na2HPO4 禾口 0. 24g KH2PO40 用 HCl調(diào)節(jié)溶液的pH值至7. 4，加水至1L。分裝后在15psi (1. 05kg/cm2)高壓蒸汽20分鐘， 或過濾除菌，保存于室溫。(2)微球清洗液:PBS(ρΗ7· 4) ,0. 05% TWEEN-20。(3)微球活化緩沖液 IOOmM NaH2PO4 :3g NaH2PO4, 5N NaOH 1. 5mL，定容于 25OmL, pH 6. 2。(4)微球包被緩沖液 0· 05M MES，pH 5. 0 2. 44g MES，5N NaOHO. 15mL，定容于 250mL。(5)微球保存液PBS-TBN :PBS，0. 1%BSA,0. 02% TWEEN,0. 05%疊氮化物，pH 7. 4。(6)微球封閉液 PBS-BN =PBS, 1% BSA,0. 05%疊氮化物，ρΗ7· 4。(7)檢測緩沖液:PBS, 1 % BSA, ρΗ7· 4。(8)抗體稀釋液 PBS，ρΗ7· 4。(9)微球稀釋液:PBS, 1 % BSA, ρΗ7· 4。(10)樣品稀釋液 PVX :PBS,0. 5% PVA,0. 8% PVP ；(11)生物素化檢測物稀釋液PBS-TBN(PBS，0. 1% BSA, 0. 02% TWEEN-20,0. 05% NaN3, pH7. 4)。(12) SA-PE 稀釋液:PBS (ρΗ7· 4), 1% BSA。
2.抗原與抗體本發(fā)明所使用的抗原為蜱傳腦炎E-D3蛋白，可購自中國檢驗檢疫科學(xué)研究院。本發(fā)明所使用檢測抗體為兔抗蜱傳腦炎IgG，可購自中國檢驗檢疫科學(xué)研究院，檢 測二抗為生物素化羊抗兔IgG和生物素化SPA，所述的羊抗兔IgG可購自北京鼎國生物技術(shù) 公司、SPA可購自Sigma公司。二、待測樣品的制備1、目標(biāo)分析物樣品的制備目標(biāo)分析物為兔抗蜱傳腦炎IgG，干擾樣品或作為方法特異性測試的樣品是目標(biāo) 檢測物外的其它抗體或其它蛋白質(zhì)，包括鼠抗登革熱IgG、兔抗禽流感H5血清、兔抗登革熱 NS3抗體、BSA、酪蛋白、胰蛋白胨等。將上述待分析樣品均溶于樣品稀釋液中，_4°C保存。兔 抗蜱傳腦炎IgG的儲備液滴度為0. 01。比較實驗中，相同樣品用于ELISA和懸浮芯片的檢 測。將待分析的兔抗蜱傳腦炎IgG用樣品稀釋液以4倍倍比系列稀釋為不同濃度樣 品，以繪制樣品檢測劑量-反應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線，其中幾個樣品濃度低于檢測的敏感度，高濃度 樣品應(yīng)使編碼微球的結(jié)合位點處于飽和狀態(tài)。2、人血清樣本的處理將人血清樣本用樣品稀釋1 10稀釋，例如人血清樣本5 μ L加樣品稀釋液50 μ L 混勻后，作為待檢樣品進行懸浮芯片方法的檢測。實施例1、檢測蜱傳腦炎抗體的蛋白質(zhì)懸浮芯片的制備1、捕獲抗原包被編碼微球本發(fā)明采用的027號編碼微球購自美國Bio-Rad公司，編碼微球用于標(biāo)記可以捕 獲蜱傳腦炎抗體的蜱傳腦炎E-D3蛋白抗原，即利用蜱傳腦炎E-D3蛋白包被微球。Α、編碼微球的活化 取100 μ L (1. 25 X IO6個)編碼微球到1. 5mL離心管中，14000 X g離心，小心吸出并 棄去上清液。加入100 μ L的微球清洗緩沖液懸浮，震蕩并超聲后14000 Xg離心，小心吸出 并棄去上清液。加入100 μ L的微球活化緩沖液，接著先加入10 μ L新鮮配置的EDC(50mg/ mL)，再加入10 μ L新鮮配置的50mg/mL的Sulfo-NHS，高速震蕩30秒后用鋁箔包裹，在室 溫震搖20分鐘。加入150 μ L的PBS (ρΗ7· 4)，震蕩后，14000 X g離心，小心吸出并棄去上清 液。加入100 μ L的PBS (ρΗ7. 4)懸浮編碼微球。B、用抗原包被編碼微球取捕獲抗原即蜱傳腦炎E-D3蛋白抗原1 50μ g加入到活化后的編碼微球中，用 PBS緩沖液定容至500 μ L，室溫震搖2小時。14000Xg離心，小心吸出并棄去上清液。用 500 μ L的PBS緩沖液洗一次，14000 Xg離心，小心吸出并棄去上清液。加入250 μ L的封 閉緩沖液懸浮編碼微球，在室溫震搖30分鐘，14000 Xg離心，小心吸出并棄去上清液。加 入500 μ L的微球保存液洗滌編碼微球，16000 Xg離心，小心吸出并棄去上清液。最后用 150 μ L的微球保存液懸浮編碼微球，于4°C避光保存?zhèn)溆谩、包被微球的計數(shù)吸取適量微球，稀釋后，用血球計數(shù)板(0. 10mm;l/400mm2)在普通顯微鏡下計數(shù)。 根據(jù)公式(每個大格數(shù)Xio4X稀釋倍數(shù)X體積(mL))計算微球數(shù)量。
2、檢測物標(biāo)記生物素A、生物素的標(biāo)記分別配制好濃度為IOmM生物素溶液和2mg/mL的待標(biāo)記抗體溶液，將計算好體 積的生物素加入到待標(biāo)記物溶液中，在室溫震搖30分鐘(或冰上2小時)，過柱脫鹽后分 裝，-20°C凍存?zhèn)溆?。B、抗體的用量以標(biāo)記2mg/mL的IgG (分子量150，000) ImL溶液為例，需加入IOmM生物素溶液約 27 μ 1。實施例2、懸浮芯片制備法條件的優(yōu)化1、微球包被抗原包被量的選擇分另Ij以 1 μ g、2. 5μ g、5y g、7. 5μ g、10y g、12. 5μ g、15y g、20y g、25y g、30y g 的量包被100 μ L編碼為027號的微球。經(jīng)檢測效果比較，1 30 μ g/1. 25 X IO6個編碼微 球即0. 2 120ng/2500 5000個微球/測試，包被效果好，顯微鏡下計數(shù)后避光冷藏保存 待用。如圖1所示，包被蜱傳腦炎E蛋白抗原的027號微球均落在其正確檢測區(qū)域內(nèi)，并且 獲得高信噪比結(jié)果(MFI值遠大于2000)，說明優(yōu)化的懸浮芯片檢測系統(tǒng)可成功用于蜱傳腦 炎抗體的檢測。2、生物素化檢測物的優(yōu)化本發(fā)明分別用氨基活性的生物素，例如LC-酰胼(hydrazide)-生物素和羧基活性 的生物素，例如Sulfo-NHS-生物素和SH-活性的生物素標(biāo)記檢測抗體，經(jīng)質(zhì)控過程檢測效 果比較，本實驗中Sulfo-NHS-生物素標(biāo)記檢測物檢測效果較好，檢測效果的方法采用本領(lǐng) 域的常規(guī)方法或按照制造商的產(chǎn)品說明書所述的方法。本發(fā)明人經(jīng)過試驗驗證，發(fā)現(xiàn)2mg/mL生物素化的抗體羊抗兔以1 500稀釋作 為檢測物進行檢測兔血清中的蜱傳腦炎抗體，檢測結(jié)果顯示生物素化檢測物Bio-羊抗兔 抗體可獲得高檢測值和低背景值的檢測效果；2mg/mL生物素化的檢測物Biotin-SPA以 1 2500稀釋作為檢測人血清中蜱傳腦炎抗體的檢測物，檢測結(jié)果顯示生物素化檢測物 Biotin-SPA可獲得高檢測值和低背景值的檢測效果。實施例3、懸浮芯片樣品制備、檢測及結(jié)果判定1、待測樣品制備用樣品稀釋液將待測樣本配制為不同濃度樣本進行蛋白懸浮芯片檢測。2、樣品的檢測及結(jié)果判定檢測過程全部反應(yīng)均在96孔濾板上進行，檢測過程如下1)每孔加入50 μ L含相應(yīng)編碼微球的工作溶液，用清洗液洗滌并用真空泵抽濾；2)加入50 μ L檢測樣品，混勻后室溫避光震搖30分鐘，用清洗液洗滌并抽濾；3)加入50 μ L適當(dāng)濃度的用檢測物稀釋液稀釋后的生物素化檢測物，混勻后室溫 避光震搖30分鐘，洗液洗滌并真空泵抽濾；4)加入50 μ L的SA-PE，混勻后室溫避光震搖10分鐘。洗液洗滌并真空泵抽濾；5)加入125 μ L的檢測緩沖液，經(jīng)蝸旋重懸混勻；6)用懸浮芯片系統(tǒng)讀取MFI數(shù)值并分析數(shù)據(jù)。3、檢測結(jié)果判定
根據(jù)試驗研究結(jié)果與相關(guān)研究報道，本發(fā)明定義蛋白質(zhì)懸浮芯片方法檢測蜱傳腦 炎抗體的最低檢出限(L0D值)為檢測熒光強度臨界值(Cutoff)對應(yīng)的檢測物濃度。其中， Cutoff的定義是采用空白對照樣品(Blank)熒光檢測信號MFI均值加3倍標(biāo)準(zhǔn)差(SD)，即 Cutoff值為=MFI (空白對照)+3倍標(biāo)準(zhǔn)差。若檢測結(jié)果高于LOD對應(yīng)熒光強度值則判定 為蜱傳腦炎抗體檢測結(jié)果陽性；若檢測結(jié)果低于LOD對應(yīng)熒光強度值則判定為蜱傳腦炎抗 體檢測結(jié)果陰性。實施例4、懸浮芯片對蜱傳腦炎蛋白抗原特異性檢測應(yīng)用懸浮芯片檢測方法分別對兔抗蜱傳腦炎IgG、鼠抗登革熱IgG、兔抗禽流感H5 血清、兔抗土拉FopA多克隆抗體、兔抗登革熱NS3抗體、BSA、酪蛋白、胰蛋白胨等進行檢測， 根據(jù)實施例3中檢測結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)，僅兔抗蜱傳腦炎IgG為陽性，其余干擾抗體或蛋白均為 陰性。說明本發(fā)明所建立的蜱傳腦炎抗體的懸浮芯片檢測方法與其它測試抗體均不發(fā)生交 叉反應(yīng)或非特異反應(yīng)。實施例5、懸浮芯片定量檢測模型的建立1、兔抗蜱傳腦炎IgG標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品制備用樣品稀釋液將兔抗蜱傳腦炎IgG標(biāo)準(zhǔn)品由滴度為0. 01以4倍倍比梯度稀釋至 滴度為8X 10_6成系列濃度樣品。2、劑量_反應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制按照實施例3中的檢測方法檢測上述系列濃度樣品，并根據(jù)懸浮芯片系統(tǒng)檢測結(jié) 果繪制劑量_反應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)曲線(如圖2所示)。其中，X軸代表滴度，Y軸代表懸浮芯片儀檢 測的熒光值(MFI)。每個數(shù)據(jù)代表3次的檢測結(jié)果平均值，坐標(biāo)軸以對數(shù)-對數(shù)關(guān)系設(shè)定， 圖2中兔抗蜱傳腦炎血清的滴度分別為:S1 :8X10_6，S2 :3·2Χ10_5，S3 :1.28Χ10_4，S4 5. 12Χ 1(Γ4，S5 :2. 048Χ 1(Γ3，S6 :8. 19Χ 1(Γ3，S7 :2. 5Χ 1(Γ3，S8 :0. 01。采用間接法測抗體的免疫學(xué)檢測模式，檢測過程中全部反應(yīng)均在96孔濾板上進 行。1)每孔加入50 μ L含相應(yīng)編碼微球的工作溶液，洗液洗滌并用真空泵抽濾2次；2)加入50μ L檢測樣品，混勻后室溫避光震搖30分鐘，用清洗液洗滌并抽濾3次；3)加入50 μ L適當(dāng)濃度的用抗體稀釋液稀釋后的生物素化抗體，混勻后室溫避光 震搖30分鐘，洗液洗滌并真空泵抽濾3次；4)加入50 μ L的SA-PE，混勻后室溫避光震搖10分鐘。用清洗液洗滌并真空泵抽 濾3次；5)加入125 μ L的檢測緩沖液，經(jīng)蝸旋重懸混勻；6)用Bio-Plex懸浮芯片系統(tǒng)讀取MFI數(shù)值并分析數(shù)據(jù)。懸浮芯片系統(tǒng)根據(jù)檢測結(jié)果擬合兔抗蜱傳腦炎IgG劑量-反應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程FI = -2. 07898+(13723. 6+2. 07898) / [1+(Conc/0. 141595)37795J0'7153133、懸浮芯片檢測兔抗蜱傳腦炎IgG的靈敏度和動態(tài)范圍根據(jù)最低檢出限定義和劑量_反應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，本發(fā)明即蛋白懸浮芯片方法檢 測兔抗蜱傳腦炎IgG的靈敏度為0. 000009 (Cutoff = 24. 1818，MFI (空白對照)=21，標(biāo) 準(zhǔn)差=1. 0606)。本發(fā)明定義最高檢出限為使編碼微球的結(jié)合位點處于飽和狀態(tài)的檢測物濃度。根
8據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線隨著兔抗蜱傳腦炎IgG濃度的升高，其對應(yīng)的MFI值也隨之遞增，當(dāng)兔抗蜱傳腦 炎IgG滴度度超過0. 01時，抗原抗體的免疫反應(yīng)達到飽和狀態(tài)，MFI值開始進入平臺期，說 明樣品中的待檢物濃度過高，需要將樣品稀釋后再檢測。因此，根據(jù)最低檢出限與最高檢出限可以判定本發(fā)明即懸浮芯片定量檢測兔抗蜱 傳腦炎IgG的動態(tài)范圍為0. 000008 0. 01。實施例6、人血清樣品的檢測1、人血清樣品的準(zhǔn)備將人血清用樣品稀釋液1 10稀釋(人血清樣本5 μ L加樣品稀釋液50 μ L混 勻)后用于蛋白懸浮芯片檢測。2、人血清樣品的檢測1)每孔加入50 μ L含相應(yīng)編碼微球的工作溶液，用清洗液洗滌并用真空泵抽濾；2)加入50 μ L待檢測人血清樣品，混勻后室溫避光震搖30分鐘，用清洗液洗滌并 抽濾；3)加入50 μ L適當(dāng)濃度的用抗體稀釋液稀釋后的生物素化SPA，混勻后室溫避光 震搖30分鐘，洗液洗滌并真空泵抽濾；4)加入50 μ L的SA-PE，混勻后室溫避光震搖10分鐘。洗液洗滌并真空泵抽濾；5)加入125 μ L的檢測緩沖液，經(jīng)蝸旋重懸混勻；6)用懸浮芯片系統(tǒng)讀取MFI數(shù)值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，確定待檢測人血清中蜱傳腦炎 抗體的濃度。經(jīng)過多次重復(fù)試驗，生物素化SPA稀釋比例選用1 2500稀釋，SA-PE稀釋比例選 用1 300稀釋，經(jīng)過對正常人血清的檢測，所得的MFI值的均值與其標(biāo)準(zhǔn)差的3倍之和為 作為判斷陰陽性的界值，即C utoff值，檢測得到的MFI值如果大于C utoff值，即血清中的 蜱傳腦炎濃度過高，可視為蜱傳腦炎抗體陽性可能被蜱傳腦炎病毒感染，如果MFI值小于C utoff值，即血清中的蜱傳腦炎抗體濃度低正常值可判斷為蜱傳腦炎抗體陰性，未感染蜱傳 腦炎病毒或隱性攜帶者。
權(quán)利要求
一種檢測血清樣本中蜱傳腦炎抗體的蛋白懸浮芯片，其特征在于，該芯片包括編碼微球，作為包被編碼微球抗原的蜱傳腦炎E D3蛋白，生物素標(biāo)記的二抗和/或SPA作為捕獲抗體，鏈親和素 藻紅蛋白和相關(guān)緩沖溶液。
2.一種檢測蜱傳腦炎抗體的蛋白懸浮芯片的制備方法，其特征在于，該方法具體為 在相關(guān)緩沖溶液中，編碼微球用蜱傳腦炎E-D3蛋白抗原包被、用生物素標(biāo)記的捕獲抗體為 羊抗兔IgG和/或Biotin-SPA、用鏈親和素-藻紅蛋白作為信號檢測物。
3.如權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于，所述編碼微球優(yōu)選027號編碼微球。
4.一種采用蛋白懸浮芯片檢測血清樣本中蜱傳腦炎抗體的間接免疫學(xué)檢測方法，其特 征在于，該方法包括下列步驟1)將蜱傳腦炎E-D3蛋白抗原作為捕獲抗原來包被編碼微球；2)向檢測載體內(nèi)加入含已包被捕獲抗原編碼微球的工作溶液，用清洗液清洗；3)加入待測血清樣品，孵育后清洗；4)加入用生物素標(biāo)記的二抗，孵育后清洗；5)加入鏈親和素_藻紅蛋白，孵育后清洗；6)加入檢測緩沖液后混合均勻；7)用懸浮芯片系統(tǒng)讀取平均熒光強度數(shù)值并分析數(shù)據(jù)判定檢測結(jié)果。
5.如權(quán)利要求4所述的檢測方法，其特征在于，采用生物素標(biāo)記的SPA作為檢測物，并 且其與蜱傳腦炎E-D3蛋白組合組成間接法檢測體系。
6.如權(quán)利要求4所述的檢測方法，其特征在于，所述步驟1)中包被所述編碼微球 的蜱傳腦炎E-D3蛋白抗原用量為0.01 90μβ/1.25Χ106個編碼微球即0. 002 360ng/2500 5000個微球/測試。
7.一種采用蛋白懸浮芯片定量檢測血清樣本中蜱傳腦炎抗體的方法，其特征在于，該 方法包括下列步驟1)加入的陽性檢測樣品或標(biāo)準(zhǔn)品經(jīng)梯度倍比稀釋；2)將系列稀釋樣品在懸浮芯片系統(tǒng)中檢測讀取對應(yīng)熒光值；3)制作樣品濃度對應(yīng)熒光值的劑量-反應(yīng)曲線；4)用分析軟件擬合劑量_反應(yīng)曲線和方程；5)根據(jù)劑量_反應(yīng)曲線判定動態(tài)檢測范圍，根據(jù)劑量_反應(yīng)方程判斷檢測樣品中蜱傳 腦炎抗體的濃度。
8.如權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，所述步驟1)中梯度倍比稀釋為4倍。
9.如權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，所述步驟1)中加入的陽性檢測樣品為兔抗 蜱傳腦炎抗體。
10.如權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，所述步驟2)中采用2mg/mL生物素化的檢 測抗體Bio-羊抗兔抗體以1 500稀釋作為捕獲抗體進行檢測。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種檢測血清樣本中蜱傳腦炎抗體的蛋白懸浮芯片制備方法和使用方法。本發(fā)明的方法檢測能力好、靈敏度高、特異性強、動態(tài)范圍寬，并建立了以蜱傳腦炎抗體為代表的病毒性抗體蛋白懸浮芯片檢測的開放性檢測模式化平臺。
文檔編號G01N21/64GK101936990SQ20101023570
公開日2011年1月5日 申請日期2010年7月23日 優(yōu)先權(quán)日2010年7月23日
發(fā)明者張曉龍, 曹曉梅, 楊宇, 楊永莉, 王靜, 胡孔新 申請人:中國檢驗檢疫科學(xué)研究院