專利名稱：用于檢測血清中抗體的指示條的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于檢測病人血清中抗體的指示條，它具有一個或多個固定有一種或幾種疾病抗原的區(qū)域。當(dāng)加入病人血清時，各抗原結(jié)合到相應(yīng)于該疾病的抗體上并使該抗體在隨后反應(yīng)中作為染色斑而可見。
這種用于試驗的指示條也稱為酶免疫測定，用于DE3346795Al中已知的抗體并形成權(quán)利要求1的前序部分。其中描述的試驗用于疾病的血清學(xué)檢測，如由病毒，細(xì)菌或類似病原體引起的感染。該試驗利用了這樣的事實即，當(dāng)存在疾病時，身體在其血清中形成相應(yīng)于該病原體抗原的抗體(它們結(jié)合到抗原上并使其無害)?？砷g接推斷如果可在該血清中成功地檢測到該疾病特異性抗體，那么必然目前或者以前感染了該疾病。由于其操作機(jī)制，該試驗屬于所謂的間接測量方法，因為該試驗不直接檢測該病原體(抗原)，而是檢測身體與該病原體反應(yīng)產(chǎn)生的特異性抗體。
為了生產(chǎn)這種已知的測試條，應(yīng)用抗原，即引起各種疾病的病原體的已知蛋白質(zhì)并將其固定到幾個測試區(qū)的固相上，特別是硝酸纖維素或聚酰胺薄片上。隨后，使未被抗原占據(jù)的薄片上的吸收位置飽和。經(jīng)過將病人血清滴到試驗條上進(jìn)行試驗。在病人血清中存在的病原體特異性的抗體與沉積的病原體特異性抗原形成特異性的帶，即所謂的抗原抗體反應(yīng)，Ag-Ab-或者免疫反應(yīng)。然后，在隨后的反應(yīng)中使抗原結(jié)合的抗體肉眼可見，例如經(jīng)過用特異性的酶偶聯(lián)物處理并隨后加入偶聯(lián)物中酶的底物和一種染色前體。在薄片上形成清楚可見并較好地附著在薄片上的有色斑點(稱為“印跡”，在免疫反應(yīng)后稱為“免疫印跡”)。在每步上述處理步驟后添加一步洗滌步驟去掉多余的試劑。最后以肉眼評價薄片上的染色斑點。含有疾病前或疾病發(fā)作中的病原體特異性抗原的區(qū)域被染色，而其它區(qū)域未被染色。
上述方法和測試條可用于血清的定性檢測，但不能定量某些病原體特異性的抗體(因此也不能定量疾病)。人們需要不僅知道現(xiàn)在存在或者過去存在的疾病，而且需要定量存在的抗體。這種知識可有助于了解疾病的嚴(yán)重性和急性程度。
因此本發(fā)明的目的是提供一種允許定量血液中存在的抗體的指示條。
為了達(dá)到該目的，根據(jù)本發(fā)明的指示條其特征在于提供固定有不同濃度的人對照抗體的添加區(qū)域。這些區(qū)域在免疫反應(yīng)之后的隨后的常規(guī)(酶)反應(yīng)中根據(jù)存在的抗體數(shù)目被染色。經(jīng)過比較添加區(qū)域與抗原區(qū)域的顏色(深度)，不僅可測定疾病的類型，而且可定量血清中的抗體，即該疾病的嚴(yán)重性和急性程度。
本發(fā)明利用的驚人發(fā)現(xiàn)是，染色反應(yīng)不僅標(biāo)記了待測液體固定于固相上的含有病人病原體特異性抗體的區(qū)域，而且在固相上使用了對照抗體。酶-底物染色反應(yīng)使病人抗體和對照抗體的染色深度均增加。由于將不同濃度的對照抗體加入到試驗條的固相上且酶-底物染色反應(yīng)形成作為參照抗體各濃度之特征的染色斑點，因而產(chǎn)生了顏色比較標(biāo)準(zhǔn)且由此產(chǎn)生了固定于固相上的抗體濃度的比較標(biāo)準(zhǔn)。經(jīng)過比較標(biāo)準(zhǔn)區(qū)的染色強(qiáng)度與試驗區(qū)的染色強(qiáng)度可直接測定抗體的量。如果在兩個區(qū)域存在相同量的抗體則顏色深度相同。如果病人抗體的顏色深度位于沉積的對照抗體濃度的兩個染色深度之間，那么病人抗體的量相應(yīng)于兩個濃度之間的一個值。因此，可以監(jiān)測免疫性，即對病原體的獲得性免疫，并測定潛伏疾病的狀態(tài)或嚴(yán)重性，如傳染病，自體免疫疾病，例如，風(fēng)濕癥，過敏反應(yīng)，腫瘤等。
本發(fā)明還使得更好地追蹤疾病的動態(tài)進(jìn)展成為可能，因為經(jīng)過測定按本發(fā)明提供的抗體濃度在培養(yǎng)一定時間后可定量測定針對特定病原體的藥物效力和/或藥物劑量。本發(fā)明還提供了定量檢測體液中抗體的測量儀器，其中該儀器不僅能在任意地點和任意時間直接讀數(shù)和通用，而且可廉價地制造。
為實施本發(fā)明，優(yōu)選將特異性抗原(在試驗條設(shè)計成用于檢測一種疾病的情況下)或多種抗原(在試驗條設(shè)計成用于檢測幾種疾病的情況下)加到固相上導(dǎo)致抗體結(jié)合到固相上?？蓪追N不同的抗原加到固相上以同時試驗幾種疾病，例如，不同的傳染病。
根據(jù)本發(fā)明具有優(yōu)勢的實施方案，可加入具有相同亞型特定類型的對照抗體，例如，IgG,IgA,IgM等。以這種方式，該試驗可定量檢測具體疾病。換句話說，應(yīng)用某種特定亞型的對照抗體提供檢測該疾病的所需確定性標(biāo)準(zhǔn)。經(jīng)過將標(biāo)準(zhǔn)與不同亞型特異性對照抗體進(jìn)行比較，也可測定體液中存在的亞型特異性抗體類型。
根據(jù)本發(fā)明的另一實施方案，經(jīng)過用諸如亞型特異性免疫球蛋白G型，A型或M型(IgG,IgA,IgM)等的酶偶聯(lián)物處理固相可檢測抗體和對照抗體。以這種方式，按所用的酶偶聯(lián)物僅標(biāo)記具有相同亞型特異性類型的那些抗體和對照抗體。經(jīng)過使用相同亞型特異性類型的對照抗體和酶偶聯(lián)物可測定待測體液中存在的抗體類型。
根據(jù)本發(fā)明的另一有優(yōu)勢的實施方案，使用酶底物沉淀染色，優(yōu)選以四甲基聯(lián)苯胺為基礎(chǔ)的酶底物。這樣不僅在標(biāo)記抗體所在的那些區(qū)域，而且在標(biāo)記的對照抗體所在的那些區(qū)域產(chǎn)生在固相上附著良好，穩(wěn)定且具有高靈敏度的染色斑點。
抗原可以是有機(jī)物，特別是蛋白質(zhì)，糖類，脂肪，核酸等，也可以是無機(jī)物。以這種方式，由異型有機(jī)和無機(jī)物質(zhì)在體內(nèi)產(chǎn)生的抗體可結(jié)合到固相上。因此，本發(fā)明的指示條可用于定量檢測例如，針對化學(xué)品的免疫性和例如，由化學(xué)毒素引起的膿毒的過程。
根據(jù)本發(fā)明的另一具有優(yōu)勢的實施方案，可采用微量元素作為熒光或放射活性標(biāo)記。以這種方式，可將試驗條用于為測定所測抗體濃度的精確數(shù)值而特異性裝備的實驗室。經(jīng)過使用分光光度計，電泳裝置和/或放射測量裝置可進(jìn)行測量。
根據(jù)本發(fā)明的指示條的一個具有優(yōu)勢的實施方案，固相制成一種吸收薄片。吸收薄片的表面有利于吸收抗原和對照抗體。沉積物穩(wěn)定以便本發(fā)明的測量條可在優(yōu)選4℃的環(huán)境下儲存幾個月。
根據(jù)本發(fā)明的另一具有優(yōu)勢的實施方案，指示待測病原體名稱，對照標(biāo)記和其它標(biāo)記的數(shù)據(jù)區(qū)可與反應(yīng)區(qū)和/或?qū)φ諈^(qū)相聯(lián)或印在其上。評價測量條時各反應(yīng)區(qū)顯示出染色，以便可直接測定一種待測疾病。而且也可直接測定該疾病的嚴(yán)重性，因為對照標(biāo)記印在對照區(qū)上，它顯示了加入到各對照區(qū)上的對照抗體的不同濃度。這可經(jīng)過比較由酶底物染色反應(yīng)引起的反應(yīng)區(qū)的顏色深度與對照區(qū)的顏色深度來實現(xiàn)。
適合于檢測幾種不同病原體的根據(jù)本發(fā)明用于酶免疫測定的指示條的兩個實施方案將在下面參照附圖顯示的實施方案進(jìn)行詳細(xì)描述。所有描述的和/或顯示的特征單獨或以任意組合代表發(fā)明的主體。


圖1和2顯示了根據(jù)本發(fā)明用于檢測抗體的測量條的可能的實施方案。
根據(jù)本發(fā)明的測量條1在圖1中顯示且包括了可買到的具有0.45μm孔徑的硝酸纖維素薄片材料2。外測邊界線3和鑒定區(qū)4印在硝酸纖維素薄片2的測量條1的區(qū)域中。另外，排列在另一端的幾個抗原區(qū)5和抗體區(qū)6分別印在左欄和右欄。此外，待測病原體的名稱成排排列在左側(cè)抗原區(qū)5上面，而指示不同濃度的對照標(biāo)記，如字母A到H打印在右側(cè)各抗體區(qū)6的上面。在待測的8種呼吸道病原體的舉例性的實施方案中，左欄包括流感病毒A和B，腺病毒，肺炎支原體，百日咳博德特氏菌，副流感病毒1至3和柯薩奇病毒。
根據(jù)本發(fā)明的指示條可經(jīng)過例如，將硝酸纖維素薄片2在磷酸鹽緩沖溶液(PBS緩沖液)中潤濕來制備。病原體特異性抗原的溶液使用可買到的蛋白質(zhì)抗原按本領(lǐng)域已知的方式以5-15ng/μl的濃度制備。
硝酸纖維素薄片2隨后夾在常規(guī)斑點印跡裝置中，例如來自Hofer公司的“SlotBlotter”。
隨后，將150μl稀釋的蛋白質(zhì)抗原溶液(相應(yīng)于大約500ng到1.5μg蛋白質(zhì))加入到與硝酸纖維素薄片2左欄相聯(lián)的抗原區(qū)5上。然后將人抗體溶液以均勻增加的濃度加入到硝酸纖維素薄片2右欄抗體區(qū)6上。
經(jīng)過一段時間使蛋白質(zhì)和人抗體溶液吸收后，在PBS緩沖液中洗滌硝酸纖維素薄片2。
然后用奶粉溶液處理硝酸纖維素薄片以飽和薄片上所有未占據(jù)的吸收區(qū)。
然后將硝酸纖維素薄片2在PBS緩沖液中連續(xù)洗滌3次并隨后在室溫下真空干燥。
隨后將根據(jù)本發(fā)明的測量條1在邊界線3外側(cè)取出。以這種方式形成的測量條1與干燥劑一起融合在薄片上并儲存于4℃?zhèn)溆谩?br> 醫(yī)生或?qū)嶒炇铱墒褂脺y量條，例如，經(jīng)過用上述奶粉溶液開始處理測量條1以便更新。待試驗的病人血清用已知方法在奶粉溶液中稀釋并加入到測量條上。它引起的免疫反應(yīng)是，血清中存在的病原體特異性抗體與左欄中的抗原區(qū)沉積的抗原形成特異性帶。
吸去未結(jié)合的血清組份并使用常規(guī)PBS Tween去污劑洗滌測量條1三次。
該步驟之后用任意類型的抗人免疫球蛋白酶偶聯(lián)物培養(yǎng)，從而標(biāo)記病原體特異性抗體。酶偶聯(lián)物的加入也標(biāo)記加入到測量條右側(cè)的不同人抗體濃度。
接著進(jìn)行用PBS Tween去污劑的洗滌步驟，其中PBS Tween去污劑更換三次。然后用蒸餾水再漂洗薄片一次以去除去污劑。
經(jīng)過每薄片使用1mg可買到的以四甲基聯(lián)苯胺為基礎(chǔ)的底物產(chǎn)生染色斑，該底物可從Kirke-Gaard和Perry公司以產(chǎn)品編號50-77-02獲得。
用蒸餾水徹底漂洗測量條1終止染色過程。
對于8種呼吸道病原體的實施方案，測量條1左欄排列的抗原區(qū)5表現(xiàn)出不同的染色斑，其深度取決于血清中存在的各病原體特異性抗體的數(shù)量。測量條1右欄排列的抗體區(qū)6表現(xiàn)出顏色深度均勻增加的染色斑，它由不同濃度的所加人抗體產(chǎn)生。
病人血清中存在的抗體量的結(jié)果及由此得到的疾病狀態(tài)的結(jié)果可從測量條1左欄區(qū)域5和右欄區(qū)域6的顏色深度之間的肉眼顏色比較得出。如果左側(cè)抗原區(qū)5的一個或幾個顏色，例如標(biāo)記的“腺病毒”區(qū)，與右側(cè)抗體區(qū)6的一個顏色，例如對照標(biāo)記F區(qū)，相同，那么病人血清中存在的腺病毒抗體濃度與顏色深度具有相應(yīng)增加的抗體區(qū)6的抗體濃度相對應(yīng)。如果左側(cè)區(qū)5的一個顏色深度，例如標(biāo)記的“HSV”區(qū)，介于兩個相鄰右側(cè)區(qū)6的各顏色深度，例如對照標(biāo)記D和E區(qū)，之間，那么病人血清中的單純皰疹病毒抗體濃度值介于相應(yīng)區(qū)域6D和F的兩個濃度之間。
圖2顯示了一種極窄的測量條，它包括上下排列的鑒定區(qū)4a及幾個抗原區(qū)5和抗體區(qū)6。在該實施方案中，抗原區(qū)5和抗體區(qū)6特別小，例如5×3mm，使得進(jìn)行試驗時只需極少量的病人血清。待測病原體的名稱印在各抗原區(qū)5上面，各對照標(biāo)記，例如字母A至D之一表示不同的濃度，“-”表示對照檢驗區(qū)(無抗體)可印在各抗體區(qū)6上面。
權(quán)利要求
1.一種用于檢測病人血清中抗體的指示條(1)，包括一個或幾個區(qū)域(5)，其中固定了一種或幾種疾病的抗原，其中當(dāng)加入病人血清時相應(yīng)抗原結(jié)合相應(yīng)于該疾病的抗體，且其中這些抗體在隨后的反應(yīng)中成為染色斑點而肉眼可見，其特征在于添加具有以不同濃度固定的人對照抗體的區(qū)域(6)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的指示條，其特征在于將至少一種特異性抗原加入到作為固定對照抗體之裝置的固相(2)上。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2的指示條，其特征在于加入的對照抗體具有相同亞型特異性類型，如IgG,IgA,IgM等。
4.根據(jù)權(quán)利要求1至3之一的指示條，其特征在于使用酶偶聯(lián)物進(jìn)行隨后的反應(yīng)。
5.根據(jù)權(quán)利要求1至4之一的指示條，其特征在于優(yōu)選使用以四甲基聯(lián)苯胺為基礎(chǔ)的酶底物作為隨后的沉淀染色反應(yīng)中的底物。
6.根據(jù)權(quán)利要求1至5之一的指示條，其特征在于在隨后的反應(yīng)中使用熒光或放射活性標(biāo)記物質(zhì)，其中在后一種情況中“染色斑點”位于非光學(xué)光譜范圍內(nèi)。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種用于檢測病人血清中抗體的指示條(1),包括一個或幾個區(qū)域(5),其中固定了一種或幾種疾病的抗原。當(dāng)加入病人血清時,相應(yīng)抗原結(jié)合到相應(yīng)于該疾病的抗體上,其中所述抗原在隨后的反應(yīng)中成為染色斑點而肉眼可見。為了不僅可測定所述抗體的性質(zhì),而且可測定所違抗體的數(shù)量,提供了另外的區(qū)域(6),其中按照不同濃度固定有人抗體。因此可經(jīng)過評價產(chǎn)生的染色斑點來評價血清中的抗體濃度。
文檔編號G01N33/543GK1300366SQ99805983
公開日2001年6月20日 申請日期1999年4月26日 優(yōu)先權(quán)日1998年5月12日
發(fā)明者拉爾夫·希爾弗里希 申請人:維歐費姆診斷學(xué)有限公司