專利名稱：一種評估藥物對hERG作用而引起心律失常的試驗(yàn)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種重要的藥物安全性評價技術(shù)，是一種新的評估藥物對hERG作用而引起心律失常的試驗(yàn)方法。
背景技術(shù)：
對于新藥臨床前心臟的安全性評估是涉及到患者安全具有十分重要的意義，2005 年起，G7各發(fā)達(dá)國家開始執(zhí)行由歐盟、日本和美國的藥品法規(guī)機(jī)構(gòu)和大型制藥企業(yè)聯(lián)合制定的關(guān)于心臟安全評估的S7B法規(guī)，收益巨大。藥物的臨床前心臟安全評估大大降低了新藥對心臟的副作用，使歐美制藥公司每年節(jié)約150多億美元的研發(fā)費(fèi)用。隨著時間的推移， S7B法規(guī)將會逐漸被各國的藥物管理局和制藥公司所接受。我國是一個正在崛起的發(fā)展中國家，在這十多年來生物制藥工業(yè)已取得了突飛猛進(jìn)的成績并將逐步與西方國家縮短差距，從現(xiàn)在即開始執(zhí)行S7B法規(guī)將為我國的藥品走向世界打開方便之門，特別是對我國傳統(tǒng)中藥的利用開發(fā)及臨床應(yīng)用將起到非常關(guān)鍵的作用。服用和注射中藥是我國用藥的最大特點(diǎn)，但中藥注射劑常有嚴(yán)重不良反應(yīng)的報道，其中很多是由于心律失常導(dǎo)致的并發(fā)癥。然而，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)hERG離子通道阻斷與臨床患者誘發(fā)TdP的相關(guān)性很差。這樣就導(dǎo)致了非常高的TdP假陽性率，使得各制藥公司蒙受了巨大損失。最新的研究表明不是每個阻斷hERG通道的化合物都能引起心律失常。阻斷hERG通道誘發(fā)torsadogenesis 的藥物必須符合以下三個條件1、動作電位三角化；2、逆向刺激頻率依賴性(動作電位產(chǎn)生延長)與心律頻率成反比；3、在心臟各個部位由于藥物引起的動作電位延長非一致性例如本公司創(chuàng)辦人早在20年前就發(fā)現(xiàn)常用中藥黃連素會延長心臟動作電位并且改變心肌上的Ca+通道，其相關(guān)的結(jié)果早已發(fā)表在中外的電生理雜志上。另外隨著糖尿病發(fā)病率的不斷提高，糖尿病心肌病變的發(fā)病率也隨之增加，這類病人對于藥物引起的心律失常發(fā)生率是正常人的2 4倍，因此對于藥物進(jìn)行嚴(yán)格、正確的心臟安全評價，既防止由于藥可能存在的hERG離子通道阻斷，在臨床使用中導(dǎo)致患者誘發(fā)心臟類高危病變，同時也有效消除由于某些檢測結(jié)果中的藥物檢陽性而導(dǎo)致的帶給藥物研發(fā)、制造生產(chǎn)者造成的巨大損失。因此，隨著中醫(yī)中藥在國際上的影響力的上升，國外對我國中藥的需求也會得到提升，因此針對于中藥使用安全性的要求也會日益提到重要議事日程上來。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的旨在提出一種適應(yīng)我國國情的專業(yè)化全面的新藥臨床前心臟安全評估平系統(tǒng)，既提高國內(nèi)用藥安全型水平，同時也為將來與國際接軌和將國內(nèi)藥品制造企業(yè)推向國際創(chuàng)造條件。
這種評估藥物對hERG作用而引起的心率失常的試驗(yàn)方法，包括體外細(xì)胞模型通道分析、離體心臟組織檢測和器官水平/整體動物三個流程。本技術(shù)其特征在于以下重要步驟a)按常規(guī)把細(xì)胞去極化至40mV/5ms來激活hERG離子通道，然后把細(xì)胞鉗回到-50mv/s以記錄通道的失活過程，在-50mv記錄到的最大電流即為所要記錄的hERG通道電流幅度；b)進(jìn)行下列電壓鉗流程試驗(yàn)，獲取藥物脫離通道的速度；該試驗(yàn)包含2段2秒的兩次去極化脈沖激化過程；脈沖將細(xì)胞去極化至20mv，兩個脈沖去極化之間，細(xì)胞被鉗回至-SOmv共1秒鐘，應(yīng)用在第一次2秒鐘的去極化中，比較不同時間的藥物阻斷程度就能估算出藥物阻斷hERG離子通道的時間依賴性，，在第二次去極化中測出150ms后的“再阻斷” 強(qiáng)度，然后將其與第一次去極化末端獲得的阻斷強(qiáng)度進(jìn)行比較，就能得到藥物脫離通道的速度；C)用 IC5015Qms/IC505_s 和 IC5015Qms/IC5(^s 來計算 500ms 和 2s 時化合物 hERG 離子通道的時間依賴性；比值越大說明它的時間依賴性越大；d)在確認(rèn)藥物在阻塞hERG離子通道試驗(yàn)中具有明顯時間依賴性的前提下，運(yùn)用 REec = (IC150ms_2-IC502s)/(IC150150ms-IC502s)計算出該藥物hERG阻斷劑的回復(fù)時間指數(shù)， 依回復(fù)時間指數(shù)小于25的藥物確認(rèn)為具有較大誘發(fā)TdP的可能性藥物。根據(jù)以上技術(shù)案提出的這種評估藥物對hERG作用而引起的心率失常的試驗(yàn)方法，由于系統(tǒng)流程十分簡單，因此便于在實(shí)際應(yīng)用中的推廣和使用，顯然這既可以便于對臨床使用前的藥物進(jìn)行TdP風(fēng)險的確認(rèn)，同時也可避免由于假陽性檢測結(jié)果的出現(xiàn)而致使藥品研發(fā)廠商的巨大損失，同時也可以減輕國家和醫(yī)療機(jī)構(gòu)的不必要醫(yī)療開支。


圖1為測試藥物臨床前安全評估的系統(tǒng)流程框圖；圖2為本發(fā)明藥物阻斷hERG的時間依賴性的膜片鉗；圖3為35個藥物阻斷hERG與時間依賴性關(guān)系圖。
具體實(shí)施例方式以下結(jié)合實(shí)施例進(jìn)一步闡述本發(fā)明。本發(fā)明提出的這種評估藥物對hERG作用而引起的心率失常作用的試驗(yàn)方法，它是對目前國際上普遍使用方法的一種更全面和更精確的創(chuàng)新方案，該試驗(yàn)方法包括體外細(xì)胞模型通道分析、離體心臟組織檢測和器官水平/整體動物三個流程，其特征在于所外細(xì)胞模型通道分析采取以下步驟進(jìn)行1)、按常規(guī)把細(xì)胞去極化至40mV/5ms來激活hERG離子通道，然后把細(xì)胞鉗回到-50mv/s以記錄通道的失活過程，在-50mv記錄到的最大電流即為所要記錄的hERG通道電流幅度；2)、進(jìn)行電壓鉗流程試驗(yàn)，獲取藥物脫離通道的速度；該試驗(yàn)包含2段2秒的兩次去極化脈沖激化過程；脈沖將細(xì)胞去極化至20mv，兩個脈沖去極化之間，細(xì)胞被鉗回至-SOmv共1秒鐘，應(yīng)用在第一次2秒鐘的去極化中，比較不同時間的藥物阻斷程度就能估算出藥物阻斷hERG離子通道的時間依賴性，，在第二次去極化中測出150ms后的“再阻斷” 強(qiáng)度，然后將其與第一次去極化末端獲得的阻斷強(qiáng)度進(jìn)行比較，就能得到藥物脫離通道的速度；3)、用 IC5015Qms/IC505_s 和 IC5015Qms/IC5(^s 來計算 500ms 和 2s 時化合物 hERG 離子通道的時間依賴性；比值越大說明它的時間依賴性越大；4)、在確認(rèn)藥物在阻塞hERG離子通道試驗(yàn)中具有明顯時間依賴性的前提下，運(yùn)用 REec = (IC150ms_2-IC502s)/(IC150150ms-IC502s)計算出該藥物hERG阻斷劑的回復(fù)時間指數(shù)， 依回復(fù)時間指數(shù)小于25的藥物確認(rèn)為具有較大誘發(fā)TdP的可能性藥物。本發(fā)明申請人運(yùn)用上述方法進(jìn)行了 35個化合物的實(shí)驗(yàn)，測試劑量為10uM。常規(guī)的測試篩選程序如下首先，把細(xì)胞去極化至40毫伏/5秒來激活hERG離子通道，然后把細(xì)胞鉗回到_50 毫伏/5秒，并記錄通道的失活過程。在-50毫伏/5秒所記錄到的最大電流就是所要記錄的hERG離子通道電流幅度，如藥物減低hERG離子通道電流幅度，就表明此藥物會對通道起到阻斷作用。其次，進(jìn)一步觀察藥物阻斷hERG離子通道的時間依賴性，用電壓鉗流技術(shù)進(jìn)行去極化脈沖檢測試驗(yàn)，該電壓鉗流程包含2端2秒的計劃脈沖過程，脈沖將細(xì)胞去激化至20 毫伏。兩個脈沖之間，細(xì)胞被鉗回至-80毫伏共1秒鐘時間。隨后，根據(jù)第一段脈沖去極化記錄藥物阻斷離子通道的強(qiáng)度與時間的關(guān)系，經(jīng)過 20毫伏脈沖去極化后，細(xì)胞被再鉗回到-80毫伏而使藥物從通道受體中脫離出來。1秒鐘以后細(xì)胞再次被去極化至20毫伏2秒鐘，這樣在第一次2秒鐘的去極化中，比較不同時間的藥物阻斷程度就能估算出藥物阻斷hERG離子通道的時間依賴性。最后，依照關(guān)系式I Ke。= (IC150ms_2-IC502s)/(IC15015(lms-IC502s)計算出該藥物 hERG阻斷劑的回復(fù)時間指數(shù)。在對上述35個已知結(jié)構(gòu)的hERG離子通道阻斷劑的驗(yàn)證中多菲利特 (Dofetilide)顯示在整個2秒時間去極化過程中其hERG阻斷強(qiáng)度是一致的，均為IC150s 在150毫秒，500毫秒和2秒時分別為0. 81、1. 44和1. · 84uM。500毫秒和2秒時的阻斷通道時間依賴性用公式IC5015(lms/IC505_s 和 IC5015(lms/IC5(^d|lJ算。多菲利特(Dofetilide)是一個眾所周知的非時間依賴性的hERG離子通道阻斷劑，500ms和2s時的阻斷比例分別為0. 561和0. 44。相比之下，酮色林(Ketanserin)的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示它阻斷hERG離子通道是有著很強(qiáng)的時間依賴性，50毫秒和2秒的阻斷比例分別為10和21. 7，也就是說2秒鐘的阻斷強(qiáng)度是500毫秒時的1倍多。藥物在去極化過程中和hERG離子通道的受體結(jié)合從而阻斷了通道，反過來說明大多數(shù)藥物在靜息電位(-80毫伏)時也會從受體中脫離出來使通道重新開放。藥物從通道受體脫離的速率可以用公式 (IC150ms_2-IC502s)/(IC15015Qms-IC502s)來表示。試驗(yàn)結(jié)果表明多菲利特在-80毫伏時從阻斷中脫離受體，其脫離的速度非常慢， REec僅為-58. 3%。相反的例子是海拉明(Diphenhydramine)，它和多菲利特一樣都呈微弱的時間依賴性阻斷，但其在-80毫伏中的恢復(fù)率較高，達(dá)到94. 9%，在一般情況下。藥物具有緩慢的時間依賴將有比較高的TdP風(fēng)險。本項(xiàng)目申請人用了 35個已用于臨床的藥物，把已知的臨床QT間期延長程度及誘發(fā)TdP發(fā)病率來對比由本公司所發(fā)明的實(shí)驗(yàn)方法所判斷出的藥物TdP誘發(fā)幾率，這樣就能得出由本實(shí)驗(yàn)方法來判斷化合物心臟安全評估的可靠性。藥物阻斷hERG的時間依賴性可用圖2中公式來計算，圖3詳細(xì)描述了 35個藥物阻斷hERG離子通道的時間依賴性，比例值越大說明它的時間依賴性越強(qiáng)。結(jié)果顯示在20毫伏去極化過程，19個藥物在阻塞hERG離子通道說有著明顯的時間依賴性。根據(jù)產(chǎn)生心律失常的機(jī)理以及藥物作用于通道的特性， 一般來說與時間相關(guān)的并復(fù)蘇緩慢的hERG阻斷劑應(yīng)具有很高的TdP風(fēng)險。利用圖2中的公式，可計算出這19個具有時間依賴性的hERG阻斷劑的恢復(fù)時間。表1列出具體19個藥物的恢復(fù)時間指數(shù)以及相對應(yīng)的各個藥物的臨床誘發(fā)TdP的幾率。不難看出恢復(fù)指數(shù)小于 25的藥物具有較大的誘發(fā)TdP的可能性，其結(jié)果和用臨床數(shù)據(jù)而得到的Hammond標(biāo)準(zhǔn)分級基本相同。所以利用以上發(fā)明可以比常規(guī)辦法更精確地預(yù)測化合物可能在臨床上誘發(fā)心律
失常的風(fēng)險。
表1
藥物名稱恢復(fù)速度Hammond 等級TdP
Disopyramide1001有
Enclomiphene100無
Sparfloxacin1004少量
Dronedarone63. 371無
Quinidine32. 551有
Olanzapine31. 545未知
Chlorpheniramine24. 865很少
Tedisamil16. 761有
Azilimide15. 231有
Thioridazine3. 71有
Ondansetron2. 87有
Sertindole0. 892有
Ketanserin0. 58有
Verapamil05很少
Droperidol0有
Haloperidol03有
Risperidone05無
Astemizole02有
domperidone04少量
權(quán)利要求
1. 一種評估藥物對hERG作用而引起的心率失常的試驗(yàn)方法，包括體外細(xì)胞模型通道分析、離體心臟組織檢測和器官水平/整體動物三個流程，其特征在于a)按常規(guī)把細(xì)胞去極化至40mV/5ms來激活hERG離子通道，然后把細(xì)胞鉗回到_50mv/ s以記錄通道的失活過程，在-50mv記錄到的最大電流即為所要記錄的hERG離子通道電流幅度；b)進(jìn)行下列電壓鉗流程試驗(yàn)，獲取藥物脫離通道的速度；該試驗(yàn)包含2段2秒的兩次去極化脈沖激化過程；脈沖將細(xì)胞去極化至20mv，兩個脈沖去極化之間，細(xì)胞被鉗回至-SOmv共1秒鐘，應(yīng)用在第一次2秒鐘的去極化中，比較不同時間的藥物阻斷程度就能估算出藥物阻斷hERG離子通道的時間依賴性，，在第二次去極化中測出150ms后的“再阻斷” 強(qiáng)度，然后將其與第一次去極化末端獲得的阻斷強(qiáng)度進(jìn)行比較，就能得到藥物脫離通道的速度；c)用IC5015(lms/IC505(l(lms 和 IC5015(lms/IC502s 來計算 500ms 和 2s 時化合物 hERG 離子通道的時間依賴性；比值越大說明它的時間依賴性越大；d)在確認(rèn)藥物在阻塞hERG離子通道試驗(yàn)中具有明顯時間依賴性的前提下，運(yùn)用I Kec;= (IC150ms-2-IC502s) / (IC150150ms-IC502s)計算出該藥物hERG阻斷劑的回復(fù)時間指數(shù)，依回復(fù)時間指數(shù)小于25的藥物確認(rèn)為具有較大誘發(fā)TdP的可能性藥物。
全文摘要
一種評估藥物對hERG作用而引起心率失常的試驗(yàn)方法，其特征在于按常規(guī)把細(xì)胞去極化激活hERG離子通道，然后把細(xì)鉗回到以記錄通道的失活過程，記錄到所要記錄的hERG離子通道電流幅度；進(jìn)行電壓鉗流程試驗(yàn)，獲取藥物脫離通道的速度；用IC50150ms/IC50500ms和IC50150ms/IC502S來計算500ms和2s時化合物hERG離子通道的時間依賴性；比值越大說明它的時間依賴性越大；在確認(rèn)藥物在阻塞hERG離子通道試驗(yàn)中具有明顯時間依賴性的前提下，運(yùn)用RRec＝(IC150ms-2-IC502S)/(IC150150ms-IC502S)計算出該藥物hERG阻斷劑的回復(fù)時間指數(shù)，依回復(fù)時間指數(shù)小于25的藥物確認(rèn)為具有較大誘發(fā)TdP的可能性藥物。
文檔編號G01N27/00GK102253084SQ20101017702
公開日2011年11月23日 申請日期2010年5月17日 優(yōu)先權(quán)日2010年5月17日
發(fā)明者張之顥 申請人:上海灝遠(yuǎn)生物醫(yī)藥科技有限公司