專利名稱：：一種檢測毛發(fā)中克侖特羅殘留量的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種毛發(fā)中克侖特羅殘留量的檢測方法，尤其涉及一種利用氘代克侖特羅為內(nèi)標(biāo)，以液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(簡稱LC-MS/MS法)定量檢測毛發(fā)中克侖特羅殘留量方法。
背景技術(shù)：
：克侖特羅(Clenbuterol)可明顯促進(jìn)動(dòng)物生長，改善動(dòng)物體內(nèi)脂肪分配增加痩肉率，故俗稱"痩肉精"。基于臨床食用動(dòng)物內(nèi)臟而導(dǎo)致的克侖特羅中毒事件的不斷發(fā)生，世界各國普遍禁止在飼料中添加克侖特羅類藥物。1997年以來我國已多次明令禁止畜牧行業(yè)使用克侖特羅，但各地中毒事件仍頻有發(fā)生，說明非法使用克侖特羅現(xiàn)象依然存在，食品安全的監(jiān)管力度尚有待加強(qiáng)。目前克侖特羅殘留量的常用測定方法包括酶聯(lián)免疫法(ELISA)、高效液相色譜法(HPLC)、毛細(xì)管電泳法(CE)、氣相色譜-質(zhì)譜法(GC-MS)和液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(LC-MS/MS)。ELISA因操作簡便、檢測迅速、成本低廉，通常作為篩選法用于動(dòng)物組織或者尿液中的殘留篩查，其缺點(diǎn)是靈敏度低，而且假陽性率高。GC-MS可用于多殘留情況下的定性、定量分析，與HPLC和CE相比，具有更高的靈敏度和特異性，因此，我國將CG—MS法定為檢測克侖特羅的確證性方法。其缺點(diǎn)是樣品需要衍生化、處理過程煩瑣、檢測時(shí)間長?？藖鎏亓_能特異地與毛發(fā)中的色素牢固結(jié)合，且殘留量大、消除緩慢、維持時(shí)間長。即使在較長的停藥期下，克侖特羅在毛發(fā)中的殘留仍能被檢出。如牛在停服痩肉精(0.8JUg/kg,2次/曰，共10天)60天后，從其毛發(fā)中仍能檢出痩肉精。以毛發(fā)作為檢材，較其他組織、血液和尿液等更可靠，并具有釆樣方便、非損傷性特點(diǎn)，有利于實(shí)現(xiàn)屠宰前連續(xù)動(dòng)態(tài)監(jiān)測，故毛發(fā)被認(rèn)為是檢測鹽酸克侖特羅非法使用最好的樣品。在2003年公布的地方標(biāo)準(zhǔn)DB33/T455-2003《動(dòng)物毛發(fā)中鹽酸克侖特羅的檢測方法》中，釆用乙酸乙酯液-液萃取和固相萃取相結(jié)合的方法，提取毛發(fā)堿水解液中的克侖特羅后供酶聯(lián)免疫和氣質(zhì)聯(lián)用(GC-MS)測定，檢測限為8.0ng/g。該方法的檢測的靈敏度和專一性有限，樣品預(yù)處理過程煩瑣費(fèi)時(shí)(僅固相萃取就約需要2個(gè)小時(shí))，可操作性較差，難以應(yīng)對大批量的毛發(fā)樣品監(jiān)測任務(wù)。LC-MS/MS法兼有液相色譜良好的分離能力和串聯(lián)質(zhì)譜靈敏特異的檢測能力，是近年來迅速發(fā)展的檢測技術(shù)，但在毛發(fā)樣品中檢測克侖特羅殘留量未見報(bào)道?，F(xiàn)有克侖特羅檢測技術(shù)大多存在釆樣不便、樣品處理過程復(fù)雜、樣品處理成本較高、檢測靈敏度和特異性低等不足，限制了克侖特羅殘留檢測在我國食品安全供給保幛體系中的作用，因此研究選擇方便可靠的檢材、簡單快速的樣品前處理方法及準(zhǔn)確有效的檢測手段具有非常重要的現(xiàn)實(shí)意義。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于，鑒于當(dāng)前食品安全供給保障體系建設(shè)的迫切需求及現(xiàn)有克侖特羅檢測方法的不足，提供一種準(zhǔn)確可靠、靈敏度高,可適用于大批量毛發(fā)樣品中克侖特羅殘留量檢測的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(LC-MS/MS)。本發(fā)明的另一目的在于提供簡單快速、成本較低的毛發(fā)樣品前處理方法。為達(dá)到上述目的，釆用的技術(shù)方案是一種檢測毛發(fā)中克侖特羅殘留量的方法，其特征在于依次包括(1)毛發(fā)樣品前處理高溫堿水解、有機(jī)溶劑萃取、再用酸水反萃??；(2)以濃度為5-500ng/ml的氘代克侖特羅-D9水溶液為內(nèi)標(biāo)，以液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法檢測毛發(fā)中克侖特羅殘留量。所述毛發(fā)樣品前處理是指毛發(fā)樣品用清洗溶劑清洗，晾干，剪碎；取適量毛發(fā)，加所述內(nèi)標(biāo)溶液，再加入堿溶液在高溫下使毛發(fā)水解，然后加入固體鹽鹽析和有機(jī)溶劑旋渦混合提取，離心分層，取有機(jī)層用酸水反萃取，再離心分層后，取水層作液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法進(jìn)樣樣品。所述毛發(fā)清洗劑是水和甲醇、乙腈、丙酮、二氯甲烷或稀鹽酸。所述水解用堿溶液是氫氧化鈉、或氫氧化鉀、或氨水，濃度為0.5-5mol/L,水解溫度為60-100°C，加熱2min-lh。所述固體鹽是Na2S04、或NaCl;所述有機(jī)溶劑是乙醚、乙酸乙酯、特丁基甲醚、二氯甲烷、氯仿中的一種；所述反萃取的酸水溶液是甲酸或乙酸，濃度為0.5-5%(v/v)。所述液相色譜法的流動(dòng)相由流動(dòng)相A和流動(dòng)相B組成，pH為1-7，流速為0.3ml/min。其中流動(dòng)相A為甲醇或乙腈，流動(dòng)相B為水，或者所述在流動(dòng)相A和流動(dòng)相B中分別添加體積濃度為0.02-0.5%的甲酸、或分別添加0.02-0.5%乙酸或分別添加0.02-0.5%三氟乙酸;分析柱釆用硅膠鍵合相填料柱，包括C18，C8，氰基、苯基等類型的分析柱，內(nèi)徑為1.0-5.0mm,長度為30-250mm;洗脫方法有等度洗脫或梯度洗脫，等度洗脫時(shí)的流動(dòng)相比例為A15-75%，B25-85%;梯度洗脫時(shí)的流動(dòng)相比例隨洗脫時(shí)間梯度變化，可根據(jù)不同類型的分析柱進(jìn)行設(shè)計(jì)和調(diào)整。對于C18柱，當(dāng)A為乙腈，B為O.1%(體積)甲酸水溶液時(shí)，可參考表l方法進(jìn)行表l梯度洗脫時(shí)流動(dòng)相A+B體積比例時(shí)間(min)A(體積％)B(體積％)015850.5158539010490104.11585所述質(zhì)譜檢測法檢測，電噴霧離子源，正離子掃描；霧化氣(GAS1):50，輔助加熱氣(GAS2):50，氣簾氣(CUR):30，碰撞氣(CAD,N2):Medium,離子源電壓(IS):5500V，離子源溫度(TEM):550°C?？藖鎏亓_的定量離子通道為277.1—202.9amu,定性離子通道為277.1—168.0和277.1—132.lamu，內(nèi)標(biāo)的離子通道為286.1—204.1amu。各離子通道的質(zhì)量范圍可±1.0amu。最后按內(nèi)標(biāo)法以峰面積或峰高法，計(jì)算克侖特羅在毛發(fā)中的殘留量。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益結(jié)果1.本發(fā)明釆用毛發(fā)作為檢材測定克侖特羅的殘留，具有簡單、快速、微量、高效的優(yōu)點(diǎn)。不但釆樣容易、保存方便、可重復(fù)取樣、非損傷性，更重要的是毛發(fā)可以不斷生長，可以動(dòng)態(tài)監(jiān)測痩肉精非法濫用的歷程，為保障食品安全提供有力的武器。2.本發(fā)明對樣品前處理方法進(jìn)行了優(yōu)化，采用高溫堿水解破壞毛發(fā)結(jié)構(gòu)的方法，大大縮短了樣品前處理的時(shí)間；毛發(fā)樣品經(jīng)有機(jī)溶劑提取后直接用酸水反萃取，無需進(jìn)一步溶劑吹干或者固相萃取等步驟，不僅使處理步驟簡化，而且減少了提取過程中溶劑的消耗量和避免使用比較昂貴的固相萃取裝置，因而明顯降低了成本。3.本發(fā)明以同位素化合物為內(nèi)標(biāo)，釆用特異性強(qiáng)、靈敏度高、檢測通量大的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法為檢測儀器。本法的克侖特羅分析測定的最低檢出限達(dá)0.01ng/g(檢測信噪比>3)，最低定量限為0.5ng/g,遠(yuǎn)低于現(xiàn)行行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)中酶聯(lián)免疫和氣質(zhì)聯(lián)用(GC-MS)的檢測限8.0ng/g。在O.5-200ng/g的濃度范圍內(nèi)，克侖特羅呈良好的線性關(guān)系(r〉0.9990)。準(zhǔn)確度為90-110%,精密度<5%,回收率>95%。故本發(fā)明具有準(zhǔn)確可靠的定性與定量檢測克侖特羅的能力，可作為大樣本的篩查或者小樣本的確證工具。圖1A圖1D為等度洗脫毛發(fā)樣品中克侖特羅和內(nèi)標(biāo)的色譜圖；樣品中克侖特羅和內(nèi)標(biāo)的色譜圖。其中A為毛發(fā)空白樣品中克侖特羅的色譜圖；B為毛發(fā)空白樣品中內(nèi)標(biāo)的色譜圖；C為最低定量限(0.5ng/g)克侖特羅色譜圖;D為最低定量限(0.5ng/g)內(nèi)標(biāo)的色譜圖。具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施方式對本發(fā)明作進(jìn)一步闡述，但并不限制本發(fā)明。一種檢測毛發(fā)中克侖特羅殘留量的方法，依次包括(1)毛發(fā)樣品前處理高溫堿水解、有機(jī)溶劑萃取、再用酸水反萃取；(2)以濃度為5-500ng/ml的氖代克侖特羅-D9水溶液為內(nèi)標(biāo)，以液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法檢測毛發(fā)中克侖特羅殘留量。實(shí)施例中所用試劑鹽酸克侖特羅(純度99.9%)來源于中國藥品生物制品檢定所；鹽酸克侖特羅-D9(內(nèi)標(biāo)，純度98%)來源于TorontoResearchChemicalInc;乙腈和甲酸來源于美國Tedia試劑公司；其他試劑為分析純，水為自制雙蒸餾水。實(shí)施例中所用儀器3200QTRAPLC-MS/MS串聯(lián)質(zhì)譜儀(美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司)，Analyst1.4.1分析軟件；島津系列液相色譜儀(曰本島津公司)，由LC-20AD液相泵、SIL-HTc自動(dòng)進(jìn)樣器和在線脫氣儀組成。實(shí)施例1豬毛樣品前處理方法將1例陰性空白豬毛和從某屠宰廠疑似喂養(yǎng)過痩肉精的生豬上收集到的3例陽性豬毛，毛發(fā)樣品分別用水和甲醇清洗，在室溫下晾干，然后剪碎至2-3mm的片段。取50mg毛發(fā)至離心管中，加25ng/ml內(nèi)標(biāo)工作液和2mol/L氫氧化鈉溶液0.5ml，旋渦混合lmin，90。C水洛加熱10min，取出，加入過量的Na2S04固體，混勻，加入2.5ml乙醚，渦旋5min，15,000xg離心10min;吸取上層有機(jī)相，加入2。/。(v/v)甲酸溶液100jal，渦旋5min，15，000xg離心10min;吸取下層水相，轉(zhuǎn)移至進(jìn)樣瓶進(jìn)樣。實(shí)施例2豬毛樣品的另一前處理方法另取實(shí)施例1中的陰性空白豬毛l例和陽性豬毛3例，分別用水和二氯甲烷清洗，在室溫下晾干，然后剪碎至2-3mm的片段。取50mg毛發(fā)至離心管中，加25ng/ml內(nèi)標(biāo)工作液和lml濃度為lmol/L氫氧化鉀溶液，旋渦混合lmin,65。C水浴加熱15min,取出，加入過量的NaCl固體，混勻，加入2ml特丁基甲醚，渦旋5min，15,000xg離心10min;吸取上層有機(jī)相，加入1005%(v/v)乙酸溶液，渦旋5min，15，000xg離心10min;吸取下層水相，轉(zhuǎn)移至進(jìn)樣瓶進(jìn)樣。實(shí)施例3豬毛樣品的又一前處理方法再另取實(shí)施例1中的陰性空白l例和陽性豬毛3例，分別用水和0.01mol/L稀鹽酸清洗，在室溫下晾干，然后剪碎至2-加m的片段。取50mg毛發(fā)至離心管中，加25ng/ml內(nèi)標(biāo)工作液5(mi，lml濃氨溶液(25-28%,v/v)，旋渦混合lmin，9(TC水洛加熱15min，取出，加入過量的Na2S04固體，混勾，加入2ml二氯甲烷，渦旋5min，15，000xg離心10min;吸取上層有機(jī)相，加入2000.5%(v/v)甲酸溶液，渦旋5min,15,OOOxg離心10min;吸取下層水相，轉(zhuǎn)移至進(jìn)樣瓶進(jìn)樣。經(jīng)實(shí)施例1、2、3三種豬毛樣品處理方法處理的樣品，用本發(fā)明液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(LC-MS/MS)等度洗脫法檢測毛發(fā)樣品的克侖特羅殘留量，測定結(jié)果進(jìn)行比較，并計(jì)算回收率，結(jié)果如表2所示。表2豬毛樣品不同前預(yù)處理方法的回收率實(shí)施例1的測定結(jié)實(shí)施例2的測定實(shí)施例3的測RSD(%)樣本果(ng/g)結(jié)果(ng/g)定結(jié)果(ng/g)空白0000檢樣l3.63.43.52.9檢樣25.75.55.61.8檢樣31.41.41.54.0結(jié)論釆用上述三種不同的樣品前處理方法，樣品測定結(jié)果RSD小于5%,說明本發(fā)明所述的毛發(fā)樣品前處理方法均可完全將毛發(fā)中克侖特羅提取出來，獲得穩(wěn)定可靠的結(jié)果。實(shí)施例4等度洗脫液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(LC-MS/MS)檢測毛發(fā)樣品的克侖特羅殘留量(1)貯備液用甲醇分別配制含1.0mg/ml的克侖特羅和含0.lmg/ml的克侖特羅-D9貯備液。用乙腈水為5:95(v/v)將克侖特羅貯備液稀釋成5，10，50,200，1000,2000ng/ml的標(biāo)準(zhǔn)工作液，和5,15，800,1600ng/ml質(zhì)控品工作液。用水將克侖特羅-D9貯備液稀釋成濃度為25ng/ml的內(nèi)標(biāo)工作液。上述貯備液和工作液在2-8'C保存。(2)毛發(fā)樣品配制取克侖特羅工作液，與剪碎的經(jīng)預(yù)處理的空白毛發(fā)樣品混合，配制含O.5,1，5，20,100,200ng/g克侖特羅的毛發(fā)樣品為標(biāo)準(zhǔn)曲線；同樣方法配制含O.5,1.5，80，160ng/g克侖特羅的毛發(fā)為質(zhì)控樣品。待測樣品按實(shí)施例l或2或3方法前處理方法處理后，轉(zhuǎn)移至進(jìn)樣瓶進(jìn)樣。(3)色譜條件分析柱為XBridgePhenyl(150x2.1畫，5jum,Waters);C18保護(hù)柱(4.0x3.0mm,5,，Phe畫enex)。流動(dòng)相A:含O.l%(v/v)甲酸的乙腈，流動(dòng)相B:含0.l%(v/v)甲酸的水；比例A:B為35:65，流速為0.3ml/min。(4)質(zhì)譜條件電噴霧離子源，正離子掃描；霧化氣(GASl):50，輔助加熱氣(GAS2):50，氣簾氣(CUR):30，碰撞氣(CAD，N2):Medium,離子源電壓(IS):5500V,離子源溫度(TEM):550°C。定量和定性離子對如表3所示表3.克侖特羅和內(nèi)標(biāo)的離子通道和主要的儀器參數(shù)<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>DP:去簇電壓，EP:入口電壓，CE:碰撞能量，CXP:出口電壓。(5)工作曲線記錄克侖特羅和內(nèi)標(biāo)的峰面積或峰高。釆用標(biāo)準(zhǔn)曲線法，以添加濃度為X軸，克侖特羅/內(nèi)標(biāo)的峰面積或峰高比值為Y軸，進(jìn)行線性回歸，按1/X權(quán)重得到回歸方程，計(jì)算克侖特羅在毛發(fā)中的含量。(6)準(zhǔn)確度，精密度，回收率連續(xù)3批測定4種濃度的質(zhì)控樣品，每批重復(fù)6次，計(jì)算批內(nèi)、批間精密度和準(zhǔn)確度。精密度以質(zhì)控樣品測定值的相對標(biāo)準(zhǔn)差(%RSD)表示，準(zhǔn)確度以測定值的平均值與添加濃度的百分比(％)表示。測定質(zhì)控樣品的峰面積，與未經(jīng)提取的相同濃度的樣品的峰面積比較，計(jì)算提取回收率(%)。表4克侖特羅的批內(nèi)、批間精密度和準(zhǔn)確度添加濃度批內(nèi)(n=6)批間(n=18)(ng/g)%RSD準(zhǔn)確度(%)%RSD準(zhǔn)確度(%)0.52.894.43.695.51.52.2102.42.3101,3800.799.61.399.61601.099.81.299.5表4顯示了3批質(zhì)控品的批內(nèi)、批間精密度和準(zhǔn)確度的測定結(jié)果。本方法的批內(nèi)RSD小于2.8%，批間RSD小于3.6t相應(yīng)的準(zhǔn)確度分別為94.4-102.4%和95.5—101.3%。表5毛發(fā)中克侖特羅的提取回收率回收率(測定次數(shù)克侖特羅(ng/g)內(nèi)標(biāo)(ng/g)1.58016025197.28100.2103.798.8398.71103.8298.83100.1100.998.3398.71102.6398.83102.3102.8101.8103.1103.2487.9499.89101.991.3099.82104.4597.2899.71100.998.33101.5102.6699.6199.89100.9100.398.71103.2Mean96.63100.3101.9100.5SD4.3580.97051.1823.120%RSD4.5110.96721.1603.104表5顯示，在低(1.5ng/g)、中(80ng/g)、高(160ng/g)的質(zhì)控濃度下，克侖特羅的平均回收率分別為96.6%、100.3%和101.9%,內(nèi)標(biāo)的回收率為100.5%。(7)檢測結(jié)果在上述的色質(zhì)譜分析條件下，克侖特羅和內(nèi)標(biāo)的典型保留時(shí)間為2.7min,總分析時(shí)間為3.5min，代表性色譜圖見圖1。其中空白毛發(fā)的色譜圖如圖1A所示，在克侖特羅和內(nèi)標(biāo)的出峰時(shí)間，未見內(nèi)源性干擾存在。本方法的最低定量限(LLOQ)達(dá)0.5ng/g,其色譜圖如圖1B所示，檢測信噪比(S/N)大于IO。在0.5-200ng/g的濃度范圍內(nèi)，克侖特羅呈良好的線性關(guān)系，線性相關(guān)系數(shù)r大于0.9990，3批標(biāo)準(zhǔn)曲線結(jié)果如表6所示。表6克侖特羅的線性測定結(jié)果添加濃度實(shí)測濃度(ng/g)-均值準(zhǔn)確度(W%RSD(ng/g)Run1Run2Rim30.50.460.470.460.4692.23.211.01.01.01,0100.62.055.35.15.25.2104.32.02020.620.620.820.7103.41.010099.7跳0100.3100.0100.00.3200199.5199.3198.8199.299.60.9斜率0.040.040.040.040.1截距0.000920.002080.002860.001950.99990.99990.99990.9999實(shí)施例5:梯度洗脫條件下的色譜行為釆用分析柱為CapcellC18(100x2.lmm,5j^m，Shiseido);C18保護(hù)柱(4.0x3.Omm，5jiim,Phe訓(xùn)enex)。流動(dòng)相A:含0.1%甲酸的乙腈，流動(dòng)相B:含0.1%甲酸的水；按表1所列梯度洗脫時(shí)流動(dòng)相A:B體積比例程序梯度洗脫，總分析時(shí)間為7min，流速為0.3ml/min。樣品處理和質(zhì)譜條件同實(shí)施例1。在該色譜條件下，克侖特羅和內(nèi)標(biāo)的保留時(shí)間為2.2min,色譜圖見圖2。圖1和圖2分別顯示了等度洗脫和梯度洗脫條件下，毛發(fā)樣品中克侖特羅和內(nèi)標(biāo)的色譜圖，由圖可見克侖特羅與內(nèi)標(biāo)的出峰時(shí)間，空白樣品在相應(yīng)時(shí)間無干擾。1權(quán)利要求1.一種檢測毛發(fā)中克侖特羅殘留量的方法，其特征在于依次包括(1)毛發(fā)樣品前處理高溫堿水解、有機(jī)溶劑萃取、再用酸水反萃?。?2)以濃度為5-500ng/ml的氘代克侖特羅-D9水溶液為內(nèi)標(biāo)，以液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法檢測毛發(fā)中克侖特羅殘留量。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述一種檢測毛發(fā)中克侖特羅殘留量的方法，其特征在于所述毛發(fā)樣品前處理方法是毛發(fā)樣品用清洗溶劑清洗，晾干，剪碎；取適量毛發(fā)，加所述內(nèi)標(biāo)溶液，再加入堿溶液在高溫下使毛發(fā)水解；然后加入固體鹽鹽析和有機(jī)溶劑旋渦混合提取，離心分層，取有機(jī)層用酸水反萃取，再離心分層后，取水層作液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法進(jìn)樣樣品。3.根據(jù)權(quán)利要求2所述一種檢測毛發(fā)中克侖特羅殘留量的方法，其特征在于所述毛發(fā)清洗劑是水和甲醇、乙腈、丙酮、二氯甲烷或稀鹽酸。4.根據(jù)權(quán)利要求2所述一種檢測毛發(fā)中克侖特羅殘留量的方法，其特征在于所述水解用堿溶液是氫氧化鈉、或氫氧化鉀、或氨水，濃度為0.5-5mol/L,水解溫度為60-10(TC,加熱2min-lh。5.根據(jù)權(quán)利要求2所述一種檢測毛發(fā)中克侖特羅殘留量的方法，其特征在于加入的所述固體鹽是Na2S04、或NaCl;所述有機(jī)溶劑是乙醚、乙酸乙酯、特丁基甲醚、二氯甲烷、氯仿中的一種；所述酸水反萃取中的酸是甲酸或乙酸，濃度為0.5-5%(v/v)。6.根據(jù)權(quán)利要求1所述一種檢測毛發(fā)中克侖特羅殘留量的方法，其特征在于所述液相色譜法流動(dòng)相由流動(dòng)相A和流動(dòng)相B組成，pH為1-7，流速為0.3ml/min,其中流動(dòng)相A為甲醇或乙腈，流動(dòng)相B為水，或者在所述流動(dòng)相A和流動(dòng)相B中分別添加體積濃度為0.02-0.5%的甲酸、或分別添加0.02-0.5%的乙酸，或分別添加0.02-0.5%的三氟乙酸；分析柱釆用硅膠鍵合相填料柱，包括C18，C8，氰基、苯基等類型的分析柱，內(nèi)徑為1.0-5.0mm,長度為30-250mm;洗脫方法等度洗脫或梯度洗脫，等度洗脫時(shí)的流動(dòng)相比例為A15-75%,B25-85%;梯度洗脫時(shí)的流動(dòng)相比例隨洗脫時(shí)間梯度變化。7.根據(jù)權(quán)利要求l所述一種檢測毛發(fā)中克侖特羅殘留量的方法，其特征在于所述質(zhì)譜檢測法釆用電噴霧離子源，正離子掃描，多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)進(jìn)行定量與定性分析，克侖特羅的定量離子通道為277.1—202.9謹(jǐn),定性離子通道為277.1—168.0和277.1—132.lamu,內(nèi)標(biāo)的離子通道為286.1—204.1amu，各離子通道的質(zhì)量范圍可土1.0anm,按內(nèi)標(biāo)法以峰面積或峰高法，計(jì)算克侖特羅在毛發(fā)中的含量。全文摘要一種檢測毛發(fā)中克侖特羅殘留量的方法，依次包括(1)毛發(fā)樣品前處理高溫堿水解、有機(jī)溶劑萃取、再用酸水反萃??；(2)以濃度為5-500ng/ml的氘代克侖特羅-D9水溶液為內(nèi)標(biāo)，以液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法檢測毛發(fā)中克侖特羅殘留量。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是1.采用毛發(fā)作為檢材采樣容易、保存方便、可重復(fù)取樣、具有簡單、快速、微量、高效的優(yōu)點(diǎn)。2.毛發(fā)樣品前處理方法進(jìn)行了優(yōu)化，縮短了前處理時(shí)間，簡化了處理步驟，明顯降低了成本。3.以同位素化合物為內(nèi)標(biāo)，采用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法為檢測儀器，最低檢出限達(dá)0.01ng/g，最低定量限為0.5ng/g，具有準(zhǔn)確可靠的定性與定量檢測克侖特羅的能力，可作為大樣本的篩查或者小樣本的確證工具。文檔編號(hào)G01N30/06GK101458238SQ20081004183公開日2009年6月17日申請日期2008年8月19日優(yōu)先權(quán)日2008年8月19日發(fā)明者琛余,劉罡一,張夢琪,李水軍,賈晶瑩,川陸申請人:上海市徐匯區(qū)中心醫(yī)院